Publication: Modeling RAS-Driven Myeloid Leukemia in Zebrafish and Roles of Telomerase
Authors
Jiménez Blaya, Alba
item.page.secondaryauthor
Escuela Internacional de Doctorado
item.page.director
Mulero Méndez, Victoriano Francisco ; Cayuela Fuentes, María Luisa ; Alcaraz Pérez, Francisca
Publisher
Universidad de Murcia
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DOI
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info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Description
Abstract
Introducción
Las GTPasas RAS son moléculas centrales en la transducción de señales extracelulares hacia procesos celulares clave como la proliferación, la diferenciación y la supervivencia. Estas proteínas actúan principalmente mediante dos vías, RAF/MEK/ERK y PI3K/AKT/mTOR, que convergen en el complejo eIF4F, cuyo componente principal, eIF4E, regula la traducción de ARNm implicados en el crecimiento celular, la angiogénesis y la apoptosis. Consecuentemente, alteraciones en RAS, así como en eIF4E y sus reguladores (4E-BPs), han sido vinculadas al desarrollo de múltiples cánceres, incluyendo la leucemia mieloide aguda (LMA), una neoplasia maligna caracterizada por la proliferación clonal de células mieloides inmaduras que ocasiona fallo hematopoyético.
Un factor adicional de interés es la telomerasa, compuesta esencialmente por TERT y TERC, un complejo ribonucleoproteico que mantiene la integridad cromosómica y cuya reactivación aberrante se asocia a la oncogénesis. Más allá de su función canónica, TERT y TERC cumplen roles no teloméricos, incluyendo la regulación de la hematopoyesis y la protección frente a estrés celular.
El pez cebra (Danio rerio) se ha consolidado como un modelo experimental de gran valor en biomedicina por su homología genética con el ser humano, su transparencia embrionaria y su facilidad para la manipulación genética, entre otras características. Es especialmente útil en el estudio de hematopoyesis y cáncer, ya que comparte mecanismos reguladores con mamíferos y permite explorar funciones canónicas y no canónicas de la telomerasa en un contexto in vivo.
Objetivos
El objetivo principal de esta tesis doctoral es estudiar in vivo los mecanismos celulares y moleculares implicados en la leucemogénesis y la transformación neutrofílica inducida por HRAS y NRAS.
Metodología
Se caracterizaron dos modelos de LMA en pez cebra que expresan las proteínas oncogénicas HRAS_G12V o NRAS_Q61L en neutrófilos. Se realizaron análisis in vivo mediante microscopía confocal, ensayos de migración a herida y NETosis para evaluar la funcionalidad de neutrófilos. Se aplicaron inhibidores farmacológicos de la vía RAS/RAF/MEK/ERK para probar la reversibilidad del fenotipo leucémico.
Adicionalmente, se utilizó un análisis de scRNA-seq para caracterizar la heterogeneidad transcripcional de los neutrófilos transformados y se identificaron genes candidatos implicados en el silenciamiento oncogénico. Estos hallazgos se validaron mediante disrupción génica por CRISPR/Cas9, generación de líneas knockouts y sobreexpresión de ARNm de los genes candidatos.
Resultados y Conclusiones
La activación de HRAS o NRAS en neutrófilos es suficiente para inducir expansión mieloide, diseminación sistémica y alteraciones en las dinámicas migratorias basales. Se observó que HRAS produce cambios morfológicos más marcados, mientras que NRAS desencadena efectos más generalizados debido a su activación en etapas más tempranas de diferenciación. Ambos modelos mostraron defectos en migración a herida y liberación de NETs, reflejando una pérdida de capacidad efectora.
El tratamiento con inhibidores de la vía RAS/RAF/MEK/ERK revirtió la expansión leucémica, evidenciando la relevancia traslacional de estos modelos para cribado de terapias. Además, se demostró que la deficiencia de terc, pero no de Tert, reduce la expansión neutrofílica, subrayando un papel no canónico de TERC en la mielopoyesis y la leucemogénesis.
Se identificó además un fenómeno de silenciamiento oncogénico caracterizado por la regresión progresiva de neutrófilos transformados. Estudios de scRNAseq y análisis funcionales posteriores revelaron a Eif4ebp1 y Eif4e1c como reguladores clave de este proceso: Eif4ebp1 parece ejercer un papel dual que sosteniente la hematopoyesis basal en condiciones homeostáticas y restringe la expansión neutrofílica en leucemia, mientras que Eif4e1c parece ser un factor clave en el mantenimiento de las poblaciones de neutrófilos en ambos contextos.
En conjunto, esta tesis avanza en la comprensión de cómo el oncogén RAS impulsa la expansión de neutrófilos y alteraciones funcionales en modelos de LMA en pez cebra, y cómo los mecanismos intrínsecos de silenciamiento oncogénico limitan la progresión leucémica
Objetives The main goal of this doctoral thesis is to study in vivo the cellular and molecular mechanisms involved in leukemogenesis and neutrophil transformation induced by HRAS and NRAS. Methodology Two zebrafish AML models expressing the oncogenic proteins HRAS_G12V or NRAS_Q61L specifically in neutrophils were characterized. In vivo analyses were performed using confocal microscopy. Wound-induced migration and NETosis assays were conducted to evaluate neutrophil functionality. Pharmacological inhibitors of the RAS/RAF/MEK/ERK pathway were applied to test the reversibility of leukemic phenotypes. Additionally, scRNA-seq was used to characterize the transcriptional heterogeneity of transformed neutrophils and to identify candidate genes involved in oncogene silencing. These findings were validated through CRISPR/Cas9-mediated gene disruption, generation of knockout lines, and mRNA overexpression of candidate genes. Results and conclusions Activation of HRAS or NRAS in neutrophils was sufficient to induce myeloid expansion, systemic dissemination, and alterations in basal migratory dynamics. HRAS produced more pronounced morphological changes, whereas NRAS triggered broader effects due to its activation at earlier stages of differentiation. Both models exhibited defects in wound migration and NET release, reflecting impaired effector capacity. Treatment with RAS/RAF/MEK/ERK inhibitors reversed leukemic expansion, highlighting the translational relevance of these models for therapeutic screening. Furthermore, we demonstrated that terc, but not Tert, deficiency reduced neutrophil expansion, underscoring a non-canonical role of TERC in hematopoiesis and leukemogenesis. We also identified an oncogene silencing phenomenon characterized by progressive regression of transformed neutrophils following their inicial expansion. scRNA-seq and functional assays revealed Eif4ebp1 and Eif4e1c as key regulators of this process: Eif4ebp1 appears to play a dual role, supporting basal hematopoiesis under homeostatic conditions while restraining neutrophil expansion in leukemia, whereas Eif4e1c seems essential for the maintenance of neutrophil populations in both physiological and oncogenic contexts. Our studies collectively advance our understanding of how oncogenic RAS drives neutrophil expansion and their associated functional alterations in zebrafish AML models, and how intrinsic oncogene-silencing mechanisms constrain leukemic progression.
Objetives The main goal of this doctoral thesis is to study in vivo the cellular and molecular mechanisms involved in leukemogenesis and neutrophil transformation induced by HRAS and NRAS. Methodology Two zebrafish AML models expressing the oncogenic proteins HRAS_G12V or NRAS_Q61L specifically in neutrophils were characterized. In vivo analyses were performed using confocal microscopy. Wound-induced migration and NETosis assays were conducted to evaluate neutrophil functionality. Pharmacological inhibitors of the RAS/RAF/MEK/ERK pathway were applied to test the reversibility of leukemic phenotypes. Additionally, scRNA-seq was used to characterize the transcriptional heterogeneity of transformed neutrophils and to identify candidate genes involved in oncogene silencing. These findings were validated through CRISPR/Cas9-mediated gene disruption, generation of knockout lines, and mRNA overexpression of candidate genes. Results and conclusions Activation of HRAS or NRAS in neutrophils was sufficient to induce myeloid expansion, systemic dissemination, and alterations in basal migratory dynamics. HRAS produced more pronounced morphological changes, whereas NRAS triggered broader effects due to its activation at earlier stages of differentiation. Both models exhibited defects in wound migration and NET release, reflecting impaired effector capacity. Treatment with RAS/RAF/MEK/ERK inhibitors reversed leukemic expansion, highlighting the translational relevance of these models for therapeutic screening. Furthermore, we demonstrated that terc, but not Tert, deficiency reduced neutrophil expansion, underscoring a non-canonical role of TERC in hematopoiesis and leukemogenesis. We also identified an oncogene silencing phenomenon characterized by progressive regression of transformed neutrophils following their inicial expansion. scRNA-seq and functional assays revealed Eif4ebp1 and Eif4e1c as key regulators of this process: Eif4ebp1 appears to play a dual role, supporting basal hematopoiesis under homeostatic conditions while restraining neutrophil expansion in leukemia, whereas Eif4e1c seems essential for the maintenance of neutrophil populations in both physiological and oncogenic contexts. Our studies collectively advance our understanding of how oncogenic RAS drives neutrophil expansion and their associated functional alterations in zebrafish AML models, and how intrinsic oncogene-silencing mechanisms constrain leukemic progression.
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