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Análisis de factores peri-concepcionales que influyen en la proporción del sexo en el ratón
(2014-12-03) Laguna Barraza, Ricardo Alonso; Gutiérrez Adán, Alfonso; Facultad de Veterinaria
Introducción: La proporción de sexos está distribuida de forma equilibrada en la mayor parte de las especies, y generalmente está determinada por el sexo heterogamético. En mamíferos, los ovocitos producidos por las hembras mantienen siempre la misma carga cromosómica sexual (cromosoma “X”), y son los machos, con una dotación cromosómica distinta en sus gametos (cromosomas “X” e “Y”) los que determinan el sexo. Durante la espermatogénesis se produce igual cantidad de gametos portadores del cromosoma “X” e “Y”, por lo que la probabilidad de tener una cría macho o una cría hembra por cada evento de fecundación en especies monotocas o politocas sería del 50%. Sin embargo, los datos obtenidos por los registros en muchas especies nos muestran que no siempre la proporción de los sexos es equilibrada al 50%. En la literatura se han descrito muchos factores que podrían tener influencia directa o indirecta en el desequilibrio de la proporción de sexos. A pesar de ello, hasta la fecha se desconocen con precisión los mecanismos por los cuales se produce este fenómeno. Objetivo: La presente tesis propone analizar distintos factores y posibles mecanismos que pueden estar relacionados con la proporción de sexos. Metodología: En nuestro estudio, utilizamos un modelo ratón transgénico que posee una secuencia marcadora integrada en el cromosoma “X”, y hemos analizado en primer lugar la posible distorsión primaria y secundaria del sexo debida a la presencia del transgén. Así como la calidad embrionaria medida en número de células del blastocisto. Analizamos el efecto de la dieta durante los periodos de pre-implantación y post-implantación, tomando en consideración la lateralidad (origen ovárico o uterino). Se estudiaron las relaciones que existen entre la ovariectomía y la compensación hormonal ovárica, la proporción del sexo y la posición adoptada en el útero por cada uno de los sexos. Se analizó si existía una relación entre la velocidad de desarrollo pre-implantacional (segunda división mitótica embrionaria y posterior desarrollo a blastocisto) y la calidad y el sexo de los embriones producidos in vivo. Resultados y Discusión: En el capítulo I. Se observó que esta modificación genética, no alteraba las proporciones primaria ni secundaria de sexos, ni el número celular de embriones pre-implantacionales, y debido a ello, consideramos el factor transgénico como no determinante en la proporción de los sexos. En el capítulo II se encontraron diferencias de proporción del sexo cuando se registraron los datos del lado de procedencia (derecho o izquierdo), principalmente en estadios cercanos al momento de la fecundación, y en ratonas de menor constitución física. Estas diferencias se correlacionan con la perdida embrionaria y dejan de ser significativas cuando se observaban estas proporciones de manera global. En el capítulo III, no se encontraron diferencias en las proporciones de machos y hembras entre las hemi-ovariectomías derecha e izquierda. Sin embargo los resultados muestran una preferencia de las hembras a implantar en secciones uterinas cercanas al cérvix, siendo estas hembras de un peso inferior al resto de hembras implantadas en otras secciones del útero. Por último, en el capítulo IV, nuestros resultados no indican una diferencia de la proporción del sexo en los embriones recuperados en el paso de 2 a 3 células, ni tampoco en la velocidad de desarrollo a blastocisto. Solamente se observó una mayor proporción de hembras en los embriones que más lentamente se dividían a 3 células y posteriormente tardaban más en llegar al estadio de blastocisto. También se observó una relación entre la calidad embrionaria definida por la expresión de marcadores de pluripotencia y la velocidad de división pre-implantacional. Summary Introduction: Sex ratio is equally distributed in most species, and it is generally determined by the heterogametic sex. In mammals, oocytes produced by females always keep the same chromosomal sex (chromosome “X”); however, the males, with a different chromosome in their gametes (chromosomes “X” and “Y”)determine the sex. During spermatogenesis, equal number of gametes carrying the chromosome “X” and “Y” is produced. According to Mendelian’s genetic, the chance of breeding a male or a female pup per fertilization event in polytocous and monotocous species would be 50%. However, the data obtained in many species show that not always the sex ratio is balanced at 50%. In the literature, many factors that could have a direct or indirect influence on the imbalance of the sex ratio have been described. However, the precise mechanism by which this phenomenon occurs is still unknown. Objetive: This thesis aims to analyze various factors and possible mechanisms that may be related to the sex ratio. Methods: In our study, we used a transgenic mouse model that presents a marker sequence integrated in the “X” chromosome, and we first analyzed the possible primary and secondary sex distortion due to the presence of the transgene, as well as embryo quality measured by the number of cells of the blastocyst. We analyzed the effect of diet during pre-implantation and post-implantation periods, considering laterality (ovarian or uterine origin). The relationship between ovariectomy and ovarian hormonal balance, sex proportion and position in the uterus for each of the sexes were studied. We analyzed whether there was a relationship between the rate of preimplantation development (second mitotic division and subsequent embryo development to blastocyst) and the quality and sex of embryos produced in vivo. Results and discussion: In chapter I, It was noted that this genetic modification did not alter the sex ratio primary or secondary, or cell number of pre-implantation embryos, and because of this, we considered the transgenic factor as non-determinant in the sex ratio. In Chapter II, differences in sex ratio were found when the data of the source side (right or left) were recorded, mainly in stages near to the time of fertilization, and in mice with minor physical condition. These differences were correlated with embryonic loss and were not significantly different when these ratios were observed globally. In Chapter III, no differences in the proportions of males and females between the right and left hemi-ovariectomy were found. However, the results showed that females had a tendency to implant in sections close to uterine cervix, presenting a lower weight than those females implanted elsewhere in the uterus. Finally, in Chapter IV, our results do not show a difference in the sex ratio in embryos recovered in the 2 to 3-cells stage, nor on the rate of development to blastocyst. It was only observed a higher proportion of females in embryos that arrived to the 3-cell stage the slowest and subsequently took longer to reach the blastocyst stage. A relationship between the embryo quality defined by the expression of markers of pluripotency and by the preimplantation speed division was also observed.
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Análisis molecular, proteómico y filogenético de la zona pelúcida de ovocitos de coneja (oryctolagus cuniculus) y gata (felis catus)
(2015-06-03) Stetson, Nelida Irene; Avilés Sánchez, Manuel; Izquierdo Rico, María José; Facultad de Veterinaria
El oocito de mamífero está rodeado por una matriz denominada zona pelúcida (ZP). Esta envoltura participa en procesos tales como la inducción de la reacción acrosómica, la unión de espermatozoides y también puede estar implicada en la especiación. Estudios recientes han demostrado que la matriz de ZP de ovocitos en varias especies se compone de cuatro glicoproteínas, denominadas ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4, en lugar de las tres descritas en el ratón, cerdo y vaca. En la gata (Felis catus), esta matriz se compone de al menos tres glicoproteínas denominadas ZP2, ZP3 y ZP4. Sin embargo, la presencia de cuatro proteínas en varios mamíferos, sugiere que necesita una reevaluación de la ZP en la gata. Además, en esta tesis, se realizaron investigaciones para determinar la expresión de una cuarta glicoproteína en la ZP de conejo (Oryctolagus cuniculis). Los objetivos de esta investigación fueron analizar la composición de proteínas de ZP gato por medio de análisis proteómico y en el conejo se amplificó ZP1 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). En la ZP aislada de ovarios y ovocitos de gato, se detectaron varios péptidos correspondientes a cuatro proteínas, teniendo una cobertura del 33,17%, 71,50%, 50,23% y 49,64% para ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4, respectivamente. Por otra parte, se confirmó por análisis molecular la expresión de los cuatro genes de ZP a partir de ARN total aislado de ovarios de gato, las ZPs de gato fueron parcialmente amplificadas por RT-PCR. En el conejo la ZP1 incluye un marco de lectura abierto de 1825 nucleótidos que codifican un polipéptido de 608 residuos de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos deducida de ZP1 de conejo mostró una alta identidad con otras especies: 70% de identidad con ZP1 humana y caballo y 67% de identidad con la ZP1 de ratón y rata. A nivel proteómico, fueron detectados por espectrometría de masas péptidos correspondientes a las cuatro proteínas ZP. Además, mediante un análisis filogenético molecular de ZP1 mostró que este gen presenta una pseudogenización de por lo menos cuatro veces durante la evolución de los mamíferos. Los datos presentados en esta tesis proporcionan evidencia, por primera vez, que la ZP de conejo y la ZP de gato se compone de cuatro glicoproteínas. 2. SUMMARY The mammalian oocyte is surrounded by a matrix called the zona pellucida (ZP). This envelope participates in processes such as acrosome reaction induction, sperm binding, and may be involved in speciation. Recent studies have shown that the ZP matrix of oocytes in several species is composed of four glycoproteins, designated ZP1, ZP2, ZP3 and ZP4, rather than the three described in mouse, pig and cow. In cat (Felis catus), this matrix is composed of at least three glycoproteins called ZP2, ZP3 and ZP4. However, the presence of a fourth protein in several mammals, meaning that a reevaluation of cat ZP is needed. Additionally, in this thesis, investigations were carried out to unveil a fourth glycoprotein in the rabbit (Oryctolagus cuniculis) ZP. The objectives of this research was to analyse of the protein composition of cat ZP by means of proteomic analysis and rabbit ZP1 was amplified by reverse transcribed polymerase chain reaction (RT-PCR). Using ZP from ovaries and oocytes of cat, several peptides corresponding to four proteins were detected, yielding a coverage of 33.17%, 71.50%, 50.23% and 49.64% for ZP1, ZP2, ZP3 and ZP4, respectively. Moreover, the expression of four genes was confirmed by molecular analysis. Using total RNA isolated from cat ovaries, the complementary deoxyribonucleic acids (cDNAs) encoding cat ZPs were partially amplified by RT-PCR. In the rabbit the ZP1 cDNA contains an open reading frame of 1825 nucleotides encoding a polypeptide of 608 amino acid residues. The deduced amino acid sequence of rabbit ZP1 showed high identity with other species: 70% identity with human and horse ZP1, and 67% identity with mouse and rat ZP1. At the proteomic level, peptides corresponding to the four proteins were detected by mass spectrometry. In addition, a molecular phylogenetic analysis of ZP1 showed that pseudogenization of this gene has occurred at least four times during the evolution of mammals. The data presented in this thesis provide evidence, for the first time, that the rabbit and cat ZP is composed of four glycoproteins.
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Antioxidantes del plasma seminal : potenciales biomarcadores de fertilidad en verracos incluidos en programas de inseminación artificial
(Universidad de Murcia, 2018-02-07) Barranco Cascales, Isabel; Roca Aleu, Jorge; Rodríguez Martínez, Heriberto; Facultad de Veterinaria
La Tesis Doctoral, presentada por compendio de publicaciones y estructurada en 5 artículos científicos, tuvo como principal objetivo determinar componentes del plasma seminal (PS) de porcino con propiedades antioxidantes y evaluar su valor predictivo para la calidad y funcionalidad espermática y la fertilidad de verracos incluidos en programas de inseminación artificial (IA). Concretamente, se evaluó la capacidad antioxidante total (TAC, artículo1), las enzimas paraoxonasa tipo 1 (PON-1, artículo 2 y 3) y glutatión peroxidasa 5 (GPX5, artículo 4), y la melatonina (MLT, artículo 5). Para llevar a cabo los estudios se utilizaron 821 eyaculados, procesados de forma entera o fraccionada, procedentes de 440 verracos y un total de 16.942 cerdas fueron inseminadas. Las muestras de PS fueron obtenidas inmediatamente después de la recogida de los eyaculados, mediante una doble centrifugación a 1.500 xg durante 10 min y almacenadas a -80 ºC hasta el momento de su análisis. La TAC y la actividad de PON-1 fueron determinadas usando un analizador automatizado, evaluando la decoloración del 2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato) y midiendo la hidrólisis del p-nitrofenil acetato a p-nitrofenol, respectivamente. La concentración de PON-1, GPX5 y MLT fueron determinadas usando ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante y usando un lector de placas. La motilidad espermática fue evaluada mediante un sistema de análisis espermático computarizado. La viabilidad espermática y los parámetros de funcionalidad espermática (producción intracelular de peróxido de hidrógeno, producción mitocondrial del anión superóxido [O2-], producción total de O2- y peroxidación lipídica), fueron evaluados mediante técnicas de citometría de flujo. El análisis inmunohistoquímico y el western blot (WB) se realizaron en muestras de tejidos de órganos genitales del verraco (testículo, epidídimo y glándulas sexuales accesorias [próstata, glándulas bulbouretrales y vesículas seminales], usando un anticuerpo policlonal primario contra GPX5. Los registros de fertilidad de los verracos fueron evaluados en términos de tasa de parto (número de cerdas que paren respecto al número de cerdas inseminadas), tamaño de camada (número total medio de lechones nacidos por camada) e índice de fertilidad (número de lechones nacidos por cada 100 cerdas inseminadas). Los resultados demostraron que la TAC, la actividad PON-1 y la concentración de la GPX5 y MLT, variaba entre verracos, entre eyaculados dentro del verraco y entre las fracciones del eyaculado. La TAC mostró una relación positiva con parámetros de calidad y funcionalidad espermática de muestras seminales conservadas en estado líquido (15-17 ºC) y congeladas-descongeladas. A su vez, la actividad de PON-1 y la concentración de GPX5 y MLT, estuvieron positivamente relacionadas con parámetros de calidad y/o funcionalidad espermática de muestras seminales conservadas en estado líquido (15-17 ºC). El WB y estudio inmunohistoquímico revelaron la presencia de la GPX5 en todos los órganos genitales. Finalmente, la TAC, la actividad de PON-1 y la concentración de GPX5 mostraron una relación positiva con la fertilidad, pudiendo su determinación en PS ser utilizada como un biomarcador de fertilidad.The PhD Thesis, presented as a compendium of publications and structured by 5 scientific papers, aimed to determine components with antioxidant properties in porcine seminal plasma (SP) and to evaluate its predictive value for sperm quality and functionality and for the fertility of boars used in artificial insemination (AI)-programs. Specifically, the SP-total antioxidant capacity (TAC, paper 1), the enzymes paraoxonase type 1 (PON-1, papers 2 and 3) and glutathione peroxidase 5 (GPX5, paper 4), as well as melatonin (MLT, paper 5) presence/activity in SP were studied. To achieve the objective 821 ejaculates, processed as entire ejaculate or fractions from 440 boars were used and a total of 16,942 sows were inseminated alongside. SP-samples were harvested immediately after ejaculation, through double centrifugation at 1,500 xg for 10 min, and were stored at -80 °C until analyses. The TAC and PON-1 activity were determined using an automated analyzer, assessing 2, 2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) decolorization and measuring the hydrolysis of p-nitrophenyl acetate to p-nitrophenol, respectively. The PON-1, GPX5 and MLT concentrations were determined using enzyme-linked immunosorbent assays using a micro-plate reader. Sperm motility was evaluated using a computer-assisted sperm analyzer. Sperm viability and sperm functionality parameters (intracellular production of hydrogen peroxide, mitochondrial production of superoxide anion [O2-], total production of O2- and lipid peroxidation) were evaluated by flow cytometric techniques. Western blot [WB] and immunohistochemistry of samples from testis, epididymis and accessory sex glands (prostate, bulbourethral glands and seminal vesicles) using a primary polyclonal antibody antibody against GPX5. Fertility outcomes of boars were evaluated as farrowing rates (number of farrowing sows respect to the number of inseminated sows), litter size (total number of piglets born per litter) and fertility index (number of piglets born per 100 sows inseminated). The results showed that TAC, PON-1 activity and GPX5 and MLT concentrations, differed among boars, ejaculates within boar and among ejaculate portions within an ejaculate. The TAC showed a positive relationship with sperm quality and functionality parameters of liquid-stored (15-17 ºC) and frozen-thawed semen. Likewise, PON-1 activity or GPX5 and MLT concentrations were positively related to sperm quality and/or functionality parameters of liquid-stored semen samples (15-17 ºC). The WB and immunohistochemical analysis revealed the presence of GPX5 in all genital organs. Finally, TAC, PON-1 activity and GPX5 concentration were positively related with fertility, determining that their measurements in SP, isolated or combined, could be used as fertility biomarkers.
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Aspectos nutricionales y medioambientales relacionados con parámetros reproductivos en varones jóvenes
(Universidad de Murcia, 2024-07-04) Kiwitt Cárdenas, Jonathan; Adoamne Adoamnei, Evdochia; Arense Gonzalo, Julián Jesús; Mendiola Olivares, Jaime; Escuela Internacional de Doctorado
INTRODUCCIÓN Durante las últimas décadas, numerosos estudios apuntan a una disminución de la concentración espermática en humanos. Los factores asociados a la misma son multifactoriales, pero destacarían los cambios en el estilo de vida, tales como la transición de un patrón alimentario mediterráneo o prudente a uno más occidental, o la exposición a determinados Compuestos Disruptores Endocrinos (DE). El patrón de alimentación occidental se caracteriza por un aumento de consumo en alimentos ultraprocesados, entre ellos las bebidas azucaradas, aportando hasta un total de 400 kcal diarias extras a nuestra dieta habitual. La relación entre las bebidas azucaradas y la función reproductiva masculina apenas se ha descrito en la literatura. Por otro lado, los DE son compuestos químicos ambientales capaces que imitar las hormonas naturales. Se estima que la exposición a estos tóxicos es ubicua e inadvertida. Algunos de estos compuestos pueden tener efectos estrogénicos o anti-androgénicos. Dentro de éstos, cabe mencionar por ejemplo el bisfenol A (BPA), que se encuentra en plásticos policarbonatos y envases de alimentos, los filtros ultravioletas (UV) tipo benzofenonas (BP) ampliamente usados en protectores solares, y los parabenos, conservantes antimicrobianos muy versátiles que se añaden a productos de cuidado personal y alimentos con la finalidad de prolongar su vida útil. OBJETIVOS Evaluar las asociaciones entre la ingesta de bebidas azucaradas y las concentraciones urinarias de BPA, parabenos y filtros UV tipo BP y la calidad seminal, niveles de hormonas reproductivas y el Índice de Fragmentación del ADN Espermático en varones jóvenes. MATERIAL Y MÉTODO Estudio observacional transversal en varones universitarios (de 18 a 23 años) de la Región de Murcia entre 2010 y 2011. Para estudiar la calidad seminal y hormonas reproductivas, se incluyeron un total de 209 pacientes, mientras que para la fragmentación del ADN espermático se analizaron un total de 158 sujetos del mismo estudio. En el mismo día de la evaluación física, los participantes proporcionaron muestras de orina, semen y sangre, y completaron cuestionarios sobre sus hábitos de vida. Las concentraciones de BPA, filtros UV tipo BP y parabenos se midieron en muestras de orina utilizando técnicas de microextracción dispersiva líquido-líquido y analizadas mediante cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas en tándem. La calidad del semen se evaluó mediante los Criterios de la OMS, 2010 e incluyeron los siguientes parámetros: volumen, concentración, recuento total, movilidad y morfología de los espermatozoides. Además, se determinaron los niveles en suero de hormona foliculoestimulante (FSH), hormona luteinizante (LH), testosterona (T) total y libre, estradiol (E2) e inhibina B. El análisis de la fragmentación del ADN se realizó mediante la prueba de dispersión de la cromatina espermática (DCE). El índice de la Fragmentación Espermática (IFE) se definió como el porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado dividido por el total de espermatozoides analizados. Para evaluar las posibles asociaciones entre la ingesta de bebidas azucaradas, las concentraciones de compuestos químicos ambientales y los parámetros seminales, así como los niveles hormonales y la fragmentación espermática se emplearon análisis de regresión lineal múltiple, crudos y ajustados por covariables importantes. Asimismo, para evaluar el efecto mezcla o cóctel sobre la fragmentación del ADN espermático se emplearon modelos de regresión bayesiana con método Kernel (BKMR). RESULTADOS Los varones en el cuartil más alto de ingesta de bebidas azucaradas presentaron un mayor porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales (37,4% [6,1; 68,3]) (p-tendencia = 0,047) y niveles de estradiol más altos (9,5% [3,5; 22,5] (p-tendencia = 0,047) que los del primer cuartil. Por otro lado, no se mostró ninguna asociación entre las concentraciones urinarias de BPA y el IFE en el grupo global. Sin embargo, en el subgrupo de hombres con el IFE > 30%, se observaron asociaciones positivas significativas a través de cuartiles (p-tendencia=0,02) y con niveles continuos de BPA [β = 0,055; IC95%: (0,002; 0,108)]. Por último, analizando la mezcla de todos los DE, se observó que el aumento de la concentración urinaria de 4-OHBP resultó ser el factor que más contribuía a la asociación negativa entre las concentraciones urinarias de DE y el IFE, siendo de -5,5 % [IC del 95 %: -10,7, -0,3] para aquellos en el percentil 50, y de - 5,4 % [IC del 95 %: -10,8, -0,1] para los del percentil 75. No se observaron asociaciones significativas entre otros DE y el IFE. CONCLUSIONES Nuestros resultados indican que la morfología espermática y los niveles de estradiol podrían estar asociados con la ingesta de bebidas azucaradas. Asimismo, nuestros hallazgos apuntan a una relación positiva entre las concentraciones urinarias de BPA y el IFE. Igualmente, los resultados de los análisis de mezclas, mostraron una relación negativa, estadísticamente significativa entre los niveles urinarios de 4-OHBP y el índice IFE. No obstante, es probable que los efectos observados sean pequeños y de significado clínico incierto. Así pues, se necesitan más estudios para confirmar estos resultados y extraer conclusiones en otras poblaciones masculinas.
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Avances en conservación de semen y separación de espermatozoides X e Y en la especie canina
(2015-12-21) Ródenas Barceló, Carmen; Lucas Arjona, Xiomara; Parrilla Riera, Inmaculada; Facultad de Veterinaria
Over the last years, reproductive technologies as artiﬁcial insemination (AI) and semen conservation procedures are increasingly demanded in canine species and the optimization of these procedures are the main goal of numerous investigations. On the other hand, the study and development of new technologies applicable to the canine species in the area of reproductive biotechnology is also increasing. In this context, we have considered that the possible application of sex-sorting technology by flow cytometry in combination with other routine reproductive techniques mentioned above, could contribute relevantly to optimize the efficiency of canine breeding. The main objective of this Thesis was to optimize the protocols for chilling and cryopreservation of dog spermatozoa and to design an effective protocol for canine spermatozoa sex-sorting using flow cytometry. To achieve this objective, the following studies were developed. In the first study, the effects of various rapid cooling rates from room temperature (23 ºC) to 5ºC on sperm quality of chilled and cold-stored (96 h) canine spermatozoa, using a Tris fructose extender with 20% egg yolk was evaluated. For this purpose, sperm rich fraction samples were pooled (experiment 1) or processed individually (experiment 2) and split into different aliquots that were chilled to 5 °C using different cooling rates of 2.25, 0.9, 0.45, and 0.2 (control) °C/min. In the second study, the effects of rapid cooling prior to freezing on frozen-thawed canine sperm quality. For this purpose 2 experiment were carried out. In experiment 1, centrifuged ejaculates from 6 dogs were pooled, split into 4 aliquots and cryopreserved by the Uppsala procedure using different cooling rates (control, 0.2 C/min; rapid, 2.25 C/min) in combination with 2 glycerol addition protocols (fractionated or unfractionated). In experiment 2, centrifuged ejaculates from 4 dogs were processed individually using the same cooling rates described in experiment 1 in combination with an unfractionated glycerol addition protocol. In the third study, 3 the objective was to optimize Hoechst 33342 staining concentrations for the flow cytometric identification and separation of X- and Y-chromosome-bearing canine spermatozoa. Additionally, to determine whether variations between dogs exist that affect the sex-sorting of spermatozoa. Semen samples from six dogs were diluted to 100 × 106 sperm/mL, split into four aliquots, stained with increasing H-42 concentrations (5, 7.5, 10 and 12.5 μL, respectively) and sorted by flow cytometry. The rates of non-viable, percentages of oriented and selected spermatozoa, as well as the average sorting rates (sorted spermatozoa/s), were used to determine the sorting efficiency. The results achieved in these four studies have generated the following conclusions: the use of a rapid cooling rate of 2.25 ºC/min can be an efficient alternative to the use of a slow cooling rate in protocols for chilling canine semen using a TCF 20% egg yolk extender, maintaining optimal values of sperm quality during a long period of cold-storage (96 h). Dog spermatozoa can be cryopreserved using a rapid cooling rate of 2.25ºC/min prior to freezing with the Uppsala method, in combination with a fractionated or unfractionated glycerol addition procedure. Sperm sex-sorting by flow cytometry can be performed successfully in canine samples using between 7.5 and 12.5 μL of H-42. In addition, significant individual differences are evident in the sorting efficiency of canine spermatozoa.Actualmente, biotecnologías reproductivas como la inseminación artificial (IA) y procedimientos para la conservación de espermatozoides como la refrigeración y criopreservación son técnicas muy demandadas en la especie canina. Así mismo, la optimización de estos protocolos ha sido y sigue siendo objetivo de la mayoría de investigaciones en el campo de la reproducción canina. Desde un punto de vista práctico, resultaría muy interesante la disminución del tiempo empleado en enfriar las muestras de semen hasta 5 ºC durante los procesos de conservación. Por otra parte, destacar la importancia que supondría en esta especie el desarrollo de nuevas biotecnologías reproductivas. En especial, sería muy interesante poder combinar técnicas utilizadas de forma rutinaria, como la IA y los protocolos de conservación seminal, con otras técnicas reproductivas como la preselección del sexo de la descendencia mediante separación de espermatozoides X e Y por citometría de flujo. Por todo lo mencionado anteriormente, la finalidad principal de esta Tesis fue optimizar los procedimientos de conservación de semen, así como diseñar un protocolo para la separación de espermatozoides X e Y mediante citometría de flujo en la especie canina. Para lograr este objetivo, los siguientes estudios fueron realizados. En el primer estudio, se evaluó el efecto de diferentes ratios de enfriamiento rápido, desde temperatura ambiente (23 ºC) hasta 5 ºC, sobre la calidad del semen canino refrigerado y conservado durante 96 horas, utilizando un medio de Tris fructosa con un 20% de yema de huevo. Para ello, las fracciones espermáticas procedente de 5 perros fueron agrupadas en un pool (experimento 1) o procesadas individualmente (experimento 2) y divididas en diferentes alícuotas las cuales fueron refrigeradas a 5 ºC utilizando diferentes ratios de enfriamiento de 2,25, 0,9, 0,45 y 0,2 (control) º C/min. En el segundo estudio, se evaluó el efecto de una ratio de enfriamiento rápido antes de la congelación sobre la calidad del semen canino criopreservado utilizando el método Uppsala, en combinación con la adición fraccionada o no de glicerol. Para ello, se llevaron a cabo 2 experimentos. En el experimento 1, las fracciones espermáticas de 6 perros fueron agrupadas en un pool, divididas en cuatro alícuotas y criopreservadas mediante el método Uppsala usando diferentes ratios de enfriamiento (control, 0,2 ºC/min y rápido, 2,25 ºC/min) en combinación con 2 protocolos de adicción del glicerol (fraccionado y no fraccionado). En el experimento 2, las fracciones espermáticas de 4 perros fueron procesadas usando los mismos ratios de enfriamiento que en el experimento 1 en combinación con una adicción no fraccionada de glicerol. En el tercer estudio, el objetivo fue optimizar las concentraciones de Hoechst 33342 (H-42) para la identificación y separación de los espermatozoides X e Y mediante citometría de flujo y determinar si existen variaciones entre individuos que afecten al proceso de separación espermática en la especie canina. Las fracciones espermáticas de seis perros fueron divididas en cuatro alícuotas y teñidas con concentraciones crecientes de H-42 (5, 7,5, 10 y 12,5 µL, respectivamente). La identificación y separación de espermatozoides X e Y fue realizada mediante citometría de flujo. Se analizaron los porcentajes de espermatozoides no viables, espermatozoides correctamente orientados, espermatozoides seleccionados o separados, así como finalmente la velocidad de separación (espermatozoides separados/s). Tras los resultados de estos estudios, podemos concluir que: Una ratio de enfriamiento rápido de 2,25 ºC/min puede ser utilizada de forma eficiente en protocolos para la refrigeración de semen canino, utilizando un medio tris fructosa con un 20% de yema de huevo, consiguiendo valores óptimos de calidad espermática durante largos periodos de conservación a 5 º C (96 h). Los espermatozoides caninos pueden ser criopreservados mediante el método Uppsala con una adición fraccionada o no de glicerol, utilizando una ratio de enfriamiento rápido de 2,25 ºC/min antes de la congelación. La separación de espermatozoides X e Y mediante citometría de flujo puede realizarse con éxito en la especie canina utilizando entre 7,5 y 12,5 μL de Hoechst 33342. Además, diferencias entre individuos pueden afectar significativamente a la eficiencia del proceso de separación.
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Caracterización del eyaculado del delfín mular (Tursiops truncatus) a través del estudio de la conservación y morfometría espermática, e identificación de proteínas en espermatozoides y plasma seminal
(Universidad de Murcia, 2023-12-21) Fuentes Albero, María del Carmen; García Vázquez, Francisco Alberto; Escuela Internacional de Doctorado
El delfín mular (Tursiops truncatus) es un mamífero acuático ampliamente conocido por su comportamiento social y su distribución global en los mares y océanos. Sin embargo, su hábitat natural se enfrenta a graves amenazas, principalmente debido a la actividad humana, como la contaminación de las aguas, la sobreexplotación de los recursos y la pesca ilegal. Así mismo, el calentamiento global está llevando a una reducción de los peces que conforman la dieta diaria de estos delfines, lo que requiere un mayor gasto de recursos fisiológicos para obtener alimento. Además de su presencia en su hábitat natural, el delfín mular es comúnmente alojado en zoológicos y acuarios en todo el mundo. Esto plantea el desafío de mantener la variabilidad genética en estas poblaciones en cautiverio para evitar la consanguineidad. En 2017, la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN) clasificó al delfín mular como vulnerable, lo que ha limitado su movimiento entre países. Esto ha destacado la necesidad de intercambiar muestras seminales entre centros para la conservación de esta especie. Por lo tanto, las técnicas de reproducción asistida (TRAs) se han tornado de gran interés en la conservación de esta especie y otros cetáceos. El objetivo general de la presente tesis doctoral ha sido analizar las características seminales y la funcionalidad espermática del delfín mular a través del estudio de su conservación, morfometría y composición proteica. Para alcanzar este propósito, se emplearon tres delfines mulares machos, todos maduros sexualmente, que residían en el Oceanogràfic de Valencia en España. Previamente, el personal de cuidadores y veterinarios especializados había entrenado a estos animales para colaborar en la obtención de muestras seminales de manera no invasiva, basándose en la disposición voluntaria de los propios delfines. En el Artículo 1, se llevaron a cabo experimentos para desarrollar un método de refrigeración espermática que permita mantener la viabilidad de los espermatozoides durante varios días, facilitando así el intercambio de muestras entre centros para programas de inseminación artificial. Los resultados indicaron que el semen de delfín mular puede refrigerarse durante al menos 7 días, manteniendo la funcionalidad de los espermatozoides, especialmente a una temperatura de 5°C y una concentración de 100x10⁶ espermatozoides/ml, manteniendo la calidad microbiológica de las muestras seminales. En el Artículo 2, se analizaron las características morfométricas de los espermatozoides de delfín mular. El análisis de componentes principales (PCA) reveló que cuatro componentes principales (PC) representaron más del 91% de la varianza acumulada determinados por los 13 parámetros morfométricos de los espermatozoides analizados, siendo PC1 el que proporcionó la mayor varianza explicada (47.21%), seguido por PC2 (25.65%), PC3 (11.17%) y PC4 (7.72%). Se identificaron principalmente dos subpoblaciones espermáticas con diferencias entre individuos, y se establecieron correlaciones, tanto positivas como negativas, entre la morfometría de los espermatozoides y los niveles de testosterona en sangre. Además, se observó que las principales diferencias morfométricas se debieron al tiempo de almacenamiento y no a la temperatura de almacenamiento. En el Artículo 3, se proporcionó un inventario de proteínas en el semen por primera vez en un cetáceo. Se identificaron un total de 722 proteínas diferentes perteneciendo 419 de ellas a los espermatozoides y 303 al plasma seminal, de las cuales 111 proteínas fueron comunes a ambos, espermatozoides y plasma seminal. Se compararon estos perfiles proteicos con el de otras especies (humano, bovino, canino), revelando proteínas comunes entre ellas. En conclusión, este estudio ha proporcionado una valiosa información sobre la conservación y características espermáticas del delfín mular, incluyendo aspectos morfométricos y proteicos. Estos hallazgos no solo son fundamentales para la conservación de esta especie, sino que también tienen implicaciones para mejorar las TRAs en mamíferos acuáticos en general.
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Comparative analysis of the male reproductive physiology in small- spotted catshark (Scyliorhinus canicula) between aquarium and wild populations
(Universidad de Murcia, 2023-12-18) Muñoz Baquero, Marta; García Vázquez, Francisco Alberto; Marco Jiménez, Francisco; Escuela Internacional de Doctorado
Los condrictios, que incluyen tiburones, rayas y quimeras, han logrado adaptarse a diversos hábitats acuáticos, en parte gracias a su especialización reproductiva. Sin embargo, su situación actual es preocupante, ya que al menos un tercio de sus especies enfrenta amenazas causadas por la actividad humana. La conservación de estas especies requiere tanto medidas in situ como ex situ, en las que los acuarios desempeñan un papel crucial al contribuir al conocimiento de la reproducción. El éxito de los programas de reproducción se ve afectado por factores ambientales como temperatura, fotoperiodo, dieta y calidad del agua. Por lo tanto, es esencial comprender cómo el hábitat influye en las funciones reproductivas de estas especies. Para abordar esta cuestión, se eligió al tiburón pintarroja (Scyliorhinus canicula) como una especie modelo ideal debido a su presencia común en el Mediterráneo, siendo una especie comercializable y fácil de encontrar en mercados locales, su estatus de conservación estable, considerado por la IUCN como “preocupación menor”, su pequeño tamaño y facilidad de mantenimiento en acuarios. La hipótesis de esta tesis doctoral plantea que las diferencias en el potencial reproductivo de los tiburones pintarroja en acuario se deben a modificaciones intrínsecas al hábitat. Para investigar esta hipótesis, se llevaron a cabo tres estudios comparativos entre tiburones pintarroja en acuarios y en su entorno natural. En el primer estudio, se evaluó la calidad del esperma de ambas poblaciones de S. canicula. Los resultados mostraron que, en condiciones controladas en el acuario, los tiburones presentaban un menor volumen de eyaculado y un menor número total de espermatozoides en comparación con los animales salvajes. Sin embargo, los tiburones en el acuario tenían un mayor porcentaje de espermatozoides móviles, y otros parámetros espermáticos como su viabilidad, integridad de membrana o actividad mitocondrial, eran similares en ambos grupos. También se observaron diferencias morfológicas en el esperma y una menor concentración de testosterona sérica en los tiburones del acuario. En el segundo estudio, se analizaron las proteínas en el plasma seminal y los espermatozoides. Se encontraron diferencias mínimas en el plasma seminal, con solo una proteína diferencial, pero los espermatozoides de los tiburones en acuarios y salvajes mostraron 107 proteínas diferenciales. Estas proteínas estaban relacionadas principalmente con la actividad oxidorreductasa. En el tercer estudio, se comparó el microbioma en el plasma sanguíneo y el plasma seminal de ambos grupos de S. canicula. Se identificaron diferencias en el microbioma sanguíneo y se observó un efecto similar en el plasma seminal. Las Proteobacterias fueron predominantes en ambos fluidos, independientemente del hábitat, con Pseudomonas y Cloacibacterium comunes en ambos grupos. Sin embargo, se encontraron diferencias marcadas a nivel de género en el microbioma de sangre y semen entre los tiburones en estado salvaje y en acuarios. Como conclusión general se considera que las adaptaciones en el entorno de tiburones pintarroja de acuario afectan a la fisiología del animal y modifican las características seminales, lo que podría explicar una menor capacidad reproductiva en estas condiciones.
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Composición del fluido oviductal: estudio comparado del fluido oviductal porcino, bovino y de coneja
(Universidad de Murcia, 2022-09-26) Jara Pérez, Lourdes; Avilés Sánchez, Manuel; Mondéjar Corbalán, Irene; Escuela Internacional de Doctorado
El oviducto es un órgano par que conecta los ovarios con el útero y donde tiene lugar el encuentro de los gametos. El oviducto y el fluido contenido en él son de gran importancia en la fecundación. A lo largo de las fases reproductivas de las hembras varían las características del oviducto y la composición del fluido oviductal. En hembras adultas, la fase periovulatoria es el momento en el que el oviducto está preparado para el encuentro de los gametos y el microambiente es favorable para la fecundación. El estudio de su composición puede resultar útil para mejorar las técnicas de reproducción asistida y condiciones patológicas como la polispermia, que es elevada en la especie porcina cuando la fecundación se realiza in vitro. En este estudio se intenta ampliar el conocimiento sobre la composición del fluido oviductal, realizando un análisis comparativo del fluido oviductal porcino de hembras prepúberes, y adultas en fase periovulatoria y luteal. El estudio se realizó sobre muestras fraccionadas mediante cromatografía líquida y columna de afinidad por heparina, que permitió una mayor identificación de proteínas al realizar el análisis proteómico de las muestras, por técnicas de espectrofotometría de masas, que el análisis proteómico de las muestras sin fraccionar. De las proteínas identificadas se prestó mayor atención a aquellas que eran secretadas, 15, 20 y 23 en prepúber, periovulatorio y luteal. Algunas de las proteínas secretadas, con importancia en la fecundación, fueron descritas por primera vez en el fluido oviductal porcino, como la heparanasa, progranulina o pleiotrofina. Una segunda parte de este trabajo se centró en el estudio del efecto de cada fracción sobre el endurecimiento de la zona pelúcida de los ovocitos, midiendo el tiempo de resistencia a la digestión enzimática tras la incubación de los ovocitos con las fracciones del fluido oviductal estudiadas. El endurecimiento se produjo tras la incubación con el fluido oviductal porcino de hembras en fase periovulatoria. En las fracciones de esta fase es donde mayor número de péptidos de oviductina se detectan, y su cantidad similar entre ellas como también comprobamos mediante técnicas de electroforesis y western blot. Solamente una de las fracciones produjo endurecimiento de la ZP. Fue ña fracción en la que se detectaron una mayor cantidad de proteínas secretadas mediante el análisis proteómico. Por último realizamos un estudio comparado entre fluido oviductal bovino y de coneja en fase periovulatoria, mediante técnicas de electroforesis 2D y DiGE, donde se observó una expresión diferencial en 217 manchas. En las manchas analizadas por MS/MS se identificaron 13 proteínas sobreexpresadas en fluido oviductal bovino frente a FOC y 11 se sobreexpresadas en FOC frente al bovino. Las proteínas sobreexpresadas en FOB muestran distintas acciones relacionadas con la defensa inmunológica, respuestas al estrés oxidativo y procesos relacionados con la interacción con el espermatozoide, mientras que la mayoría de las proteínas sobreexpresadas en el FOC tienen efecto antioxidante y relacionadas con la respuesta inmune.
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Contribución al estudio morfoestructural y reproductivo del caballo pura sangre inglés en España / Mª Luisa Hevia Méndez ; director Cándido Gutiérrez Panizo, Francisco C. Fuentes García.
(Murcia : Universidad de Murcia, Facultad de Veterinaria,, 1991) Hevia Méndez, María Luisa
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Dinámica espacio-temporal del ictioplancton del Mar Menor (SE de España) y factores ambientales asociados
(2015-01-26) Quispe Becerra, Jhoni Ismael; Pérez Ruzafa, Ángel; Marcos Diego, Concepción; Departamento de Ecología e Hidrología
OBJETIVOS: Los objetivos de la presente tesis doctoral son describir la composición taxonómica de las larvas de peces que habitan las aguas del Mar Menor, conocer la distribución espacial y la dinámica temporal del ictioplancton en la laguna, analizar los factores ambientales que determinan dicha distribución y dinámica y, finalmente, valorar el papel de la colonización larvaria a través de los canales de comunicación con el mar abierto y las corrientes en la estructura del poblamiento ictiológico. METODOLOGÍA: El trabajo se ha llevado a cabo en el Mar Menor, laguna costera ubicada en el SE de la península ibérica, en el extremo oriental de la Región de Murcia. Se establecieron en la misma 20 localidades de muestreo donde se recogió material en 1997 y desde 2006 a 2012. Adicionalmente, durante 2009 y 2012 se sumaron 8 estaciones para estudiar la influencia del Mediterráneo adyacente, ubicándolas en la bocana interior de los tres canales de comunicación con el mar abierto y en el propio Mediterráneo. El diseño experimental de muestreo permite el análisis de las escalas espacio-temporales de variabilidad del poblamiento y de las condiciones ambientales. El material trabajado en la presente memoria proviene de un total de 3.342 muestras tomadas con arrastres sub-superficiales (0,5–2 m de profundidad), diurnos, circulares y con una duración de 7 minutos, utilizando una red de plancton estándar, de forma cónica, equipada con un flujómetro. Todos los huevos y larvas de peces fueron separados y contados, y éstas últimas fueron identificadas hasta especie. El análisis de las escalas de variabilidad se ha realizado mediante Permanova y para el estudio de la estructura del poblamiento y las variables ambientales que lo explican se han utilizado regresiones múltiples y análisis multivariantes de ordenación. RESULTADOS: Se colectaron un total de 55.262 huevos y se han examinado 185.135 especímenes de larvas y postlarvas de peces, pertenecientes a 24 familias, 48 géneros y 69 especies. De éstas, 15 especies son exclusivas de la laguna. En el Mediterráneo la riqueza de especies llega a 100, existiendo 46 que no penetran en la laguna como larvas. Las familias más abundantes han sido Gobiidae (64,49%), Engraulidae (16,76%), Blenniidae (16,54%) y Atherinidae (1,11%). A su vez, las especies dominantes fueron Gobius niger (34,65%), Engraulis encrasicolus (16,76%), Gobius paganellus (15,26%), Pomatoschistus marmoratus (8,72%), Parablennius pilicornis (7,83%), Salaria pavo (6,55%), Aphia minuta (2,96%), Gobius cruentatus (1,63%), Parablennius gattorugine (1,48%) y Gobius cobitis (1,08%). De las especies estudiadas, 23 (23,7%) son residentes en el Mar Menor o típicamente lagunares, 27 (27,8%) son migradoras o pobladores cíclicos regulares, 12 (12,4%) son pobladores ocasionales o irregulares y 28 (28,9%) son visitantes extraviados o esporádicos. La densidad media anual total de larvas de peces en la laguna fue de 613,27 (± 37,02) individuos por 1000 m3, muy superior a la encontrada en el Mediterráneo adyacente, de 126,05 (± 13,51) individuos por 1000 m3. CONCLUSIONES: El poblamiento ictioplanctónico lagunar muestra gran variabilidad espacio-temporal. Un 41,3% del poblamiento lagunar varía de un año a otro. No obstante, su dinámica presenta un ciclo estacional claro, con dos picos de abundancia, en primavera y en otoño. La mayoría de las especies de interés pesquero de las familias Mugilidae, Sparidae o Clupeidae en el ictioplancton lagunar solo aparecen testimonialmente, con abundancias relativas medias inferiores al 0,03%, indicando que su penetración en la laguna ocurre principalmente en fases juveniles La distribución espacial está relacionada principalmente con los patrones de circulación de la laguna y con la colonización a través de los canales de comunicación con el mar abierto a la que se superponen las condiciones tróficas asociadas a la entrada de nutrientes por la rambla del Albujón. Existe un importante componente aleatorio en la dinámica del poblamiento que probablemente forma parte de los mecanismos homeostáticos del ecosistema lagunar. La elevada riqueza y diversidad de especies acumuladas y la gran proporción de especies ocasionales y extraviadas sugieren un papel muy importante de los mecanismos de lotería competitiva. ABSTRACT OBJECTIVES: The objectives of this thesis are to describe the taxonomic composition of larval fish that inhabit the waters of the Mar Menor, knowing the spatial distribution and temporal dynamics of ichthyoplankton in the lagoon, analyze the environmental factors that determine this distribution and dynamics and finally assess the role of larval colonization through the channels of communication with the open sea and the currents in the structure of ichthyological settlement. METHODOLOGY: The study has been conducted in the Mar Menor coastal lagoon located in the SE of the Iberian Peninsula at the eastern end of the Region of Murcia. Material was collected in 20 sampling sites in 1997 and from 2006 to 2012. Additionally, during 2009 and 2012, 8 stations, located in the inner mouth of the three channels of communication with the open sea and in the Mediterranean, were added to study the influence of the adjacent open sea. The experimental sampling design allows the analysis of the spatio-temporal scales of variability of the assemblage and environmental conditions. A total of 3,342 samples were analyzed. They were collected using diurnal, circular subsurface tows (0.5-2 m deep), with a duration of 7 minutes, using a standard plankton net, equipped with a flowmeter. All eggs and fish larvae were removed and counted, and the latter were identified to species. The analysis of the scales of variability was performed using PERMANOVA. The study of the structure of the assemblage and the environmental variables that explain it has been made by using multiple regression and multivariate ordination analysis. RESULTS: A total of 55,262 eggs were collected and 185 135 specimens of fish larvae and post-larvae, belonging to 24 families, 48 genera and 69 species, were examined. Of these, 15 species are unique to the lagoon. In the Mediterranean species richness reaches 100, 46 of them do not penetrate the lagoon as larvae. The most abundant families were Gobiidae (64.49%), Engraulidae (16.76%), Blenniidae (16.54%) and Atherinidae (1.11%). In turn, the dominant species were Gobius niger (34,65%), Engraulis encrasicolus (16,76%), Gobius paganellus (15,26%), Pomatoschistus marmoratus (8,72%), Parablennius pilicornis (7,83%), Salaria pavo (6,55%), Aphia minuta (2,96%), Gobius cruentatus (1,63%), Parablennius gattorugine (1,48%) and Gobius cobitis (1,08%). 23 (23.7%) of the studied species are resident in the Mar Menor lagoon, 27 (27.8%) are migratory or regular cyclical residents, 12 (12.4%) are occasional or irregular residents and 28 (28.9%) are marine stragglers or casual visitors. The total annual average density of fish larvae in the lagoon was 613.27 (± 37.02) individuals per 1000 m3, much higher than that found in the adjacent Mediterranean that reach 126.05 (± 13.51) individuals/1000 m3. CONCLUSIONS: The lagoon ichthyoplankton shows large spatial and temporal variability. 41.3% of the lagoon assemblage varies from year to year. However, their dynamics presents a clear seasonal cycle, with two abundance peaks in spring and autumn. Most species of commercial interest of the families Mugilidae, Sparidae or Clupeidae are present in the lagoon ichthyoplankton just in testimony with relative abundances lower to 0.03%, indicating that penetration into the lagoon occurs mainly as juveniles. The spatial distribution is mainly related to the circulation patterns of the lagoon and to the colonization through the channels of communication with the open sea. Overlapping to this act the trophic conditions associated with nutrient inputs from the Albujón watercourse. There is a substantial random component in the assemblage dynamics which is probably part of the homeostatic mechanisms of the lagoon ecosystem. The high richness and diversity of species and accumulated large proportion of occasional and straggler species suggest an important role of the mechanisms of competitive lottery.
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Efecto de diversas técnicas para visualizar la placa metafásica y el corpúsculo polar sobre la capacidad de desarrollo de ovocitos porcinos madurados in vitro = Effect of several approaches to visualize the metaphase II plate and the first polar body on the developmental ability of in vitro-mature porcine oocytes
(2013-01-15) Maside Mielgo, Carolina; Facultad de Veterinaria
La transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) en la especie porcina se ha convertido en una herramienta muy útil para para la elaboración de modelos genéticos de enfermedades humanas y para el uso en xenotransplantes. Aunque el número de cerdos clonados aumenta cada año, la eficiencia total de esta tecnología es todavía muy baja. Uno de los pasos más difíciles de la SCNT en porcino es la enucleación del ovocito, principalmente debido a que su citoplasma contiene numerosas gotas lipídicas. El principal objetivo de la tesis fue evaluar el efecto de diversas técnicas para visualizar la placa metafásica y el corpúsculo polar sobre la capacidad de desarrollo de ovocitos porcinos madurados in vitro. Palabras claves: Porcino; Ovocito; Enucleación; Metafase II; Primer Corpúsculo Polar; Hoechst 33342; Irradiación ultravioleta; Distribución de mitocondrias activas; ADN mitocondrial; SYBR-14; Microtúbulo; Microscopio de luz polarizada. Summary: Somatic cell nuclear transfer (SCNT) technology in porcine has become a very useful tool for the elaboration of genetic models for human diseases and the use in xenotransplantation. The efficiency of SCNT is still very low, although the number of cloned pigs increases each year. One of the hardest steps of porcine SCNT is the enucleation of the oocyte because its cytoplasm contains many lipid droplets. The main objective of this thesis was to assess the effect of several approaches to visualize the metaphase II plate and the first polar body on the developmental ability of in vitro mature porcine oocytes. Keywords: Pig; Oocyte; Enucleation; metaphase II; First polar body; Hoechst 33342; Ultraviolet irradiation; Distribution of active mitocondria; mitochondrial DNA; SYBR-14; Microtubule; Polarized light microscopy.
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Escenarios hipotéticos sobre la reproducción humana en el arte especulativo
(Servicio de Publicaciones, Universidad de Murcia, 2025) Gas Barrachina, Silvia; Sin departamento asociado
La dimensión comunicativa en la práctica artística, la cual posibilita un espacio de diálogo que activa procesos de interpretación, reflexión y participación social, encuentra en el arte especulativo un contexto idóneo, puesto que, a través de narrativas ficticias, prototipos y simulaciones vinculadas a la tecnología, alienta al público a confrontar lo improbable, despertando su capacidad crítica frente a la realidad. En un contexto marcado por los avances científicos y tecnológicos, la reproducción humana deviene en un área de investigación para el arte especulativo. Por ello, el propósito de este trabajo consiste en analizar obras de mujeres artistas enmarcadas dentro del ámbito especulativo que abordan la reproducción humana. El resultado principal revela unas narrativas compartidas que se refieren a la modificación genética, la mecanización del proceso de gestación mediante úteros artificiales, la crianza compartida y la hibridación entre lo humano, animal y la naturaleza. Desde la experiencia de las mujeres, estas obras invitan a reflexionar acerca del futuro, desafiando conceptos tradicionales sobre el género, la identidad, la maternidad, la familia y las relaciones entre lo natural y lo artificial. Plantean nuevos escenarios dominados por la modificación, la intervención y el control, que invitan al público a cuestionar las implicaciones éticas, sociales, económicas y políticas de la intervención científico-tecnológica en la reproducción humana
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Estadísticos reproductivos de Helix Aspersa, L. var. máxima en ambiente controlado
(Murcia : Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 1987) Cuéllar, L.; Pérez-García, T.; Fontanillas, J.C.; Sotillo Ramos, José Luis; Facultad de Veterinaria
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Estrogens regulate the innate and the adaptive immune response = Regulación de la respuesta inmunitaria innata y adaptativa por los estrógenos
(2017-05-15) Ródenas Bleda, María del Carmen; García Ayala, Alfonsa; Meseguer Peñalver, José; Mulero Méndez, Victoriano Francisco; Facultad de Biología
Abstract Endocrine disrupting chemicals (EDCs) are a class of heterogeneous chemicals present in the environment that bind to estrogen receptors (ERs) and interfere with the estrogen-dependent control of body homeostasis. In the present thesis, we present evidence that EDCs modulate the immune system of gilthead seabream (Sparus aurata L.) even when exposure to these chemicals has ended. We evaluate the effect of 17α-ethinylestradiol (EE2), a bio-active estrogen used in oral contraceptive pills, and tamoxifen (Tmx), a drug used worldwide for the treatment of ER-positive breast cancer. Both have become a widespread problem in the environment due to their high resistance to degradation. The gilthead seabream is a marine teleost fish of significant economic value in the Mediterranean area and has been extensively used in research as a protandrous hermaphrodite fish. Furthermore, during the development of the thsesis we identified a membrane-anchored receptor called G protein-coupled estrogen receptor (GPER1) in human neutrophils. The thesis was carried out in four stages. First of all, we confirmed that EE2 and Tmx, incorporated in the diet, promote an estrogenic response in adult fish although the effect of Tmx was seen to be much less pronounced. We also investigated the capacity of both compounds to modulate the immune response induced by an antigenic challenge and its capacity to recover its functionality when the treatments ceased. Both EE2 and Tmx transiently inhibited the induction of interleukin-1β (il-1β) gene expression and transiently increased reactive oxygen species (ROS) in head kidney leukocytes from vaccinated fish. Moreover, EE2 and Tmx increased the antibody titer but only the fish exposed to Tmx showed a higher IgM titer and a higher percentage of IgM+B lymphocytes during the recovery period. After observing that EE2 and Tmx affected the immune response of adult specimens, we attempted to ascertain whether these effects are also produced in juveniles. Moreover, it was seen that treatment with G1, a GPER-selective agonist, also altered the immune response of adult specimens. Only EE2 and Tmx differently increased vtg mARN levels during the treatment and the expression returned to basal levels during recovery. Although none of the three compounds affected ROS production, they all inhibited the induction of il1b gene expression after priming. Significantly, Tmx increased the percentage of IgM+ cells in both head kidney and spleen during the recovery period. More importantly, the antibody response of vaccinated fish was modified by the three compounds but the exact effects depended on the time when the immunization was performed. The previous results led us to investigate the influence of EE2 on the innate immune response, focusing on lymphocytes and in the humoral activity when exposure to this EDC ceased. Significantly, EE2 affects the percentage and proliferation of T and IgM+-B lymphocytes. For the first time it was seen that EE2 significantly induces the production of antibodies, an effect mediated through GPER1 signalling pathway. Finally, we functionally characterized GPER1 in human neutrophils. These cells express a functional GPER1 in the plasma membrane and stimulation of the neutrophils with G1 resulted in a dose-dependent increase in transcript levels of CFOS, a marker of GPER1 activation. Besides, G1 significantly primed the production of O2- and drastically altered their gene expression profile. G1 treatment regulated the activation and life span of human neutrophils through several signaling pathways. To sum up, our results show for the first time that GPER1 activation promotes the polarization of human neutrophils towards a pro-inflammatory phenotype and identify GPER1 as a potential therapeutic target in immune diseases where neutrophils play a key role. Resumen En el transcurso de esta Tesis Doctoral se ha explorado el efecto del 17α-etinilestradiol (EE2) y del tamoxifeno (Tmx) sobre el sistema inmunitario de la dorada (Sparus aurata L.) durante y después de la exposición a estos compuestos. El primero es un estrógeno sintético siendo el principal ingrediente activo de la píldora anticonceptiva, mientras que el Tmx es un modulador selectivo de los receptores de estrógenos con efecto anti-proliferativo en el tejido mamario. Debido al amplio uso y a la incompleta degración, son contaminantes habituales de los medios acuáticos. La dorada es un pez teleósteo marino y una de las especies por excelencia de la acuicultura marina, con un gran valor en la acuicultura mediterránea. Además se ha determinado el papel del receptor de estrógenos asociado a proteína G, GPER1 en la biología de neutrófilos humanos. En primer lugar, hemos evaluado el efecto del EE2 y del Tmx administrados mediante dieta en determinados marcadores de disrupción estrogénica en doradas adultas. Hemos confirmado que el EE2 provoca una respuesta estrogénica y que el Tmx también altera estos marcadores, aunque el efecto fue menos pronunciado. También hemos investigado la capacidad de ambos compuestos de modular la respuesta inmunitaria inducida tras una vacunación así como su capacidad de recuperación tras el cese de la exposición. Los resultados indican que el EE2 y el Tmx inhiben de manera transitoria la inducción de la expresión del gen inteleuquina 1β (IL)-1β e incrementan la producción de intermediarios de oxígeno reactivos (ROIs) en leucocitos de riñón cefálico (RC) de peces vacunados. Por otro lado, el EE2 y el Tmx estimulan la producción de anticuerpos en peces vacunados aunque sólo en los expuestos a Tmx se produjo una alteración del porcentaje de linfocitos (Ly) B inmunoglubulina M positivos (IgM+) en peces durante el periodo de recuperación. Tras observar que el EE2 y el Tmx alteran la respuesta inmunitaria de ejemplares adultos, nos planteamos determinar si estas consecuencias se producen también en juveniles. Además introdujimos el compuesto G1, agonista específico de GPER ya que también altera la respuesta inmunitaria de adultos de dorada. El EE2 y el Tmx, pero no el G1, promueven una respuesta diferente y transitoria en la expresión del gen hepático de la vtg. Aunque estos tres compuestos no afectan la producción de ROIs, provocan la inhibición de la inducción de la expresión del gen il1b, al igual que ocurría en adultos. Destacamos, que a pesar de que el Tmx incrementa el porcentaje de Ly B-IgM+ RC y en bazo durante el periodo de recuperación, la producción de anticuerpos en peces vacunados varía dependiendo del compuesto utilizado y de cuando se produjo la vacunación. Los resultados previos nos llevaron a investigar la influencia del EE2 en la respuesta inmunitaria centrándonos en los Ly y en la actividad humoral tras el cese de la exposición. En concordancia con lo anteriormente observado, el EE2 incrementa la expresión del gen hepático de la vtg. De manera significativa, afecta al porcentaje y a la capacidad de proliferación de los Ly T y B-IgM+. Además, describimos por primera vez que el EE2 induce la producción de anticuerpos y que este efecto está mediado a través de la señalización por GPER1. Finalmente, dado que los estrógenos son capaces de modular funciones de granulocitos en dorada a través de la señalización por GPER, hemos realizado la caracterización funcional de GPER1 en neutrófilos humanos. Estas células expresan GPER1 de manera funcional en la membrana plasmática, ya que tras la activación in vitro con el agonista especígico G1, produjo el incremento de los niveles de transcripción de CFOS, marcador de activación de GPER1. Además incrementa la producción ROIs y altera de manera drástica el perfil de expresión de genes, además de incrementar la viabilidad de neutrófilos humanos a través de diferentes mecanismos de señalización. En definitiva, nuestros resultados muestran por primera vez que la activación de GPER1 produce la polarización de neutrófilos humanos hacia un fenotipo pro-inflamatorio y pone de manifiento la potencia de GPER1 como diana terapéutica en enfermedades inmunitarias en los que los neutrófilos juegan un papel fundamental.
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Estudio de la Capacitación in vitro de espermatozoides epididimarios y eyaculados en la especie porcina
(Universidad de Murcia, 2009-02-12) Sansegundo González, Manuel; Matas Parra, Carmen; Ruiz López, Salvador; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Fisiología
La capacitación espermática puede ser mimetizada in vitro eliminando el plasma seminal por distintos sistemas de lavado. Entre los tratamientos espermáticos empleados habitualmente en los laboratorios para capacitar a los espermatozoides se encuentran los lavados que se realizan con medios enriquecidos con albúmina o a través de gradientes de Percoll. El objetivo de este trabajo ha sido determinar los cambios que acontecen en los espermatozoides (procedentes de epidídimo y eyaculados) sometidos a tres sistemas de capacitación in vitro evaluados mediante una batería de técnicas que determinan distintos estadios de la capacitación espermática.De los resultados obtenidos se desprende que tanto la procedencia de los espermatozoides (epidídimo o eyaculado) como el tratamiento de capacitación al que se les somete afecta en gran medida a los resultados de la penetración in vitro y por lo tanto, la capacitación se produce de manera diferente entre estos grupos. Abstract:Sperm capacitation may be defined as a set of molecular modifications that occurs in the spermatozoa, after maturation in the epididymis, which enables them to fertilize the oocyte. In vitro, this process can be imitated in vitro by separation of the seminal plasma by different systems of washing. Between the sperm treatments routinely used in the laboratories, semen samples are washed of albumin or centrifugations through a Percoll. The aim of this work was examine and characterize the changes that happen in the sperms (from epididymis and ejaculated) submitted to three systems of in vitro capacitation, evaluated by means of a battery of tests to determine different levels of the sperm capacitation. Sperm capacitation was dependent on sperm treatment, whether epididymal or ejaculated and to whichever parameter measured. Nevertheless, all these parameters, in spite of the fact that they have been described as tools to evaluate the sperm capacitation, really are not capable of discriminating or indicating the level of capacitation.
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Estudio de la función de la hormona estimuladora del folículo de lubina: su implicación en la espermatogénesis y sus rutas de señalización intracelular
(2014-12-15) Mazón Moya, Mª José; Zanuy Doste, Silvia; Gómez Peris, Ana; Departamento de Biología Celular e Histología
El proceso reproductivo en peces, al igual que en el resto de vertebrados, está regulado por una cascada hormonal en la que están implicados el cerebro, la hipófisis y las gónadas, conocido como eje CHG. Dos de las principales hormonas implicadas en el control de la reproducción son las gonadotrofinas FSH (hormona estimuladora del folículo) y LH (hormona luteinizante), ambas producidas en la hipófisis y liberadas tras el estímulo con las hormonas liberadoras de gonadotrofinas (GnRH) y con acción a nivel gonadal. Desde la perspectiva de la producción animal en general, y de la acuicultura en particular, es esencial conocer en la especie a domesticar los mecanismos básicos de control endocrino. Este conocimiento básico es de gran utilidad para poder manipular la reproducción a conveniencia y al mismo tiempo poder desarrollar estrategias terapéuticas para solventar problemas de fertilidad que en ocasiones presentan los stocks de reproductores. Sin embargo, como consecuencia de la limitación en la disponibilidad de herramientas para su estudio, para una gran mayoría de las especies cultivables de peces se desconocen los mecanismos particulares que controlan su reproducción. En esta Tesis se optimiza una alternativa nueva de administración de gonadotrofinas recombinantes, la tecnología conocida como transferencia génica somática. En los capítulos 3 y 4 se inyectaron adultos y juveniles de lubina con construcciones de DNA codificante de las gonadotrofinas de cadena única Lh y Fsh, respectivamente, y se evaluó el incremento de estas hormonas en el torrente sanguíneo. En ambos experimentos las inyecciones de DNA se compararon con la inyección directa de la gonadotrofina recombinante correspondiente. Estos capítulos muestran que las construcciones de DNA se incorporan a las células musculares en el lugar de inyección, y las hormonas codificadas son sintetizadas y liberadas al torrente sanguíneo. Los capítulos 3 y 4 confirman que la transferencia génica somática es una herramienta poderosa para realizar estudios funcionales in vivo con gonadotrofinas, siendo además útil como terapia hormonal en peces, presentándose como alternativa a los tratamientos tradicionales con hCG o GnRH. La funcionalidad de las hormonas recombinantes sintetizadas por las células musculares de lubina tras la incorporación del DNA, se determinó estudiando su efecto en el desarrollo de los testículos. En los capítulos 4 y 5 se evaluó como la acción de la Fsh es esencial para iniciar el proceso de espermatogénesis, promoviendo la proliferación de las espermatogonias, siendo necesaria la acción posterior de la Lh para culminar la espermiación. Los individuos inyectados sólo con el plásmido de Fsh presentaron una espermatogénesis parcial, sin indicios de espermiación, estado que sólo alcanzaron aquellos animales que se inyectaron de manera secuencial con los plásmidos de Fsh y Lh. Estos experimentos también demuestran que la Lh por si sola no es capaz de promover la maduración testicular. Además en los análisis de expresión génica se observó que los tratamientos con Fsh incrementaron la expresión de marcadores de células germinales como piwi, pcna y scp3, mientras que el efecto de la Lh se detectó en enzimas esteroidogénicas como cyp17a1 y cyp17a2. En esta Tesis también se describe cómo una de las acciones más directas de la Fsh es la estimulación de la producción de 11KT. Con el fin de analizar más en detalle la acción específica de la Fsh en la activación de la esteroidogénesis, y de definir mecanismos de regulación conservados entre diferentes especies de peces, se estudió in vitro la acción de la Fsh en cultivo primario de testículo y ovario de lubina y pez cebra. En el capítulo 6 se describe cómo la Fsh emplea principalmente la ruta del AMPc/PKA para transmitir su señal una vez activado su receptor, no siendo ésta la única vía, ya que también es importante la actividad de las MAPK. Haciendo uso de inhibidores y estimuladores de ambas rutas se ha perfilado un escenario en el que la Fsh utiliza de manera independiente las rutas del AMPc/PKA o las MAPK para estimular la transcripción de genes implicados en la esteroidogénesis, como star o cyp19a1a ABSTRACT The reproductive process in fish, as in all vertebrate species, is tightly regulated by a hormonal axis, called BPG, involving the brain, pituitary and gonads. Two major hormones that control reproduction are the gonadotropins FSH (follicle-stimulating hormone) and LH (luteinizing hormone) are both produced at the pituitary level, released to the bloodstream after the stimulus of the GnRH (gonadotropin release hormone), and with action at the gonad level. From a fish farming perspective, it is essential to fully understand the endocrine mechanism underlying reproductive performance. This knowledge is important to manipulate reproductive behaviour and for the development of therapeutic strategies aiming to solve fertility issues frequently present in the broodstocks. However, due to the limited tools available for the vast majority of the cultivable species, the mechanisms controlling their reproduction are not well characterized. This thesis describes an alternative administration of recombinant gonadotropins using the technique of somatic gene transfer. In Chapters 3 and 4, adult and juvenile sea bass were injected with a plasmid DNA encoding Lh and Fsh gonadotropin sequences in a single chain form, and the levels of either GtHs were analysed in the bloodstream. In both experiments the plasma levels of GtHs attained by plasmid DNA injected fish were compared with plasma levels of fish injected with the equivalent recombinant GtH. Both Chapters clearly show that plasmid DNA was efficiently incorporated by the cell muscle, and the encoded hormones were synthetized and released to the bloodstream. These results confirm that somatic gene transfer can be a powerful tool for in vivo functional studies of gonadotropin. In addition, this technique can be used for hormone therapy in fish, and can offer a useful alternative to classic treatments with hCG or GnRH. The functionality of the recombinant hormones synthetized by cell muscles after plasmid DNA injection was evaluated by studying the development of testes. Chapters 4 and 5 describe the crucial role of Fsh in starting the process of spermatogenesis, promoting the proliferation of spermatogonia cells, and its requirements for Lh to reach the spermiation process. Fish receiving only Fsh plasmid injections showed partial spermatogenesis, with no evidence for spermiation. Only the fish injected with Fsh and Lh plasmid sequentially reached this late step of the spermatogenesis process. Fish receiving Lh plasmid alone showed that GtH cannot trigger testis maturation alone. Furthermore, gene expression analysis highlighted the action of Fsh on promoting cell proliferation by increasing the expression of germ cell markers such as piwi, pcna piwi, pcna and scp3. By contrast, the effect of Lh was more obvious in transcript levels of steroidogenic enzymes such as cyp17a1 and cyp17a2. This thesis additionally describes a direct action of Fsh on the stimulation of 11KT production. In order to analyse the specific activity of Fsh on the steroidogenesis process in detail, and to define regulatory mechanisms conserved across fish species, the action of Fsh in vitro was studied using primary gonad tissue culture from sea bass and zebrafish. Chapter 6 describes the use of the signalling pathway cAMP/PKA by Fsh to transduce the signal after the activation of its receptor not clear. Importantly, cAMP/PKA is not the only pathway used by Fsh, the MAPk route is also involved in Fsh signal transduction. The use of cAMP/PKA and MAPk inhibitors and stimulators suggest the possibility that Fsh can use both routes independently to activate the transcription of some steroidogenic genes such as star and cyp19a1a
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Estudio de las implicaciones funcionales de la proteína oviductina en la fertilidad y el desarrollo embrionario en hámster dorado y conejo utilizando la tecnología CRISPR-Cas9
(Universidad de Murcia, 2023-10-04) Balastegui Alarcón, Miriam; Avilés Sánchez, Manuel; Izquierdo Rico, María José; Escuela Internacional de Doctorado
La infertilidad es un problema clínico muy extendido que afecta al 8 12% de las parejas en todo el mundo. De ellas, alrededor del 30% son diagnosticadas de infertilidad idiopática. La infertilidad relacionada con el factor femenino representa alrededor del 40-50% de los casos totales de infertilidad. Dentro de los posibles motivos de infertilidad idiopática, cabe destacar las probables alteraciones presentes en genes implicados en la fecundación y el desarrollo embrionario temprano. Así, las causas genéticas constituyen el 5-10% de todas las mujeres infértiles. El oviducto, denominado trompa de Falopio en la especie humana, y en particular el fluido oviductal (FO) crea un microambiente que interviene en procesos claves para la fecundación y la correcta fisiología del gameto y del embrión. La oviductina o glicoproteína oviductal 1 codificada por el gen OVGP1, es la proteína no sérica mayoritaria en el FO, habiendo sido identificada en diferentes especies de mamíferos, incluido el conejo, el hámster y el ser humano. En base a estas premisas el objetivo principal de la presente Tesis Doctoral ha sido comprobar el papel desempeñado por la proteína oviductina en la fecundación y en el desarrollo embrionario temprano, usando como modelos animales KO (del inglés, knock out) las especies hámster dorado (Mesocricetus auratus) y conejo común (Oryctolagus cuniculus). Este estudio ha permitido valorar si la presencia de oviductina es imprescindible para una correcta función reproductiva en estas especies. El segundo objetivo, también relacionado con el gen OVGP1, fue su análisis filogenético en la subfamilia Murinae. Dentro de esta subfamilia encontramos al ratón, que posee una proteína oviductina funcional, y a la rata, donde OVGP1 es un pseudogen. Este análisis ha permitido datar en qué fecha se produjo dicha pseudogenización, así como determinar qué otras especies se ven también afectadas por este proceso dentro de esta subfamilia. El tercer y último objetivo de esta Tesis está relacionado con el bloqueo de la polispermia. La poliploidía es una condición indeseable que provoca el fracaso del desarrollo embrionario. Para evitarla, el bloqueo de la polispermia impide la fecundación del óvulo por más de un espermatozoide. Dependiendo de la especie de mamífero, el bloqueo de la polispermia se produce a diferentes niveles: el oolema, la zona pelúcida (ZP) o ambos. En el bloqueo de la polispermia a nivel de la ZP, la proteasa ovastacina y la proteína ZP2 desempeñan un papel crucial. En el caso del conejo, el bloqueo de la polispermia se produce a nivel del oolema. Por tanto, el propósito científico ha sido determinar el mecanismo responsable de este proceso, para ello mediante análisis genómico se estudió la existencia de una pseudogenización del gen ASTL, gen codificante de la proteína ovastacina, en lagomorfos. Para el primer objetivo, se comenzó con la caracterizaron de ambos modelos animales KO para OVGP1 mediante experimentos de biología molecular y proteómica. A continuación, se analizó la fertilidad in vivo determinando si la ausencia de la proteína oviductina desencadena alteraciones de la fertilidad en estas especies. Para valorar los motivos causales de dichas alteraciones se realizó un estudio histológico de oviducto, un análisis del desarrollo embrionario preimplantacional, así como un análisis transcriptómico comparado de oviducto y embriones. Para el segundo objetivo se analizó mediante PCR la secuencia genómica del gen Ovgp1 en 22 especies de la subfamilia Murinae, obteniendo el árbol filogenético que nos permite datar la pseudogenización de Ovgp1 en esta subfamilia. Para el tercer objetivo se analizó mediante PCR la secuencia genómica de ASTL en 9 especies de lagomorfos determinando la pseudogenización de ASTL. En conclusión, los modelos animales KO para OVGP1 presentados en esta Tesis han demostrado que la proteína oviductina es esencial para un correcto desarrollo embrionario en hámster, pero no en conejo. El análisis filogenético del gen Ovgp1 en la subfamilia Murinae ha permitido datar su pseudogenización hace aproximadamente 12,5 millones de años, viéndose afectadas, a parte de la rata, otras especies pertenecientes a la tribu Rattini. Finalmente, el análisis genómico de ASTL en lagomorfos ha confirmado su pseudogenización en estas especies, pudiendo ser el motivo por el cual el bloqueo de la polispermia no se produce a nivel de la ZP en estas especies.
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Estudio del ciclo reproductor de la ostra del Mar Menor, "Ostrea edulis L" : aspectos histológicos e influencia de los factores ambientales /Emilia Abellán Martínez ; directoras Concepción Ferrer Cazorla ; Adelina Zuasti Elizondo.
(Murcia : Universidad de Murcia, Facultad de Medicina, Departamento de Biología Celular,, 1994) Abellán Martínez, Emilia
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Estudio del reconocimiento y la unión entre gametos en la especie bovina (Bos taurus) : Papel del ácido siálico en la interacción espermatozoide-zona pelúcida / José Guillermo Velásquez Penagos ; dirección, Pilar Coy Fuster, Manuel Avilés Sanchez.
(Murcia : Universidad de Murcia, Facultad de Veterinaria, Area de Fisiología Veterinaria, Departamento de Fisiología,, 2004) Velásquez Penagos, José Guillermo
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Estudio molecular de la glicoproteína oviductal OVGP1 y su efecto en la fecundación y el desarrollo embrionario in vitro en la especie porcina (Sus scrofa) y bovina (Bos taurus)
(2016-09-06) Algarra Oñate, Blanca; Avilés Sánchez, Manuel; Jiménez Movilla, María; Facultad de Veterinaria
Se ha considerado el oviducto como un mero conducto para gametos y embriones durante muchos años, pero numerosos estudios realizados en las últimas décadas han demostrado que está involucrado en importantes procesos que son necesarios para la correcta fisiología de gametos y embriones. Además, el oviducto es el lugar donde tiene lugar la fecundación y el desarrollo embrionario temprano. Gametos y embriones están en contacto con el fluido oviductal (FO) durante su paso a través del oviducto. El FO es un fluido complejo que contiene numerosos compuestos metabólicos y una gran variedad de proteínas. Podemos destacar la proteína oviductal dependiente de estrógenos (OVGP1), también llamada oviductina o mucina-9, como la glicoproteína mayoritaria del FO. Análisis de la secuencia de OVGP1 han mostrado que existe un alto grado de identidad y similitud en el extremo N-terminal de OVGP1 entre las diferentes especies de mamíferos, mientras que el grado de identidad y similitud es bajo en el extremo C-terminal de la misma. La comparación de las secuencias de aminoácidos de OVGP1 entre especies revela la existencia de cinco regiones diferentes (A-E). Todas las proteínas OVGP1 de mamíferos contienen la región A, pero difieren en la presencia/ausencia de otras regiones en el extremo C-terminal. A pesar de la existencia de datos sobre la contribución de OVGP1 en la fisiología reproductiva, todavía no se conoce el mecanismo molecular mediante el que actúa. Por esta razón, en este estudio se realiza una valoración acerca del papel de OVGP1 y su extremo C-terminal en fecundación. Para investigar la función de OVGP1 y su extremo C-terminal, se realizó la clonación de varias proteínas: OVGP1 porcina nativa, OVGP1 de coneja y OVGP1 porcina truncada en la región D y cada una de las regiones A, D y BD de manera individual. Después de la expresión y purificación de las proteínas, fueron utilizadas para realizar ensayos moleculares y fisiológicos. En este trabajo observamos que OVGP1 se unía a la zona pelúcida (ZP) de ovocitos porcinos madurados in vitro (MIV) a través de la región A de su extremo N-terminal y se mostró que su extremo C-terminal modula esta unión, modificando la morfología externa del ovocito. También observamos que la región A no estaba involucrada en la unión especie-específica entre OVGP1 y la ZP. Se detectó OVGP1 en el interior de cuerpos multivesiculares del citoplasma de ovocitos porcinos MIV, sugiriendo la posible endocitosis de la proteína. Por el contrario, la eliminación de la región D del extremo C-terminal impedía la endocitosis. Por otro lado, se ha descrito OVGP1 como el componente del FO responsable del endurecimiento frente a la digestión proteolítica de la ZP. En este trabajo, se mostró que el extremo C-terminal de la proteína es responsable de modular este endurecimiento. Además, se utilizó OVGP1 como suplemento durante la fecundación in vitro (FIV), produciéndose un incremento significativo en el porcentaje de monospermia y en la eficiencia de fecundación, que dependía de la presencia de la región D del extremo C-terminal. De igual manera, se observó un efecto positivo al utilizar OVGP1 como suplemento durante la FIV o el cultivo in vitro (CIV), mientras que al suplementar ambos procesos, el efecto en el rendimiento del sistema bovino era negativo. Por el contrario, esta suplementación en ambos procesos mejoró la calidad de los embriones obtenidos, ya que se detectó un incremento en la expresión de algunos genes relacionados con el desarrollo embrionario temprano. Por todo ello, OVGP1 podría ser un componente idóneo a ser utilizado en los medios sintéticos para mejorar las técnicas de reproducción asistida. Oviducts have long been considered mere conduits for gametes and embryos, but numerous studies performed in recent years have demonstrated that the oviduct is involved in several important processes that are necessary for the correct gamete and embryo physiology. Moreover, the oviduct is the site of fertilization and early cleavage of the zygote. During their trip through the oviductal tube, gametes and early embryos are bathed in oviductal fluid (OF). This complex fluid contains many metabolic compounds and a great variety of proteins. The major non-serum glycoprotein present in the OF is the estrogen-dependent oviductal protein (OVGP1), also named oviductin or mucin-9. Analysis of the sequence shows that the N-terminal region of the mature polypeptide OVGP1 has a high degree of identity and similarity among the species. However, C-terminal regions show a low degree of identity and similarity, with several insertions/deletions in their sequence. Comparison of the amino acid sequences of several mammalian OVGP1 reveals the existence of five different regions (A-E). All mammalian OVGP1 proteins possess region A but differ in the length of the core proteins and therefore the presence/absence of the other regions in C-terminal position. Despite the robust data obtained concerning the contribution of OVGP1 in reproductive physiology in different species, the molecular mechanism that would explain its role remains to be established. For this reason, this study makes a molecular and physiological assessment of the role of OVGP1 and its C-terminal region in fertilization. To investigate the role of OVGP1 and its C-terminal region, several proteins were cloned: full length porcine OVGP1 including regions A, B and D; rabbit OVGP1 including regions A, B and D, wich was almost absent, and porcine OVGP1 which was truncated in the D region. In order to analyze the molecular implications of the different OVGP1 regions, each region of the porcine protein was also cloned. The presence of recombinant protein was confirmed by immunoblot after expression and purification and these proteins were used to carry out molecular and physiological experiments. We showed that OVGP1 were able to bind to the zona pellucid (ZP) of in vitro maturated (IVM) porcine oocytes trought the N-terminal A region of the protein. This study has shown that the A region is not involved in the species-specific binding property when the OVGP1 cross-reactivity between species was analysed. Besides, we showed that C-terminal of OVGP1 modulates the binding to the ZP and the surface morphology of oocyte. OVGP1 was detected within multivesicular-like bodies located inside of the IVM porcine oocytes, suggesting that pOVGP1 was endocytosed by the oocyte. By contrast, deletion of the c-terminal D region prevented OVGP1 endocytosis. Moreover, OVGP1 has been referred to the OF component involved in enzymatic ZP hardening. Here, we proved that OVGP1 C-terminal is responsible for modulating this hardening. Besides, using OVGP1 as a supplementary component in in vitro fertilization (IVF) of the porcine system we noticed a significant increase in the percentage of monospermy and in the fertilization efficiency, whose final output depended on the presence of the carboxy-terminal D region of OVGP1. We also showed that incubation with OVGP1 during IVF or in vitro culture (IVC) had a positive effect in the bovine system, while supplementation in both processes had a negative effect on the final blastocyst output. Nevertheless, such incubation in both IVF and IVC improved embryo quality, because OVGP1 increased the expression of some genes involved in early embryo development. Consequently, OVGP1 would seem to be suitable for incorporation into the synthetic medium to improve assisted reproductive technologies.