Ciencias

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https://hdl.handle.net/10201/60

Bienvenido a la colección de Tesis Doctorales de Ciencias de la Universidad de Murcia. Este portal está dirigido a los investigadores y profesores de la Universidad de Murcia con la finalidad de aumentar la visibilidad de sus tesis doctorales pertenecientes al ámbito de las Ciencias

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Application of antimicrobial peptides for the control of betanodavirus in European sea bass
(Universidad de Murcia, 2024-11-22) Cervera Martínez, Laura; Cuesta Peñafiel, Alberto; Chaves Pozo, Elena; Esteban Abad, María Ángeles; Escuela Internacional de Doctorado
Esta Tesis Doctoral se centra en la caracterización de péptidos antimicrobianos (AMPs) de peces teleósteos y su implicación en la respuesta inmunitaria. Concretamente, nos planteamos evaluar la capacidad inmunomoduladora de los AMPs NK-lisina (Nkl), hepcidina (Hamp) y dicentracina (Dic) de lubina y su aplicación como agentes antivirales frente a nodavirus (NNV) en lubina. La primera fase de la experimentación fue comprobar la capacidad inmunomoduladora in vitro de dichos AMPs sintéticos, derivados de lubina, en leucocitos de riñón cefálico de dorada y lubina. Se estudió la capacidad fagocítica por citometría de flujo y el estallido respiratorio por quimioluminiscencia, sin detectar regulación por dichos AMPs. En cambio, se observó, mediante qPCR, el aumento significativo de la expresión de genes relacionados con la respuesta inmune antiviral en lubina y su descenso generalizado en dorada. Estos datos apuntaron a la idoneidad de los AMPs sintéticos derivados de lubina para su uso en lubina, pero no en dorada, indicando una especificidad de especie. Tras esto, se estudió la posible función y aplicación de estos AMPs en lubina mediante estudios in vivo. Al administrarlos en forma de plásmidos de expresión, estos se transcribieron en el músculo y aumentaron los niveles de dichasproteínas y la capacidad microbicida. Además, indujeron la expresión de marcadores proinflamatorios, aunque no consiguieron mejorar la supervivencia frente a infecciones con NNV. El siguiente paso fue testar los AMPs sintéticos Hamp y Dic in vivo en lubina ya que Nkl había sido previamente evaluada con resultados excelentes. Se comenzó analizando su potencial como inmunomoduladores, demostrándose una reducción en la expresión de marcadores proinflamatorios y un aumento de marcadores leucocitarios como neutrófilos, macrófagos y linfocitos B. Estas alteraciones se relacionan con una ventaja para el hospedador al luchar contra infecciones virales, por lo que se valoró su potencial como agente preventivo frente a NNV. Los resultados fueron muy satisfactorios mejorando en ambos casos la supervivencia frente al virus en un 30%. Este aumento de la supervivencia podría ser debido a la inducción de un estado antiinflamatorio en el tejido diana del virus, el cerebro, y la sobreexpresión del complejo Cxcr3/Cxcl9, que facilita la infiltración de células clave para la resolución viral como linfocitos T, neutrófilos o macrófagos. Curiosamente, la administración terapéutica de estos AMPs sintéticos tras la infección con NNV mostraron también una mejoría en la supervivencia de las lubinas tratadas con Hamp y Dic, y una inmunomodulación similar al tratamiento previo. Sin embargo, los niveles de virus no se vieron afectados, por lo que el efecto lítico directo de los AMPs sobre las partículas virales parece no ser relevante. Por el contrario, la administración de Nkl sintética solo logró retrasar la aparición de las mortalidades, pero no evitarlas, y únicamente estimuló la respuesta citotóxica, siendo esta claramente insuficiente para evitar la mortalidad por NNV. En conclusión, los péptidos sintéticos Hamp y Dic pueden ser considerados como excelentes herramientas para el control de NNV en granjas de lubina gracias a sus funciones inmunomoduladoras, tanto administrado de forma profiláctica como terapéutica.
Open Access
Cell-mediated citotoxicity of fish leucocytes against betanodavirus
(Universidad de Murcia, 2024-10-21) García Álvarez, Miguel Ángel; Cuesta Peñafiel, Alberto; Esteban Abad, María Ángeles; Elena Chaves Pozo, Elena; Escuela Internacional de Doctorado
Los peces criados en piscifactorías están sometidos a gran estrés, afectando a su sistema inmune y haciéndolos vulnerables a enfermedades. Entre los patógenos más letales se encuentran los virus, destacando el virus de la Necrosis Nerviosa Viral (NNV), causante de la enfermedad de la encefalopatía y retinopatía viral (VER). En el Mar Mediterráneo tiene prevalencia principalmente el genotipo RGNNV, siendo capaz de infectar a la lubina y a la dorada, siendo esta última resistente a VER. Sin embargo, la aparición de genotipos recombinantes (RGNNV/SJNNV y SJNNV/RGNNV) demostró que la dorada era capaz de desarrollar la enfermedad. Entre los mecanismos que presentan los peces teleósteos contra infecciones virales, destaca la citotoxicidad mediada por células (CMC), llevadas a cabos por diferentes tipos celulares, destacando las células citotóxicas no específicas (NCCs) y células semejantes a natural killer (NK-like) en el sistema innato mientras que en sistema adaptativo es llevado a cabo por linfocitos T citotóxicos (CTLs). La dorada es capaz de montar una respuesta innata efectiva contra NNV, destacado por su CMC innata, capaz de eliminar las células infectadas, mientras que en lubinas no. Por ello, el objetivo de esta Tesis Doctoral es profundizar en la dinámica de la respuesta citotóxica mediada por leucocitos de lubina y dorada frente a NNV. Para ello, en el Capítulo I se estudió se estudió la interacción de los genotipos recombinantes de NNV en larvas de dorada de diferentes edades, evaluando la mortalidad y genes implicados en las infecciones. Los resultados mostraron que ambos genotipos podían infectar larvas de diferentes edades, con mayor patogenicidad en larvas más jóvenes. El genotipo RGNNV/SJNNV produjo mayor mortalidad debido a la alta prevalencia viral y menor activación del sistema inmune. En el Capítulo II Se caracterizó el receptor CRTAM (presente en linfocitos T de mamíferos) y su ligando CADM1 en ambas especies mediante análisis bioinformático y se evaluaron sus expresiones génicas en diferentes condiciones, incluyendo una infección por NNV. El análisis identificó un gen de crtam y dos genes de cadm1 (cadm1a y cadm1b) en ambas especies. El gen crtam se expresó principalmente en tejidos inmunes, mientras que cadm1a y cadm1b se expresaron mayormente en cerebro y piel. En lubina, crtam parece expresarse en linfocitos T y participar en la infección por NNV, mientras que en dorada se expresa en NCCs o NK-like. El Capítulo III se centra en la identificación de la perforina en lubina mediante análisis bioinformático y en el estudio de su expresión génica en diferentes condiciones, así como en una infección por NNV, además de evaluar la presencia de células productoras de perforina mediante inmunohistoquímica en una infección por NNV. Se encontraron cuatro genes diferentes de perforina, prf1.2, prf1.3, prf1.5 y prf1.9, presentando todos ellos una expresión basal en diferentes tejidos y sintetizados principalmente por linfocitos T, excepto prf1.3. Además, todos los genes, excepto prf1.3, participaron en la infección contra NNV, apoyado por la generación de células productoras de PRF1.9 en cerebro, riñón cefálico y gónada. Por último, en el Capítulo IV se evaluó la CMC adaptativa usando como células efectoras leucocitos de lubinas infectadas por NNV y como línea diana células DLB-1 (provenientes de cerebro de lubina). La citotoxicidad innata no aumentó durante la infección, pero la citotoxicidad de leucocitos de peces infectados sí aumentó en fases tardías de la infección, indicando la activación del sistema inmune adaptativo. Este aumento fue específico contra los genotipos que compartían la misma cápside viral, apoyado por una posible restricción por MHC-I. En esta citotoxicidad adaptativa, se observó un aumento en las rutas de perforina/granzima y Fas/FasL, características de los CTLs, así como un aumento de la apoptosis.
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Clove essential oil nanoencapsulated in β-cyclodextrins improves the welfare at slaughter in different farm fish species : parameters of stress and innate immune response
(Universidad de Murcia, 2020-09-08) López Cánovas, Amanda Esperanza; García Ayala, Alfonsa; Chaves-Pozo, Elena; Cabas Sánchez, Isabel; Escuela Internacional de Doctorado
El objetivo principal de esta tesis fue mejorar el bienestar de cinco especies de peces de cultivo (dorada, salmón Atlántico, tilapia del Nilo, lubina europea y trucha arcoiris) en el momento del sacrificio mediante el uso de aceite esencial de clavo nanoencapsulado en β-ciclodextrinas (CEO+β-CD). El complejo anestésico se comparó con el método de aturdimiento más utilizado en acuicultura (enfriamiento con hielo picado y agua de mar). Se estudió un rango de concentraciones de CEO+β-CD (de 5 a 60 mg/kg), temperaturas (de -8.0 a 29.0 °C), tipos de hielo (líquido y triturado) y condiciones de cultivo (experimental e industrial). Además, se estudió un manejo innovador bajo condiciones de cultivo industrial, utilizando una dosis baja de CEO+β-CD en peces que nunca habían sido anestesiados durante su ciclo productivo. Además, se comparó una dosis baja de eugenol nanoencapsulado en β-CD en agua de mar con eugenol o aceite de clavo solo. El primer objetivo fue reducir los tiempos de inducción de la anestesia durante la pérdida total de equilibrio y la pérdida de actividad refleja. En todos los peces de cultivo estudiados, el CEO+β-CD disminuyó los tiempos de inducción de anestesia, permitiendo el uso de dosis bajas de CEO en condiciones de cultivo experimental e industrial a diferentes temperaturas en mar y agua dulce. La nanoencapsulación de eugenol en β-CD también redujo los tiempos de inducción de la anestesia, en comparación con eugenol o CEO. El segundo objetivo fue determinar el nivel de estrés inducido por el complejo anestésico durante el proceso de aturdido. Para ello, se analizaron los niveles de glucosa, lactato, cortisol, pO2, pCO2, HCO3, TCO2, SO2, exceso de base y pH, tanto en plasma como en moco de la piel. También se estudió el nivel de expresión del gen RyR3 en el músculo de dorada. Se llegó a la conclusión de que el método de aturdido menos estresante para la dorada es usando 15 mg de CEO+β-CD/kg inducido en hielo picado (-0.2 °C), en agua de mar. Curiosamente, se obtuvo una conclusión similar para las muestras de dorada que nunca habían sido anestesiadas durante su ciclo productivo. Además, en todas las especies estudiadas se encontró que una dosis baja de CEO+β-CD utilizada para mantener el control o reducir la alteración metabólica inducida por la respuesta al estrés, fue suficiente para suponer que los peces no sufrirían lesiones irreversibles. Por lo tanto, 40 mg CEO+β-CD/L agua, 60 mg CEO+β-CD/L agua, 5 mg CEO+β-CD/kg hielo, 5 mg CEO+β-CD/kg hielo son las dosis óptimas que desencadenaron la respuesta al estrés más baja en el salmón Atlántico, tilapia del Nilo, lubina europea y la trucha arcoiris, respectivamente. Cuando EU+β-CD se probó en dorada, los datos sugirieron una fuerte respuesta al estrés, conduciendo a posibles alteraciones fisiológicas. El tercer objetivo fue estudiar la respuesta inmune innata inducida por el complejo anestésico durante el proceso de aturdido. Se analizó el nivel de expresión de il-1β, tfg-β y Hsp70 en el riñón cefálico de dorada. Además, varias actividades inmunes innatas (peroxidasa, bactericida, anti-proteasa y proteasa) fueron analizadas en el plasma y en el moco. Las dosis de CEO+β-CD mencionadas anteriormente para cada especie alteraron algunos parámetros inmunes innatos en el plasma y en el moco. Sin embargo, el deterioro de la respuesta inmune puede descartarse ya que la actividad bactericida no se vio afectada en la mayoría de las especies. La excepción fue la tilapia del Nilo, en la que observamos un efecto de inmunodepresión a la dosis óptima de CEO+β-CD. Las muestras de dorada tratadas con EU solo o EU+β-CD mostraron inmunosupresión, lo que no se observó en muestras tratadas con CEO solo o CEO+β-CD.
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Desarrollo de piensos formulados y requerimientos nutritivos del pulpo de roca (octopus vulgaris).
(2013-07-01) Sánchez Morillo-Velarde, Mª Piedad; Cerezo Valverde, Jesús; García García, Benjamín; Facultad de Biología
Objetivos: - Analizar las variaciones en la composición lipídica y el contenido de carbohidratos del músculo y de la glándula digestiva de O. vulgaris durante un periodo corto de ayuno, como aproximación a sus requerimientos nutricionales. - Conocer la aceptabilidad y crecimiento de O. vulgaris alimentado con dietas formuladas con diferentes ingredientes de origen vegetal y animal. - Elaborar piensos formulados en base a los resultados previos de aceptabilidad y comprobar su rendimiento en O. vulgaris mediante ensayos de engorde y digestibilidad. - Estimar los requerimientos lipídicos de O. vulgaris después de suministrar dietas con distinto contenido en aceite de pescado, comprobando los cambios que se producen en el crecimiento, aprovechamiento nutritivo y digestibilidad de la dieta. - Determinar la composición nutricional de O. vulgaris después de suministrar dietas formuladas con distinto contenido en aceite de pescado. - Estudiar los cambios que se producen en el crecimiento, composición nutricional, aprovechamiento nutritivo y digestibilidad de la dieta de O. vulgaris después de suministrar dietas formuladas que incluyen carbohidratos simples o complejos. Metodología: -Ensayos de ayuno: Se configuraron 5 grupos experimentales (n = 4). Cuatro grupos se sacrificaron a los días 1, 2, 4 y 8 después de suministrar la última comida y un grupo control fue alimentado durante los 8 días de duración del experimento. El día del sacrificio los animales se diseccionaron separando el tejido muscular y la glándula digestiva. Se determino el contenido de carbohidratos, los lípidos totales, y las clases lipídicas mediante HPTLC. -Aceptabilidad de ingredientes: Se prepararon diferentes dietas formuladas con un ingrediente a testar (30%), gelatina como aglomerante (20%), y agua (50%). Los ingredientes de la dieta se mezclaron al Baño María a 45ºC y se dejaron enfriar a 4ºC. Se utilizaron grupos experimentales de entre 6 y 8 individuos (887,0 ± 274,2 g) y se le suministró la dieta entre 3 y 15 días. Se calcularon las tasas de alimentación y crecimiento y el índice de eficacia alimentaria de cada dieta. -Ensayos de engorde: Se probaron 8 piensos diferentes elaborados con ingredientes secos o liofilizados. La duración de los ensayos fue de 42 a 56 días con ejemplares subadultos (700-800 g) mantenidos a 18ºC en recirculación con control de la temperatura. Se realizaron análisis de composición corporal (humedad, proteína, grasa, cenizas y MELN) de los animales, las heces y en las dietas suministradas. Con los datos obtenidos se calcularon las tasas de alimentación, crecimiento y digestibilidad. Resultados y Conclusiones En los animales sometidos a un periodo de ayuno se detectó un aumento en los monoglicéridos y el colesterol en el músculo y se movilizó un promedio de 0,23 g de lípidos por día de ayuno, principalmente ácidos grasos libres, ésteres de esterol y triglicéridos procedentes de la glándula digestiva. Los lípidos contribuyeron con un 26% y los carbohidratos con un 9,9% al gasto energético diario durante el ayuno en el pulpo de roca. Los piensos elaborados con liofilizados de pescado y la yema de huevo en polvo ofrecieron los mejores resultados, con tasas de alimentación y crecimiento similares a las obtenidas para dietas naturales a base de pescado. Las dietas artificiales semihúmedas basadas en una mezcla de ingredientes secos o liofilizados, que emplearon pota (T. sagittatus) como ingrediente principal, mostraron buenas tasas de alimentación, crecimiento, aprovechamiento nutritivo y digestibilidad, igualando o superando las dietas naturales a base de pescado. Se sugieren tasas óptimas de ingesta de lípidos para el pulpo en torno a 1 g al día, con porcentajes apropiados de grasa para dietas formuladas entre el 13-14% en sustancia seca, aunque estos porcentajes pueden variar en futuros estudios según las proporciones de lípidos polares y neutros de la dieta. La dieta mejor aceptada incluía almidón al 5%, aunque los mejores índices de aprovechamiento nutritivo se observaron en la dieta con glucosa al 5%, destacando un PPV del 72% e índices de conversión inferiores a 1. Aims: - To analyse the variations in lipid composition and carbohydrates content of muscle and digestive gland of O. vulgaris during short-term starvation as approximation to its nutritional requirements. - To determine the acceptability and growth of O. vulgaris fed formulated diets with different ingredients of vegetal and animal origin. - To prepare formulated diets based on the previous results of acceptability and check its efficiencies on O. vulgaris by means of ongrowing and digestibility experiments. - To estimate the lipid requirements of O. vulgaris after supplying diets with different content in fish oil, comparing the changes that take place in the growth, feed efficiency and digestibility of diet. - To determine the proximate and lipid classes composition of O. vulgaris after supplying formulated diets with different content in fish oil. - To study the changes that produce in the growth, nutritional composition, feed efficiency and digestibility of diet in O. vulgaris after supplying formulated diets including simple or complexes carbohydrates. Methodology: -Experiment of starvation: We configured 5 experimental groups (N = 4). Four groups were sacrificed 1, 2, 4 and 8 days after the last meal and a group control was fed throughout the 8 day experimental period. The day of the sacrifice the animals were dissected separating the muscular and the digestive gland. We determined the content of carbohydrates, total lipids, and lipid classes by means of HPTLC. -Acceptability of ingredients: We prepared different formulated diets with an ingredient to test (30%), gelatine as binder (20%) and water (50%). The ingredients of the diet were mixed at 45ºC and cool to 4 ºC. Each diet was tested in experimental groups of between 6 and 8 individuals (887.0 ± 274. g) during a period between 3 and 15 days. The feeding and growth rates and feed efficiency indices of each diet were calculated. -Ongrowing experiments: Eight different formulated diets including dry or freeze-dried ingredients were tested. The length of the experiments was of 42 to 56 days with subadults (700-800 g) kept to 18ºC in a recirculation seawater system with control of the temperature. The proximate composition (moisture, protein, lipid, ash and MELN) of the animals, the faeces and the diets supplied were analysed. The feeding and growth rates and digestibility were calculated with the data obtained. Results and Conclusions In the animals subjected to a starvation period detected an increase in the monoacylglycerols and the cholesterol in the muscle and 0.23 g of lipids by day of starvation, mainly free fatty acids, steryl esters and triacylglycerols were mobilized from the digestive gland. The lipids contributed with 26% and the carbohydrates with a 9.9 % of the energy costs of the animals during starvation in octopus. The elaborated diet based on freeze-dried fish and egg yolk powder offered the best results, with feeding and growth rates similar to the obtained for natural diets based on fish. The semi-moist formulated diets based on a mixture of dried or freeze-dried ingredients, composed of squid (T. sagittatus) as the main ingredient, showed good feeding and growth rates, feed efficiency and digestibility, similar or surpassing the natural diets based on fish. We propose optimal lipid feeding rates of around 1 g day-1, with appropriate percentages of lipid for formulated diets between the 13-14% dry matter, although these percentages can vary in future studies according to the proportions of polar and neutral lipids of the diet. The best acceptability was detected in the diet formulated with 5% of starch, although the best feed efficiency was observed in the diet with 5% of glucose, highlighting a productive protein value of 72% and a food conversion ratio lower than 1.
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Effects of environmental cycles (light and temperature) on daily rhythms and its application to fish aquaculture
(Universidad de Murcia, 2024-12-18) Conti, Francesca; Sánchez-Vázquez, Francisco Javier; López-Olmeda, José Fernando; Bertolucci, Cristiano; Escuela Internacional de Doctorado
Objetivos, Metodología y Resultados: 1. Diseñar y testar una solución de registro automatizado, bajo coste y fácil manejo para estudiar las preferencias térmicas y la actividad locomotora en peces de interés comercial, tanto diurnos como nocturnos, e investigar si esta preferencia térmica diaria está impulsada o no por relojes circadianos endógenos (Capítulos Exp 1.1 y 1.2). Para ello, se mantuvo a los peces durante un periodo de 28 días en un tanque multicámara personalizado en el que se creó un gradiente térmico. Durante estos 28 días, se sometió a los peces a tres condiciones fóticas diferentes (LD, DL y DD) y se grabó en vídeo su comportamiento. El análisis de vídeo mostró que todas las especies investigadas (diurnas y nocturnas) exhibían un ritmo diario de preferencia térmica que persiste incluso en condiciones DD constante y que, por tanto, está regulado endógenamente por el reloj circadiano. 2. Evaluar la posible preferencia térmica diaria en especies de peces cueva ciegos señalando las variaciones de temperatura como un Zeitgeber factible para estos animales que han evolucionado en ambientes de condiciones constantes y si estos ritmos son endógenos o no (Capítulo Exp 1.2). La metodología aplicada ya se describió en la sección 1. Las dos especies cavernícolas analizadas mostraron un ritmo diario de preferencia térmica, pero éste no persistió en condiciones DD. 3. Delinear si los peces pueden exhibir ritmos diarios de selección de luz y determinar si estos ritmos son endógenos, se probaron diferentes longitudes de onda (blanca y roja) en el modelo experimental de pez cebra (Capítulo Exp 2.1). Para ello, los peces fueron libres de elegir un compartimento (iluminado u oscuro) durante un periodo de 7 días, tras la aclimatación, probando tanto la luz blanca como la roja. Bajo la condición de luz blanca, los peces exhibieron un ritmo endógeno circadiano significativo, eligiendo el compartimento iluminado durante las horas subjetivas del día y el compartimento oscuro durante las horas subjetivas de la noche. 4. Determinar y caracterizar la sincronización fótica a largo plazo de la actividad locomotora y la ritmicidad circadiana endógena en el tetra ciego Mexicano e investigar una posible expresión relativa diaria de genes seleccionados de opsinas no visuales en el cerebro de esta especie (Capítulo Exp 2.2). Se registró la actividad locomotora de los peces a largo plazo y se les mantuvo en diferentes condiciones fóticas (LD, cambio de 6 horas de LD, DD y LLdim). Se tomaron muestras del cerebro de los peces durante 24 horas (cada 4 horas) y posteriormente se procesaron (extracción de ARN y retrotranscripción de ADNc) para estudiar la expresión génica de las opsinas no visuales mediante qPCR en tiempo real. Astyanax mexicanus mostró una significativa sincronización fótica diaria de la actividad locomotora. La persistencia de este ritmo en DD y LLdim confirma su naturaleza endógena y que está controlado por el reloj circadiano. 3 de 6 genes de opsinas no visuales mostraron un ritmo diario de expresión. 5. Describir los posibles efectos en la fisiología de los peces de las dietas con ingredientes emergentes, centrándose en los mecanismos centrales que regulan la ingesta de alimentos en la tilapia del Nilo y la dorada (Capítulo Exp 3). Se alimentó a los peces con tres dietas diferentes (una de control y dos experimentales que contenían ingredientes alternativos al aceite y la harina de pescado) durante 60 días. Al final del ensayo, se tomaron muestras de los cerebros y se procesaron posteriormente para estudiar la expresión de los genes cerebrales de control de la ingesta de alimentos. La tilapia del Nilo aceptó negativamente una dieta experimental (con altos niveles de inclusión de espirulina y quinoa) mientras que la dorada aceptó positivamente las tres dietas probadas. 6. Determinar una posible aplicación de los tratamientos con extractos de microalgas en la cría de peces en cautividad, investigando in vitro la proliferación celular y la actividad migratoria del pez cebra, implicadas en el proceso de cicatrización, y ensayar si estos tratamientos pueden ser dependientes del tiempo (día o noche) en el proceso de cicatrización (Capítulo Exp 4). Para ello, se realizó la técnica de cicatrización de heridas en una línea celular de fibroblastos de aleta caudal de pez cebra y se ensayó un extracto de microalgas (diferentes diluciones y durante diferentes tiempos). La herida tratada durante 30 minutos con una dosis de 1:32 se cerró significativamente antes.
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Influence of light and temperature on the rhythms of reproduction, thermotolerance and behavior of zebrafish (Danio rerio) and Nile tilapia (Oreochromis niloticus) [Recurso electrónico] : effect of light spectrum and daily thermocycles
(Universidad de Murcia, 2023-03-07) Alba Costa, Gonzalo de; Francisco Javier Sánchez Vázquez; José Fernando López Olmeda; Evaristo Mañanós Sánchez; Escuela Internacional de Doctorado
El objetivo de esta tesis doctoral fue dilucidar la influencia de la luz y la temperatura en diferentes procesos fisiológicos del pez cebra y la tilapia del Nilo: reproducción, desarrollo, termotolerancia y comportamiento. Para ello se diseñaron los siguientes objetivos específicos: 1) Resumir la interacción entre los componentes genéticos y ambientales que determinan el sexo de la tilapia del Nilo y describir la dinámica de las etapas y mecanismos endocrinos que componen su diferenciación sexual; 2) Revisar el papel de los factores ambientales, fisiológicos y neuroendocrinos en la fisiología reproductiva de la tilapia. 3) Investigar los efectos combinados de los regímenes de temperatura (termociclo versus temperatura constante) durante el desarrollo temprano y un choque térmico posterior durante el período de diferenciación sexual de la tilapia del Nilo. 4) Determinar la influencia de la hora del día del tratamiento térmico en la diferenciación sexual y la tolerancia térmica en la tilapia del Nilo. 5) Investigar el efecto de dos regímenes de temperatura de cría (termociclo frente a temperatura constante) y la hora del día en los ritmos de detección térmica y mecanismos de tolerancia. 6) Investigar el efecto combinado de los termociclos diarios y el espectro de luz durante el desarrollo temprano en el pez cebra y comprender qué mecanismos impulsan la mejora bajo la luz azul y los termociclos y los efectos nocivos de las longitudes de onda rojas. 7) Determinar la existencia de ritmos diarios de preferencia térmica en pez cebra y tilapia del Nilo. 8) Evaluar el efecto de la luz y la hora de alimentación/ayuno en el ritmo diario de preferencia térmica en la tilapia del Nilo. Así, obtuvimos los siguientes resultados y conclusiones de esta tesis doctoral: 1) La conservación genética de la determinación del sexo y la fisiología del sistema reproductivo de la tilapia está influenciada por factores ambientales, fisiológicos y neuroendocrinos. 2) La implementación de termociclos desde etapas tempranas del desarrollo favorece la diferenciación ovárica y, en consecuencia, una mayor proporción de hembras, así como reduce la sensibilidad al efecto masculinizante del tratamiento térmico. 3) Las larvas expuestas al tratamiento térmico por la noche o durante ambas fases del ciclo luz-oscuridad mostraron mayor sensibilidad a los tratamientos masculinizantes de altas temperaturas. 4) La aclimatación a los termociclos durante el desarrollo redujo la inducción de la expresión del choque térmico durante el día y la mortalidad de las larvas, lo que sugiere un efecto positivo de los termociclos frente a la temperatura constante en la tolerancia térmica del pez cebra. 5) Los efectos combinados de las longitudes de onda más cortas y los termociclos influyeron positivamente en la tasa de supervivencia, crecimiento y alimentación mientras que la luz roja desencadenó efectos mortales en los peces. 6) Tanto el pez cebra como la tilapia del Nilo exhibieron ritmos diarios específicos en la preferencia de temperatura. Durante el período de aclimatación, la tilapia presentó una respuesta de hipertermia inducida por estrés. 7) La luz es un poderoso sincronizador del ritmo diario de las preferencias de temperatura. La persistencia del ritmo en la oscuridad constante indicaba la existencia de un marcapasos endógeno. Cuando se fijó la hora de la comida, los peces exhibieron un fenómeno compensatorio antes de una respuesta de termotaxis posterior a la alimentación. El ayuno prolongado provocó la selección de temperaturas por debajo del óptimo térmico.
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Mechanisms involved in the inflammatory process of gilthead seabream (Sparus aurata)
(Universidad de Murcia, 2022-06-20) Campos-Sánchez, José Carlos; Esteban Abad, María Ángeles; Guardiola Abellán, Francisco Antonio; Escuela Internacional de Doctorado
La inflamación es una respuesta inespecífica desencadenada por el sistema inmunitario innato frente a cualquier estímulo de diversa etiología para defender el organismo, en este caso el de peces, y devolverlo a la homeostasis inicial. La inflamación presenta una serie de síntomas muy característicos y por los que puede ser fácilmente identificable cuyo conjunto recibe el nombre de “Signos cardinales de la inflamación”, y se pueden diferenciar dos tipos de inflamación: i) la inflamación aguda, o respuesta inmediata, la cual puede desarrollarse de forma breve ante la detección del estímulo inicial, y durar días o semanas hasta su final resolución; y ii) la inflamación crónica, producida ante la ineficacia de los mecanismos defensivos para resolver la inflamación aguda y cuyos efectos están altamente relacionados con la aparición de enfermedades crónicas . La inflamación es un evento muy común que ocurre en acuicultura debido a las intensas condiciones de producción a los que son sometidos los peces para cubrir las demandas del mercado. Este escenario hace a los animales más susceptibles a heridas, traumatismos e infecciones por patógenos, lo que podría estar relacionado con la aparición de enfermedades asociadas, que muchas veces se traducen en pérdidas económicas para el propio sector. La inflamación supone un mecanismo esencial para devolver a los peces a su estado inicial de salud, ya que participa de forma directa en la reparación del tejido dañado. No obstante, hasta la fecha no se ha desarrollado ningún modelo inflamatorio en peces que permita profundizar en sus mecanismos de inflamación y salud de manera adecuada. La presente Tesis Doctoral pretende mejorar el conocimiento sobre el proceso de inflamación de la dorada (Sparus aurata), una de las especies de interés en acuicultura más importantes del Mar Mediterráneo. Para alcanzar nuestro objetivo dividimos esta Tesis Doctoral en tres capítulos. En el Capítulo I se evaluaron los efectos sistémicos provocados por una inyección de carragenina. Los peces fueron inyectados intramuscularmente con PBS (control) o carragenina (1%) y tras 1,5, 3 y 6 horas se tomaron muestras de moco de la piel, suero, riñón cefálico e hígado para determinar el estado inmunológico y antioxidante en la dorada. Los resultados evidenciaron que una inyección intramuscular de carragenina al 1% es suficiente para provocar inflamación en los ejemplares, provocando además un aumento de actividades inmunitarias humorales en el moco de la piel a las 3 horas de la inyección. Sin embargo, la inyección de carragenina no tuvo repercusiones en la inmunidad sistémica de la dorada. Además, aunque se observó una disminución de la actividad de la catalasa en el hígado a las 3 y 6 horas después de la inyección, no se detectaron variaciones significativas en la expresión de ninguno de los genes estudiados en el hígado, evidenciando que este órgano no se vio afectado por la inyección de carragenina. El Capítulo II de esta Tesis Doctoral consistió en el estudio de los efectos locales desencadenados por la carragenina en el lugar de la inyección. Así, los animales fueron inyectados intramuscularmente con PBS (control) o carragenina, tomando muestras de piel para el estudio histológico e inmunohistoquímico y para el análisis de la expresión génica a 1,5, 3 y 6 horas después de la inyección. Los resultados evidenciaron un aumento en el número de células mucosecretoras de la piel y de granulocitos acidófilos en la piel a las 1,5 y 3 horas después de la inyección, respectivamente. Considerando los resultados obtenidos, se diseñó otro ensayo donde los peces fueron inyectados intramuscularmente con PBS (control) o con carragenina, y la zona de inyección fue evaluada mediante ecografía en tiempo real y micro-CT a las 1,5, 3, 6, 12 y 24 horas después de la inyección. Los resultados evidenciaron los síntomas típicos de la fascitis necrosante humana (aumento del grosor de la piel, edema y enfisema) en el músculo subyacente de los animales inyectados a las 1,5, 3 y 6 horas, los cuales se redujeron hasta desaparecer a las 12-24 horas de la administración de la carragenina. Esta sintomatología parece deberse a las moléculas liberadas en el sitio de la inflamación y a la posible degradación de la carragenina en dicho lugar, lo que apuntaria en ultimo lugar a las etapas finales de la respuesta inflamatoria. En el Capítulo III de la presente Tesis Doctoral se incluyeron los resultados obtenidos del análisis génico de la respuesta inflamatoria provocada por la carragenina en la dorada. Para ello, la expresión de 40 genes relacionados con la inflamación se evaluó in vivo en dos ensayos que se llevaron a cabo por separado. En el primer experimento, los especímenes de dorada fueron inyectados con PBS (control) o carragenina por vía intramuscular, y después de 1,5, 3 y 6 horas se recolectaron las muestras de piel del área inyectada y se procesaron para evaluar la expresión génica. En el segundo ensayo se replicó el mismo diseño experimental, pero aumentando el tiempo de muestreo a 12 y 24 horas. El incremento de marcadores celulares y la expresión de genes pro-inflamatorios, así como la disminución de genes anti-inflamatorios en el intervalo de 1,5 a 6 horas después de la inyección, indicaron la duración de la inducción de la respuesta inflamatoria provocada por la carragenina. No obstante, los resultados obtenidos a las 12 y 24 horas después de la inyección parecieron indicar la activación de mecanismos necesarios para terminar la respuesta inflamatoria inducida por la carragenina, restaurando la homeostasis de la piel. Estos resultados fueron respaldados por un ensayo in silico en el que se estudió la conservación filogenética de las 40 moléculas previamente estudiadas por expresión génica a partir de secuencias de proteínas de dorada en comparación con otras secuencias proteicas de teleósteos, presentando las proteínas de la corvina amarilla (Larimichthys crocea L.) los mayores porcentajes de identidad con las secuencias proteicas de la dorada. Además, las proteínas de la inflamación más conservadas fueron aquellas implicadas en su regulación, hecho que apoya la hipótesis de que los mecanismos génicos reguladores podrían activarse 24 horas después de la inyección de la carragenina para controlar la respuesta inflamatoria. Finalmente, todos los hallazgos de esta Tesis Doctoral evidencian que una sola inyección de carragenina al 1% puede ser utilizada para desencadenar una inflamación local en doradas, lo que constituye un modelo para continuar estudiando este proceso, tanto en la salud como en la enfermedad en esta especie.
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Novel fish feeds : trade-offs between sustainability, performance and robustness
(Universidad de Murcia, 2024-12-03) Canhoto Pinheiro Mendes, Rodrigo; Castanheira da Conceição, Luís Eugénio; Sánchez-Vázquez, Francisco Javier; Dias Engrola, Sofia Alexandra; Escuela Internacional de Doctorado
Para satisfacer las crecientes necesidades de proteínas animales de la población mundial en auge y permitir un desarrollo sostenible a nivel social, económico y ambiental, la acuicultura debe formular piensos con ingredientes alternativos que puedan reducir la huella ambiental de los mismos, garantizando al mismo tiempo el rendimiento y la robustez de los organismos cultivados. Esta Tesis Doctoral tuvo como objetivo desarrollar una serie de piensos para peces basados en marcos de ecoeficiencia, economía circular u orgánica, que incluyan ingredientes no tradicionales, como plantas (por ejemplo, girasol, quinua, colza, altramuces), subproductos de animales terrestres (por ejemplo, harinas de sangre, plumas y aves de corral), subproductos del mar (por ejemplo, concentrado de proteína de pescado, aceite de salmón), harinas de insectos (por ejemplo, mosca soldado negra, Hermetia illucens o gusano de la harina, Tenebrio molitor) y microorganismos unicelulares (por ejemplo, bacterias, cianobacterias, microalgas y levaduras). Se investigó el potencial de calentamiento global, la digestibilidad, la aceptación y los efectos (por ejemplo, sobre la ingesta de alimento, la utilización del pienso, el rendimiento, la salud intestinal, la condición inmunológica y el estado oxidativo) de estos piensos innovadores, utilizando dos especies acuícolas de relevancia comercial, tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) y dorada (Sparus aurata), a través de ensayos de alimentación autónoma y de crecimiento a largo plazo. Con este fin, se propusieron los siguientes objetivos y metodologías: 1) Formular una nueva generación de piensos para peces orgánicos o ecoeficientes que se alineen con las demandas sociales y reduzcan el uso de ingredientes tradicionales (por ejemplo, recursos marinos y soja). 2) Investigar el comportamiento alimentario y las preferencias alimenticias de la tilapia del Nilo y la dorada para las dietas mencionadas, utilizando la metodología de auto-selección (comedores automáticos). 3) Evaluar la digestibilidad de estas dietas novedosas y cómo afectan a los indicadores clave de rendimiento (por ejemplo, ganancia de peso, tasa de conversión alimenticia, ingesta de alimento), la robustez de los peces (por ejemplo, salud intestinal, condición inmunológica y estado oxidativo) y la utilización del alimento (composición corporal total, tasas de retención) en juveniles de tilapia del Nilo y dorada, a través de estudios experimentales a largo plazo. 4) Evaluar el potencial de calentamiento global (GWP) de los piensos novedosos mediante una evaluación del ciclo de vida (LCA) con asignación económica. En conjunto, esta Tesis Doctoral arrojó luz sobre la nutrición, el comportamiento alimentario, la fisiología, la salud y la huella de carbono de los piensos en la acuicultura, logrando las siguientes conclusiones: . La tilapia del Nilo mostró la capacidad de auto-seleccionar una dieta, expresando su comportamiento alimentario. Por lo tanto, los experimentos de auto-selección pueden considerarse como una herramienta útil para la evaluación inicial de nuevos ingredientes en piensos acuícolas. 2. Las formulaciones de piensos socialmente aceptables indujeron efectos extremos sobre la ingesta voluntaria de alimento en tilapia del Nilo, debido a una reducción en la palatabilidad, lo que resultó en una pobre utilización del pienso. No obstante, la digestibilidad de la dieta fue alta y el impacto solo se observó en el rendimiento de los peces, pero no en su robustez. 3. En el caso de la dorada, los piensos orgánicos y basados en la economía circular fueron fácilmente digeribles y eficientemente utilizados por los peces, asegurando un buen rendimiento y robustez, incluso después de un evento crónico de estrés. 4. Los piensos orgánicos y basados en la economía circular para tilapia, así como los piensos orgánicos para dorada, presentaron el mayor PCG. Sin embargo, a largo plazo, estas dietas pueden promover un mejor rendimiento a nivel de sistema.
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Ritmos diarios de reproducción, desarrollo temprano y metabolismo lipídico en peces teleósteos : influencia de los ciclos de luz y de alimentación
(2020-01-13) Paredes Salas, Juan Fernando; Sánchez Vázquez, Francisco Javier; López-Olmeda; Muñoz-Cueto, José Antonio; Escuela Internacional de Doctorado
La presente tesis doctoral revela la existencia de una progresión armoniosa ambientalmente sincronizada en ambos sexos de toda la maquinaria neuroendocrina que controla la reproducción: desde la activación del eje BPG, gametogénesis, desove para concluir con la fertilización del huevo. En el capítulo 1-2 encontramos ritmos en el eje cerebro-pituitario-gonadal (BPG) y la influencia de la luz y la temperatura en la activación / inhibición de este eje de reproducción neuroendocrino. En el capítulo 3, revelamos por primera vez los ritmos de fertilización in vitro que pueden ayudar a mejorar los protocolos de fertilización al considerar la hora del día para obtener las mejores tasas de fertilización de acuerdo con una regulación génica arriba / abajo del ovocito. En el capítulo 4, revelamos ritmos diarios en el mecanismo por el cual los factores ambientales se transducen en una respuesta fisiológica en las gónadas: mecanismos epigenéticos de metilación y desmetilación. En el capítulo 5-6, informamos la importancia del tiempo de luz / alimentación en los ritmos de metabolismo de los lípidos, que pueden actuar como factores críticos que influyen en la reproducción. Finalmente, en el capítulo 7, revisamos la influencia de los ciclos de luz y temperatura en el crecimiento, el desarrollo, la maduración sexual, la reproducción y los tiempos de eclosión. El objetivo general de esta tesis doctoral fue dilucidar el impacto de las señales de tiempo, como la luz, la temperatura y el tiempo de las comidas, en la sincronización de los ritmos diarios de reproducción en los peces, considerando la producción de gametos, la fertilización, el desarrollo de embriones / larvas y el metabolismo de los lípidos. Sobre esta base, destacamos la importancia de los ritmos biológicos en el establecimiento de la progresión armoniosa de los procesos reproductivos y de desarrollo temprano, incluida la activación del eje Brain-Pituitary-Gonad (BPG), las variaciones diarias de los gametos, las tasas de fertilización in vitro, los ritmos del mecanismo epigenético de las gónadas. y variaciones genéticas lipídicas en el hígado. Los objetivos específicos siguen: Revela la existencia de ritmos diarios en la expresión de genes clave en el eje BPG-hígado del pez cebra. Investigue la influencia de las variaciones estacionales (luz y temperatura) como condiciones reproductivas favorables o inhibitorias en genes clave involucrados en el eje BPG de medaka. Describa los ritmos diarios de fertilización in vitro en el pez cebra para mejorar los protocolos considerando las variaciones diarias de los gametos. Busque mecanismos de conversación cruzada que transduzcan factores ambientales en respuestas fisiológicas observando los ritmos diarios en el mecanismo epigenético de metilación y desmetilación en las gónadas del pez cebra. Evaluar los ritmos diarios en la expresión de genes metabólicos lipídicos en respuesta a los ciclos de luz y oscuridad y alimentación en dorada y en el hígado de pez cebra. Resuma las claves ambientales clave como los ciclos de luz y temperatura durante el desarrollo temprano de la solea de Senegal. Obtuvimos las conclusiones de barbecho 1. Tanto en el pez cebra hembra como en el macho, casi todos los genes clave involucrados en el eje BPG-hígado muestran ritmos diarios. Esos genes siguen una progresión de línea de tiempo armoniosa durante el período reproductivo, lo que garantiza que la ventana de desove y la fertilización se producen coincidiendo con condiciones favorables para la máxima supervivencia de la descendencia. 2. En Medaka, las variaciones estacionales (fotoperíodo largo / corto y temperatura alta / baja) alteraron los ritmos diarios en genes reproductivos clave en el eje BPG. La mayoría de las hembras bajo fotoperíodo largo / temperatura alta (condiciones de verano) exhibieron un patrón genético rítmico diario, mientras que aquellas bajo fotoperíodo corto / temperatura baja (condiciones de invierno) no presentaron ritmos significativos. 3. La fertilización in vitro muestra un fuerte ritmo diario en el pez cebra determinado por la fase diaria de los ovocitos. Las tasas máximas de fertilización ocurren alrededor de las luces encendidas, y la ritmicidad circadiana persistió bajo una oscuridad constante. El análisis de ovocitos de transcriptoma en diferentes momentos del día reveló genes expresados diferencialmente (DEG) agrupados en familias relacionadas con la reproducción que pueden explicar las variaciones diarias en las tasas de fertilización. 4. Los mecanismos epigenéticos (metilación y desmetilación del ADN) muestran ritmos diarios de expresión sincronizados con el ciclo claro / oscuro en las gónadas de pez cebra. En la oscuridad constante, dicha ritmicidad persistió durante dos días consecutivos, lo que sugiere su control endógeno. 5. El metabolismo de los lípidos tanto en el pez cebra como en el hígado de dorada muestra ritmos diarios fuertemente sincronizados con el ciclo claro / oscuro, independientemente del tiempo de alimentación. Los genes de lipogénesis presentaron una acrofase diurna, mientras que los genes de lipólisis fueron nocturnos. 6. En el lenguado de Senegal, los ciclos de luz y temperatura condicionan el crecimiento, el desarrollo del saco vitelino, la metamorfosis, la supervivencia, el desarrollo de las aletas y las malformaciones de la mandíbula.
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Study of host defense peptides in gilthead seabream (Sparus aurata)
(Universidad de Murcia, 2024-12-16) Serna Duque, John Alberto; Esteban Abad, María Ángeles; Cuesta Peñafiel, Alberto; Escuela Internacional de Doctorado
La dorada (Sparus aurata) es una especie de gran relevancia comercial en la acuicultura mediterránea, sector que ha crecido exponencialmente desde la década de 1980. Sin embargo, enfrenta desafíos considerables debido a enfermedades infecciosas como la vibriosis causada por Vibrio harveyi, que afectan tanto la salud de los peces como el comercio, generando pérdidas económicas importantes. El cambio climático exacerba estos problemas al incrementar la virulencia de los patógenos y la frecuencia de enfermedades. Esta tesis doctoral explora el papel de los péptidos de defensa del huésped (HDPs), como las hepcidinas y las piscidinas, en la respuesta inmune de la dorada. Se plantea identificar y examinar nuevos genes HDP, su historia evolutiva, su expresión basal en condiciones normales y su regulación ante patógenos. El primer artículo analiza la expansión de los genes de hepcidina en la dorada, identificando quince genes en el cromosoma 17, lo que representa el mayor número encontrado en vertebrados. Este estudio utilizó análisis genómicos como los Modelos Ocultos de Markov para identificar estos genes, que exhiben perfiles específicos de expresión en diferentes tejidos y respuestas a desafíos bacterianos, mostrando una regulación compleja. La presencia de múltiples genes con funciones diversas subraya la adaptabilidad del sistema inmunológico de la dorada. El segundo artículo examina dos genes de piscidina, pisc1 y pisc2, que desempeñan roles distintos in vitro e in vivo. El gen pisc1 se expresa principalmente en el timo, sugiriendo una función en la inmunidad adaptativa, mientras que pisc2 responde de manera variable a patógenos, indicando su papel en la defensa innata. La expresión diferencial de estos genes sugiere que las piscidinas tienen funciones especializadas y sinérgicas en la respuesta a amenazas microbianas. El tercer artículo explora la relación entre los genes de hepcidina y la homeostasis del hierro. Al inducir una sobrecarga de hierro, se observaron alteraciones en las respuestas inmunitarias y la morfología hepática, como la vacuolización y la desorganización celular. Los resultados muestran una regulación compleja de los genes de hepcidina, con hamp1 regulado al alza y hamp2.4 y hamp2.5 a la baja, lo que indica un equilibrio entre el control del hierro y la defensa antimicrobiana. El cuarto artículo investiga la modulación de los genes de hepcidina y piscidina tras una infección por V. harveyi, encontrando cambios significativos en la morfología hepática y la expresión de genes en varios tejidos. El estudio reveló una disminución en la actividad bactericida en el moco de la piel, mientras se mantenía en el suero, lo que sugiere estrategias inmunológicas diferenciadas. En conclusión, esta tesis proporciona una visión completa sobre la diversidad genética y funcional de los HDPs en la dorada. La expansión de los genes y los roles especializados de las hepcidinas y piscidinas subrayan su importancia en la defensa inmunológica y la regulación del hierro. Estos hallazgos ofrecen biomarcadores potenciales para la detección temprana de enfermedades, así como para el desarrollo de programas de cría selectiva y tratamientos basados en HDPs, contribuyendo a prácticas acuícolas más sostenibles y a la prevención de la resistencia antimicrobiana. La integración de estos descubrimientos en la acuicultura podría mejorar la sostenibilidad y manejo de enfermedades en la dorada.

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