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Activación por lípidos de proteínas quinasas C
(2014-02-07) Egea Jiménez, Antonio Luis; Gómez Fernández, Juan Carmelo; Corbalán García, María Senena; Facultad de Veterinaria
1. OBJETIVOS  Determinación de la función del dominio regulador C2 de la PKCα en la activación provocada por Ca2+, PtdSer y PIP2.  Caracterizar la interacción entre los dominios C1B de las PKC nuevas y fosfolípidos negativos, su especificidad y su dependencia de DOG y PtdOH.  Caracterizar los residuos aminoácidos involucrados en la interacción entre el dominio C1Bε y fosfolípidos negativos (PtdSer, PtdOH y cardiolipina). 2. METODOLOGÍA  Clonación de los dominios C1Bs de las isoenzimas de PKC nuevas (Ɵ, η, δ, ε) y clásica (γ) en vector de expresión de células de mamíferos (pECFP) para estudiar las interacciones lípido-proteína existentes entre ellos a diferentes concentraciones de fosfolípidos negativos, diacilglicerol y forbol-12-miristato acetato a través de la técnica de transferencia de energía por resonancia (FRET).  Purificación de la proteína PKCα silvestre y del mutante del clúster rico en lisinas de esa misma isoenzima utilizando el sistema de expresión de baculovirus para la realización de ensayos de actividad quinasa en presencia de fosfato radiactivo (ATP-32γ) a diferentes concentraciones de calcio, diacilglicerol, fosfatidilserina y PIP2. 3. RESULTADOS DE LA TESIS DOCTORAL 3.1. El phosphatidilinositol 4,5-Bifosfato disminuye la concentración de Ca2+, fosfatidilserina y diacilglricerol requerida para la activación de la PKCα. Los resultados obtenidos en este trabajo son compatibles con el mecanismo secuencial previamente propuesto en nuestro grupo y posteriormente confirmado in vivo. Básicamente, el incremento intracelular en la concentración de Ca2+ es el desencadenante de la translocación de la PKCα a la membrana plasmática. Una vez se llega a este punto, se pueden presentar dos situaciones: en microdominios enriquicidos únicamente con fosfatidilserina, el docking del dominio C2 no es suficiente para liberar el el dominio catalítico del sitio de unión a substrato, como ha sido visto en la estructura 3D recientemente resuelta, el dominio C1B permanecería bloqueando el dominio catalítico. Por todo ello, la presencia de diacilglicerol en las vesículas permite el acoplamiento de al menos el dominio C1A, permitiendo a la enzima su total activación. Una segunda situación puede ser dada cuando los microdominios están enriquecidos con fosfatidilserina y PIP2 en la membrana plasmática. En este caso el dominio C2 se acopla con una diferente orientación ya que se ancla en dos diferentes puntos: Ca2+/PS y PIP2, lo que podría inducir a un cambio conformacional que libera el dominio C1 de la conformación de bloqueo y permite que el substrato tenga acceso al sitio catalítico de la enzima, con la consecuente activación completa de la enzima. 3.2. Los dominios C1B de las PKC nuevos ε Y η tienen una mayor afinidad de unión a membranas que las PKC nuevas θ Y δ. Nuestros resultados muestran que los dominios C1B de las PKCs nuevas tienen diferentes afinidades de unión por membranas modelos, dependiendo de la presencia o no de diacilglicerol y de específicos fosfolípidos negativos. Esto es también observado en células RBL-2H3, en las cuales se han expresado los diferentes dominios C1B. Con todo ello podemos hacer dos grupos de dominios C1B de PKCs nuevas de acuerdo a sus afinidades en unión a membranas: por un lado los dominios C1B de las PKCε y PKCη con una gran afinidad de unión a membranas y aquellos con una baja afinidad, los dominios. 3.3.- Rol de los residuos con carga positiva localizados en el dominio C1Bε y su implicación en la unión de membranas. Los aminoácidos con carga positiva presentes en la parte superior del dominio C1Bε están involucrados en la interacción membrana-proteína Concretamente la lisina K251 y las argininas 268, 282 y 283, y R283, y así ha quedado de manifiesto cuando la substitución de estos residuos por alanina reduce de manera significante la afinidad de unión en los mutantes simples, incrementando en los dobles, hasta anularse por completo en los mutantes triples, incluso en presencia de diacilglicerol. Title: ACTIVATION BY LIPIDS OF PROTEIN KINASE C 1. OBJECTIVES  Determination of the importance of PIP2 in the activation of PKCα through its C2 domain in presence of different lipids and concentrations of calcium ion.  Characterization of the different binding affinities of C1B domains of novel PKCs, their specificity and dependence by DOG and negatively charged phospholipids.  Identification of the amino acidic residues involved in the interaction of C1Bε domain with negatively charged phospholipids. 2. METHODOLOGY  Recombinant DNA cloning of C1B domains and sub cloning to expression vector (pECFP-N). Using the FRET method, the binding of C1B domains to small unilamellar vesicles containing different lipid compositions was studied.  Baculovirus expression system for PKCα production and purifcation by FPLC. The wild type PKCα and the mutant of the lysine-rich cluster were used in assays of kinase activity using radioactive isotopes. 3. RESULTS 3.1. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate decreases the concentration of Ca2+, phosphatidylserine and diacylglycerol required for protein kinase C α to reach maximum activity. The results obtained in this work are compatible with the sequential mechanism previously described in our laboratory. Basically, intracytosolic Ca2+ elevations are the trigger to translocate PKCα to the plasma membrane. Once there, two situations can be found: in microdomains enriched only with phosphatidylserine, the docking of the C2 domain is not enough to liberate the catalytic domain for substrate access, and as seen in the 3D structure recently solved, the C1B domain might still keep blocking the catalytic domain. Due to this, the presence of DAG in the lipid vesicles by docking at least the C1A domain enables the enzyme to gain its full activation. A second situation can be found when the microdomains are enriched in phosphatidylserine and PIP2 at the plasma membrane. In this case, the C2 domain docks in a different orientation since it has to anchor through two different points, i.e. the CBR (Ca2+/PS) and the lysine rich cluster (PIP2), this might induce a conformational change that unleash the C1 domain from the blocking conformation and enables the catalytic domain to access the substrate and consequently full activation of the enzyme. 3.2. The C1B domains of novel PKCε and PKCη have a higher membrane binding affinity than those of the also novel PKCδ and PKCθ. Our results show that the C1B domains from novel PKCs have different binding affinities for model membranes depending on the presence or not of diacylglycerol and of specific anionic phospholipids, and this is also observed in RBL-2H3 cells in which the different C1B domains were expressed. According to these data, two groups of C1B domains from novel PKCs can be established as a function of their membrane binding affinity: those from PKCε and PKCη with a higher membrane binding affinity and those with PKCδ and PKCθ with a low affinity. 3.3. Role of positive charged amino acid residues in the C1B domain of PKCε on membrane translocation and enzymatic activity. The importance of the C1B domain of PKCε for the translocation to the membrane and activation of the enzyme has been broadly confirmed in this work, and in particular, the presence of 4 positively charged amino acid residues present on the top of the domain. These residues would be able to lead the interaction of the C1B domain to the membranes and the punctual mutations that were generated in them, were important enough to decrease the membrane affinities of the C1B domains in FRET studies and the translocation to plasma membrane of the full-length protein in stimulations of RBL-2H3 cells, as well as its enzymatic activity.
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Adecuación de las declaraciones de propiedades saludables en suplementos alimenticios deportivos a la legislación europea y evidencia científica
(Universidad de Murcia, 2025-01-08) Rodríguez Hernández, María Dolores; Gil Izquierdo, Ángel; Escuela Internacional de Doctorado
La utilización de productos ergogénicos que promueven un rendimiento físico mejor se ha convertido en un negocio lucrativo, son utilizados por los atletas en sus programas de entrenamiento y a veces, como alternativas para contrarrestar la falta de entrenamiento y compromiso. Los beneficios que ofrecen los suplementos no siempre se consiguen, sobre todo por la confusión existente en la publicidad que apoya y convence de los beneficios ergogénicos de varias sustancias. En Europa, los suplementos alimenticios deportivos (SAD) están condicionados por leyes y reglamentos específicos. Hasta el 70% de los deportistas son altamente influenciados por la información presente en la etiqueta o publicidad del SAD, que en muchas ocasiones la información, como las declaraciones de propiedades saludables, no se corresponde con la evidencia científica. En el estudio 1 se ha analizado las declaraciones de las bebidas de reposición (BR) presentes en los mensajes comerciales, realizando un estudio observacional y transversal basado en el análisis de contenido y grado de adecuación de las declaraciones de propiedades saludables indicadas en el etiquetado o ficha técnica de las BR con las establecidas por la legislación europea vigente según los dictámenes de la EFSA. La búsqueda fue a través de Amazon y Google Shopping. Se evaluaron 114 declaraciones de propiedades saludables, entre los resultados se obtuvo que ninguna declaración se adecuaba de manera total a las recomendaciones. 14 declaraciones (n= 13 productos) se adecuaban casi a las recomendaciones, siendo las de “mantener el nivel de resistencia en ejercicios que requieren una resistencia prolongada”, “mejoran la absorción de agua durante el ejercicio físico” y “mejora del rendimiento físico durante un ejercicio físico de alta intensidad y duración en adultos entrenados”, representando el 12.3% del total (n=114). La gran mayoría de las declaraciones identificadas indican una causa-efecto no demostrada debiendo ser modificadas o eliminadas. En el estudio 2 se ha analizado las declaraciones de propiedades saludables de los suplementos alimenticios deportivos a base de proteínas, realizando un estudio observacional y transversal basado en el análisis de contenido y grado de adecuación de las declaraciones de propiedades saludables indicadas en el etiquetado o ficha técnica de los suplementos alimenticios deportivos a base de proteínas con las establecidas por la legislación europea vigente y la evidencia descrita hasta la fecha actual. Además, el diseño del estudio como el desarrollo del manuscrito, siguió la declaración STROBE. La búsqueda de los productos de la muestra se realizó en octubre 2023 a través de las plataformas de compras web Amazon y Google Shopping. Estos sitios web fueron seleccionados porque son los principales sitios web de compras online. De las 209 declaraciones de propiedades saludables evaluadas, 60 declaraciones se adecuan de manera total a las recomendaciones, siendo “Las proteínas contribuyen a que aumente la masa muscular” “Las proteínas contribuyen a conservar la masa muscular” “Las proteínas contribuyen al mantenimiento de los huesos en condiciones normales”, representando el 28.7% del total (n=209). Frente a 12 declaraciones donde el texto de la declaración indicada no se ajusta a las declaraciones de propiedades saludables establecidas por la EFSA, representando el 5.7% del total (n=209). Las declaraciones de salud no autorizadas más usadas en el mercado son referente a “Recuperación post-entrenamiento” encontrándose en un 11.1%. Seguido de “Favorece la recuperación muscular (caseína)”, encontrándose cada una en el 9.5%. Referidas a la proteína de suero, y a la caseína, respectivamente. De todos los productos analizados en el estudio, el 43.8% (n=46) de los productos nombran declaraciones de salud no autorizadas por la EFSA. Teniendo en cuenta todos los resultados, podríamos decir que las declaraciones de propiedades saludables presentes en los suplementos alimenticios deportivos analizados, bebidas de reposición y suplementos con proteínas, deben adecuarse firmemente a los criterios establecidos por la legislación europea, los documentos de consenso y la evidencia científica. El fraude alimentario se encuentra en diversas formas dentro de la publicidad, el marketing y la comercialización de los alimentos, afectando fuertemente a los consumidores.
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Advances in the identification and development of biomarkers for health and welfare assessment: a One- Health perspective
(Universidad de Murcia, 2021-04-22) Franco Martínez, Lorena; Martínez Subiela, Silvia; Tvarijonaviciute, Asta; Escuela Internacional de Doctorado
El objetivo principal de esta tesis doctoral fue aumentar el conocimiento sobre la identificación, medición y validación de nuevos biomarcadores de salud y bienestar que pueden usarse en diferentes contextos dentro del concepto de One Health (OH). Además, se priorizó el uso de muestras no invasivas como la saliva siempre que fue posible. Bajo esta premisa se utilizaron diferentes especies: humanos; perros ya que en ocasiones son empleados como modelos de enfermedades humanas; vacas que son propensas a sufrir mastitis, que es una enfermedad de gran importancia dentro del concepto OH; y peces y mejillones que aunque son especies filogénicamente alejadas de las anteriores se usan habitualmente en los programas de biomonitorización ambiental y por ello son de gran interés dentro del concepto OH. Los objetivos específicos de la tesis doctoral fueron: (1) Realizar una revisión del estado del arte sobre la búsqueda y validación de nuevos biomarcadores en diferentes especies y tipos de muestra, bajo las aplicaciones del concepto OH. (2) Realizar estudios proteómicos y bioquímicos en diferentes situaciones clínicas o experimentales para el descubrimiento de nuevos biomarcadores. Los estudios en humanos y mejillones se centraron en situaciones de daño muscular, mientras que los estudios en perros y vacas se hicieron en relación con diferentes enfermedades interesantes dentro del concepto de OH por su prevalencia o importancia clínica. Además, el modelo de evaluación medioambiental se realizó en peces y mejillones, ya que estás especies se emplean comúnmente como centinelas de la calidad medioambiental. (3) Identificar un biomarcador común mediante la aplicación del concepto de OH y desarrollar un sistema rápido para su medición. Para la consecución del objetivo 1 se realizaron dos revisiones de la literatura, describiendo las potenciales ventajas de la adopción del concepto OH desde el punto de vista de un laboratorio de análisis clínicos, así como las principales técnicas analíticas usadas en el estudio de saliva tanto en humanos como en animales. Además, se evaluó el nivel de conocimiento sobre OH en alumnos de 2º de Veterinaria de la Universidad de Murcia antes y después de la realización de un módulo sobre OH basado en el aula invertida y se describen los cambios que se producen en algunos biomarcadores tras la filtración de partículas y la depleción de la proteína alfa amilasa. Para el abordaje del objetivo 2 se realizaron estudios bioquímicos y proteómicos en suero y saliva de diversas especies con el fin de detectar biomarcadores de utilidad en diversas situaciones. El modelo de daño muscular se basó en el estudio de un modelo de daño inducido en mejillón para determinar si podría utilizarse como modelo animal y en el posible daño muscular producido por el ejercicio en personas. Se identificaron cambios en la expresión de diversas proteínas tanto mediante proteómica como mediante análisis bioquímico en ambos casos. El modelo de enfermedades comprende leishmaniosis, parvovirosis, piometra, tumores mamarios y diabetes mellitus en perros, así como mastitis en vacas. Estos estudios permitieron la identificación de más de 6700 proteínas, observando diferencias estadísticamente significativas en más de 400 proteínas en relación a su grupo control. En el tercer modelo centrado en biomonitorización ambiental, los estudios en mejillones se centraron en validar 9 métodos automáticos para la medición de biomarcadores y observar si éstos podían ser de utilidad para detectar los efectos provocados por contaminantes o hipoxia. En peces, se validaron cortisol, actividad esterase (EA), capacidad oxidante total (TOS) y capacidad antioxidante total (TAC) y se utilizaron para analizar los efectos de contaminantes derivados de la industria farmacéútica. Para la consecución del objetivo 3 de esta Tesis doctoral se consiguió identificar y purificar CRP en mejillones por primera vez y se validó analíticamente el uso de un método comercial para la medición de CRP humana en muestras de mejillón, mostrando su potencial aplicabilidad en el campo de la biomonitorización ambiental. Una batería de anticuerpos monoclonales para la detección de CRP, con el objetivo posterior de desarrollar un sistema rápido de detección de inflamación, fue también desarrollada. De la discusión de los resultados obtenidos en esta Tesis doctoral se pueden derivar seis conclusiones. 1. El concepto One Health puede ser aplicado a las condiciones de laboratorio mediante el uso de un mismo biomarcador en diferentes especies, tipos de muestra y enfermedades. 2. Las muestras no invasivas como la saliva y el moco cutáneo son biofluidos de gran valor analítico ya que son capaces de mostrar cambios en su composición tras condiciones de daño muscular, enfermedades o hipoxia. 3. Los estudios relacionados con el daño muscular permitieron la identificación de un potencial panel de biomarcadores para su diagnóstico en muestras de saliva de humanos y en hemolinfa de mejillón, incluyendo lactato, actina, tropomiosina y cistatina-B. 4. Los estudios proteómicos realizados en perros y vacas mostraron que tanto el suero como la saliva pueden proporcionar una valiosa información clínica en diversas enfermedades como parvovirosis, leishmaniosis, piometra, diabetes mellitus, tumores de mama y mastitis. Más de 6700 proteínas fueron identificadas en estos estudios y más de 400 fueron diferencialmente moduladas en estas situaciones, proporcionando una gran batería de posibles biomarcadores para estas enfermedades. 5. Ciertos biomarcadores empleados en medicina humana para la evaluación del estrés oxidativo pueden aplicarse en otras especies como peces y mejillones para la biomonitorización de los efectos fisiológicos asociados a contaminación ambiental. Las características de estos biomarcadores (rápidos, económicos, sensibles, accesibles, automáticos y requieren poco volumen de muestra) los hacen viables para su uso en programas de biomonitorización ambiental relacionados con contaminación o hipoxia. 6. La proteína C-reactiva ha sido identificada y descrita en mejillones por primera vez en esta Tesis doctoral. Además, se han producido una serie de anticuerpos monoclonales con afinidad con la proteína C-reactiva canina, que podrían dar pie a la creación de un sistema rápido y portátil de medición de CRP en distintas especies para la detección de inflamación.
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Animales transgénicos para producción de proteínas humanas
(Universidad de Murcia, 2014) Sánchez, Araceli; Gadea Mateos, Joaquín
Con la aparición en los años ochenta de los animales transgénicos se abrió un amplio e importante campo de estudio, ya que estos animales pueden ser utilizados como modelos de investigación de enfermedades humanas, como donantes de órganos o para producir en ellos proteína de interés. La industria farmacéutica vio, en este último uso de los animales transgénicos, una gran oportunidad para la producción de proteínas humanas a bajo coste. Este método presentaba numerosas ventajas frente a los anteriores métodos de producción de proteínas. A diferencia de las proteínas producidas en hongos, bacterias y plantas, las proteínas producidas en animales transgénicos sufren modificaciones postraduccionales completas y son totalmente activas. Además la obtención de dichas proteínas conllevaría muy bajo coste una vez producido el animal transgénico, a diferencia del elevado coste de la producción en cultivos de celulares a gran escala. Pese a estas ventajas, problemas éticos del uso de animales, así como posibles consecuencias para la salud humana, han hecho que desde hace algunos años la investigación en estos animales para producir en ellos proteínas haya disminuido considerablemente. En este artículo se hace una revisión de los diferentes métodos de producción tanto de proteínas como de animales transgénicos. Nos centraremos finalmente en la producción de proteínas en la glándula mamaria, como principal tejido de producción, así como ejemplos de estas proteínas producidas.
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Aplicación de Alfa/Beta hidrolasas en la síntesis y resolución de compuestos de interés farmacéutico / Silvia Montoro García; directores, Alvaro Sánchez Ferrer, Francisco García Carmona.
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular,, 2010) Montoro García, Silvia
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Aportaciones al estudio de proteinas vegetales / Josefina Sánchez Rojas Fenoll ; director Simón Navarro Blaya.
(Murcia : Universidad de Murcia, Facultad de Ciencias,, 1975) Sánchez-Rojas Fenoll, Josefina
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Aspectos del proceso hidrolítico ácido de proteínas
(Murcia : Universidad de Murcia, Sevicio de Publicaciones, 1971) Navarro Blaya, Simón; Sánchez-Rojas Fenoll, Josefina; García, A.L.; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Bioquímica y Biología Molecular A
Se aplican a albúmina de buey condiciones de hidrólisis acida concretadas a dos temperaturas y distintos tiempos. Las condiciones que parecen más adecuadas cuando se pretende determinar los contenidos aminoacídicos aparentes son: 110°C y 16 horas. Para los reales, se obtienen resultados análogos a 110°C, 32 horas y a 145°C, 12 horas.
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Avances en el conocimiento de la cromogranina A y otros biomarcadores salivares de estrés en cerdos= Advances in the knowledge of chromogranin A and other salivary biomarkers of stress in pigs
(2014-12-01) Escribano Tortosa, Damián; Cerón Madrigal, José Joaquín; Gutiérrez Montes, Ana María; Martínez Subiela, Silvia; Facultad de Veterinaria
Esta tesis doctoral, por compendio de artículos, ha sido diseñada con el fin de producir avances en la medición de biomarcadores de estrés y para desarrollar y validar un panel de biomarcadores salivares para evaluar los diferentes sistemas fisiológicos (simpático-adrenomedular (SAM), hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA), hipotálamo-pituitario-gonadal (HPG) y sistema inmune) que participan en el mecanismo de estrés. Para ello, los objetivos de esta tesis son los siguientes: desarrollar y validar un ensayo inmunofluorométrico a tiempo resuelto (TR-IFMA) para las mediciones de cromogranina A (CgA) salivar porcina, utilizando un anticuerpo específico de la especie, y evaluar su comportamiento como posible biomarcador del sistema SAM en un modelo de estrés agudo. Además, estudiar si las concentraciones de CgA salivar exhiben un patrón circadiano durante el día, y evaluar su estabilidad bajo diferentes condiciones de almacenamiento. Por otra parte, validar inmunoensayos disponibles comercialmente para la cuantificación de cortisol (biomarcador del sistema HPA), testosterona (biomarcador del sistema HPG) e IgA (biomarcador del sistema inmune) en la saliva de los cerdos. Evaluar la respuesta de un panel de varios biomarcadores salivares tanto del sistema inmune como del sistema neuroendocrino a la administración repetida de Escherichia coli lipopolisacárido (LPS) y, por último, investigar la respuesta de todo este grupo de biomarcadores salivares después de aplicar un modelo de estrés psicosocial en cerdos basado en el aislamiento y el reagrupamiento. En cuanto a la metodología empleada, los anticuerpos policlonales específicos producidos para el desarrollo del TR-IFMA fueron obtenidos mediante la inmunización con un péptido recombinante de proteína CgA porcina. La precisión, exactitud y sensibilidad analítica del TR-IFMA desarrollado y de los inmunoensayos comerciales empleados fueron evaluadas mediante los coeficientes de variación intra- e interensayo, la linealidad bajo dilución y el porcentaje de recuperación, el límite de detección y los límites de cuantificación. Para estudiar la respuesta de los biomarcadores salivares frente al estrés se emplearon modelos en los que los animales fueron inmovilizados con un acial o transportados a matadero. Tomando muestras de saliva antes y después de aplicar dichos estímulos estresantes. Por otro lado, en el caso de la administración de LPS, los cerdos que fueron utilizados recibieron tres dosis de LPS en intervalos de 48 h. Las muestras de saliva fueron tomadas antes de la administración de LPS y 3 h después de cada una de las administraciones. Por otra parte, en el modelo de aislamiento y reagrupamiento todos los animales se adaptaron a la vida en grupo durante 5 días, después de lo cual, un grupo de cerdos fueron sometidos al procedimiento de aislamiento, donde los animales permanecieron sin contacto físico con otros cerdos durante 5 días. Después, los cerdos del ensayo se reagruparon de nuevo durante 3 días, regresando a las condiciones iniciales. Los cerdos controles permanecieron en las mismas condiciones durante todo el estudio. Las muestras de saliva se tomaron diariamente, a la misma hora, y un muestreo adicional fue realizado a los 30 min tras los procedimientos de aislamiento y reagrupado. En general, nosotros podemos concluir de este trabajo que: el TR-IFMA desarrollado permite la cuantificación de CgA en muestras de saliva porcina de una forma precisa, exacta y sensible y su concentración aumenta significativamente después de una situación de estrés agudo. Además, no ha sido detectado un patrón circadiano para la CgA salivar y este biomarcador fue bastante estable, siendo posible su almacenamiento hasta un año a -20ºC o -80ºC. Por otra parte, los inmunoensayos comerciales validados para las concentraciones de cortisol, testosterona e IgA pueden ser utilizados para su uso en muestras de saliva de cerdos con una buena precisión, sensibilidad y exactitud. En cuanto a la administración de LPS, una sola administración en cerdos produce incrementos de IgA salivar y cortisol. Sin embargo, administraciones repetidas solo producen incrementos en IgA mientras que el cortisol retorna a valores basales. No se observaron variaciones en las concentraciones de CgA ni con una sola administración ni con administraciones repetidas. Finalmente, el uso de un panel de biomarcadores salivares podría ser esencial en la investigación de estrés, ya que estos reaccionan de manera diferente a diversos tipos de factores estresantes. En el caso del aislamiento, CgA e IgA parecen ser marcadores más sensibles que el cortisol y la testosterona, mientras que después del proceso de reagrupado, el cortisol, la testosterona y la CgA parecen ser marcadores más sensibles que la IgA. Abstract This PhD thesis, for compendium of articles, was designed in order to produce advances in the measurement of salivary biomarkers of stress and to develop and validate a panel of salivary biomarkers to evaluate the different physiological systems (sympatho-adrenomedullary (SAM), hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA), hypothalamus-pituitary-gonadal (HPG) and immune system) that are taking part in stress mechanism. To this end, the objectives of this thesis are: to develop and validate a time-resolved immunofluorometric assay (TR-IFMA) for porcine salivary chromogranin A (CgA) measurements, using a species-specific antibody, and evaluate its behaviour as a potential biomarkers of SAM system in an acute stress model. In addition, to study if salivary CgA concentrations exhibit any circadian pattern during the daytime, and to evaluate its stability under different storage conditions. Moreover, validate commercially available immunoassays for cortisol (HPA system biomarker), testosterone (HPG system biomarker) and IgA (immune biomarker) quantification on the saliva of pigs. To evaluate the response of a panel of several salivary biomarkers both of immune system as well as of the neuroendocrine system to repeated administration of Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) and, finally, to investigate the responses of this group of salivary biomarkers after applying a psychosocial stressor model in pigs based on isolation and regrouping. Regarding the methodology, polyclonal antibodies specific for the development of TR-IFMA were produced in rabbits immunized with a recombinant protein peptide of CgA porcine. Precision, accuracy and analytical sensitivity of the TR-IFMA developed and of the commercial immunoassays used were evaluated by the coefficients of variation intra- and inter-assay, linearity under dilution and the percentage of recovery, limits of detection and limits of quantitation. To study the stress response of salivary biomarkers, models in which the animals were immobilized with a nose-snare or transported to slaughterhouse were used. Saliva samples were taken before and after of applying these stressful stimuli. On the other hand, in the case of LPS administrations, the pigs were selected to receive three doses of LPS at 48 h intervals. Saliva samples were taken prior to any LPS administration and at time points corresponding to 3 h after each injection. Moreover, in the model of isolation and regrouping all animals were adapted to group living for 5 days, after which time, pigs in one group were subjected to the isolation procedure, where each animal had not physical contact with other pigs during 5 days. After, test pigs were regrouped again during 3 days returning to the initial conditions. Control pigs were remained in the same housing condition during the entire experimental period. Saliva samples were taken daily, at the same time, and one sampling was carried out at 30 min after of isolation and regrouping events. In overall, we can conclude of this work that: the TR-IFMA developed allows the quantification of CgA in porcine saliva samples in a precise, accurate and sensitive way and its concentrations increase after an acute stress situation. In addition, no circadian pattern has been detected for salivary CgA and this biomarker was fairly stable being able to be stored till 1 year at -20ºC or -80ºC. Moreover, the commercial immunoassays validated for cortisol, testosterone and IgA concentrations can be suitable for its use in saliva samples of pigs with a good precision, sensitivity and accuracy. In relation to LPS administrations, a single administration in pigs produces increases of salivary IgA and cortisol. However, repeated administrations only produced increases in IgA whereas cortisol returned to baseline values. No variation in CgA concentrations were observed neither in single nor in repeated LPS administration. Finally, the use of a panel of salivary biomarkers would be essential in stress research, since these react differently to various types of stressors. In the case of isolation, CgA and IgA appear to be more sensitive markers than cortisol and testosterone, whereas after the process of regrouped, cortisol, testosterone and CgA seem to be more sensitive markers than IgA.
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Caracterizació molecular y funcional de Gbp4 de pez cebra : un nuevo componente del inflamasoma= Molecular and functional chraterization of zebrafish Gbp4: a new inflammasome component
(2015-09-08) Tyrkalska, Sylwia Dominika; Mulero Méndez, Victoriano Francisco; Escuela Internacional de Doctorado
INTRODUCCIÓN: La señalización a través de los NOD-like receptors (NLRs), que son una familia de receptores citosólicos de reconocimiento de patrones (PRRs), da lugar al procesamiento y activación de las citoquinas pro-inflamatorias IL-1 β e IL-18 mediados por caspasa-1, así como de la inducción de una forma de muerte celular recientemente descrita llamada piroptosis. Para ello, los NLRs median la formación de plataformas multiproteicas de señalización llamadas inflamasomas, que alertan al sistema inmune de la presencia de infección o daño tisular. OBJETIVOS: (1) Establecimiento de un modelo de infección de Salmonella Typhimurium en pez cebra para estudiar la activación, el ensamblaje y el funcionamiento del inflamasoma; (2) Caracterización del papel de la flagelina de S. Typhimurium en el mecanismo de infección en pez cebra; (3) Caracterización del papel de Gbp4 de pez cebra en la activación y ensamblaje del inflamasoma, así como en la eliminación de S. Typhimurium; (4) Caracterización del papel de los neutrófilos en la eliminación de S. Typhimurium dependiente de Gbp4 en pez cebra; (5) Caracterización del papel de Gbp4 en la producción de prostaglandinas dependiente del inflamasoma, y del de las prostaglandinas en la eliminación de S. Typhimurium. METODOLOGÍA: Los métodos utilizados en la tesis doctoral son: Ensayos de infección con S. Typhimurium, ensayos de actividad caspasa-1, toma de imágenes de larvas de pez cebra, reclutamiento de neutrófilos y análisis de la muerte celular, ensayos de luminescencia, citometría de flujo, análisis de expresión génica, Western blot, ensayo de reconstitución del inflamasoma en células HEK293. RESULTADOS: Aquí demostramos que la proteína Gbp4 de pez cebra, una enzima GTPasa inducible por IFNγ que alberga un dominio C-terminal CARD, se expresa en los neutrófilos y es necesaria para la eliminación de Salmonella Typhimurium in vivo dependiente del inflamasoma. A pesar de la presencia del dominio CARD, Gbp4 requiere la presencia de la proteína adaptadora Asc para desempeñar su función antibacteriana. Además, la actividad GTPasa de Gbp4 es indispensable para la activación del inflamasoma, el reclutamiento de neutrófilos al lugar de la infección, y la eliminación de S. Typhimurium. La reconstitución de los complejos Gbp4-Asc en células embrionarias humanas de riñón (HEK293) en cultivo, nos mostró que forman complejos macromoleculares con un anillo exterior de Asc y un núcleo de Gbp4. Mecanísticamente, Gbp4 es esencial para la liberación de prostaglandinas dependiente del inflamasoma, de las cuales PGD2 se asocia con la eliminación de bacterias mediada por Gbp4. Por tanto, nuestros resultados señalan a las proteínas de unión con GTPasa como los adaptadores clave del inflamasoma necesarios para la biosíntesis de prostaglandinas y la eliminación de bacterias intracelulares por los neutrófilos in vivo. CONCLUSIONES: (1) El pez cebra es un excelente modelo para estudiar la activación y la función del inflamasoma en respuesta a una infección por S. Typhimurium; (2) El reconocimiento intracelular de S. Typhimurium en pez cebra depende altamente de la producción de flagelina; (3) La activación del inflamasoma dependiente de Gbp4 mejora la resistencia de las larvas de pez cebra e incrementa la actividad caspasa-1 después de la infección con S. Typhimurium; (4) Tanto Gbp4 mutante que carece de la actividad GTPasa, como el doble mutante al que también le falta el dominio CARD, se comportan como dominantes negativos, incrementando la susceptibilidad a S. Typhimurium y, en paralelo, reduciendo la actividad caspasa-1; (5) El mutante de Gbp4 sin el dominio CARD actúa, al igual que GBP5 de mamíferos, rescatando la elevada susceptibilidad de las larvas deficientes en Gbp4, pero no aumenta la actividad caspasa-1 después de la infección con S. Typhimurium en pez cebra; (6) Gbp4 regula el reclutamiento de neutrófilos al lugar de infección y, además, la eliminación de S. Typhimurium dependiente de Gbp4 esta mediada por los neutrófilos; (7) El inflamasoma dependiente de Gbp4 activa la biosíntesis de las prostaglandinas, que a su vez fomentan la eliminación de S. Typhimurium. INTRODUCTION: The nucleotide-binding domain leucine-rich repeats (NLRs) constitute a family of cytosolic pattern recognition receptors (PRRs), which are the responsible for the caspase-1-mediated processing and activation of pro-inflammatory cytokines, such us IL-1 β and IL-18, and the induction of a recently described form of cell death called pyroptosis. NLRs achieve these functions by forming multiprotein signaling platforms, called inflammasomes, which alert the immune system about the presence of infection or tissue damage. OBJECTIVES: Taking that into consideration, the objectives of the present work are: (1) Establishment of a zebrafish – Salmonella Typhimurium infection model to study inflammasome activation, assembly and function; (2) Characterization of the role of flagellin of S. Typhimurium in the infection mechanism in zebrafish; (3) Characterization of the role of zebrafish Gbp4 in inflammasome activation, assembly and clearance of S. Typhimurium; (4) Characterization of the role of neutrophils in the Gbp4-dependent clearance of S. Typhimurium in zebrafish; (5) Characterization of the role played by the Gbp4 inflammasome in prostaglandin production and S. Typhimurium clearance. METHODOLOGY: The following methods were used in this doctoral thesis: yolk sac or ear infection assays with S. Typhimurium, caspase-1 activity assays of infected larvae, counting of neutrophils using different zebrafish transgenic lines with fluorescent neutrophils using live imaging, neutrophil recruitment assays, cell death analysis, luminescence assays for the measurement of Il1-β contents, flow cytometry and FACS-sorting of fluorescent cells, gene expression analysis, western blot, inflammasome reconstitution assays in HEK293 cells. RESULTS: Here we report that zebrafish Gbp4, an IFNγ-inducible GTPase harboring a C-terminal CARD domain, is expressed in neutrophils and is required for the inflammasome-dependent clearance of Salmonella Typhimurium in vivo. Despite the presence of the CARD domain, Gbp4 requires the universal inflammasome adaptor protein Asc for mediating its antibacterial function. In addition, the GTPase activity of Gbp4 is indispensable for the inflammasome activation, the neutrophil recruitment and the clearance of S. Typhimurium. Reconstitution of Gbp4-Asc complexes in human embryonic kidney cells (HEK293) revealed a macromolecular complex with an outer ring of Asc and an core of Gbp4. Mechanistically, Gbp4 is essential for the inflammasome-dependent release of prostaglandins, of which PGD2 is associated with the Gbp4-mediated bacterial clearance. Our results, therefore, point to GTPase-binding proteins as the key inflammasome adaptors required for prostaglandin biosynthesis and intracellular bacterial clearance by neutrophils in vivo. CONCLUSIONS: The above results suggest that: (1) Zebrafish is an excellent model to study inflammasome activation and function upon S. Typhimurium infection; (2) Intracellular recognition of S. Typhimurium in zebrafish highly depends on flagellin production; (3) Gbp4-dependent inflammasome activation improves zebrafish larvae resistance and increases caspase-1 activity upon S. Typhimurium infection; (4) A Gbp4 mutant lacking GTPase activity, as well as a double GTPase and CARD mutant, behave as dominant negatives by increasing the susceptibility to S. Typhimurium and, in parallel, decreasing caspase-1 activity; (5) A Gbp4 mutant lacking the CARD domain acts as mammalian GBP5; that is, rescues the higher susceptibility of Gbp4-deficient larvae but fails to increase caspase-1 activity upon S. Typhimurium infection in zebrafish; (6) Gbp4 regulates neutrophil recruitment to the site of the infection. In addition, the Gbp4-dependent clearance of S. Typhimurium is mediated by neutrophils; (7) The Gbp4-dependent inflammasome activates prostaglandin biosynthesis, which in turn promotes S. Typhimurium clearance.
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Caracterización de la estructura y función de la rabfilina 3A
(Universidad de Murcia, 2018-04-13) Pérez Sánchez, María Dolores; Corbalán García, María Senena; Gómez Fernández, Juan Carmelo; Escuela Internacional de Doctorado
En el desarrollo de esta Tesis Doctoral se han caracterizado estructural y funcionalmente los dominios C2 de la Rabfilina 3A. Esta proteína contiene dos dominios C2, C2A y C2B dispuestos en tándem y existen evidencias de su participación en el proceso de exocitosis y fusión vesicular a través de su capacidad de interaccionar con el complejo SNARE. Esta proteína controla el proceso de recaptación de nuevas vesículas, siendo la interacción con el SNAP25 un paso regulador clave. Los estudios bioquímicos y biofísicos han demostrado que cada uno de los dominios C2 presentan un modo diferente de unión a calcio, así como diferentes afinidades por los fosfoinosítidos, lo que podría implicar una diferencia en la regulación de la transmisión sináptica y los procesos de secreción de vesículas. El comportamiento en tándem de los dominios C2AB de rabfilina 3A presenta un comportamiento característico que se ha estudiado mediante técnicas biofísicas, bioquímicas y de biología molecular. Mediante el estudio de la proteína silvestre y el desarrollo de construcciones mutantes se ha caracterizado el modo de unión de esta proteína a la membrana y al complejo SNARE. Mediante calorimetría de titulación isotérmica (ITC) se ha determinado que el dominio C2A de rabfilina 3A se une principalmente a la membrana formadas por POPC/POPS/PI(4,5)P2 por la región rica en lisinas del dominio. El aumento de calcio en el sistema permite anclar al dominio por otra zona del mismo, la región de unión a calcio. Los puntos de unión del dominio C2B permanecen bloqueados por la disposición relativa de ambos dominios, quedando accesible la hélice H2, principal zona por la que la proteína es capaz de interaccionar con el complejo SNARE. El dominio C2AB de rabfilina 3A no es capaz de formar agregados por si sólo, pero la presencia de vesículas formadas por fosfolípidos permite que los dominios de la proteína se unan de forma dependiente de calcio a dos membranas acercando a ambas observándose un aumento en el tamaño de los agregados cuando son estudiados mediante dispersión dinámica de la luz (DLS). Con microscopía electrónica de transmisión se ha corroborado el tamaño de estos agregados visualizándose la potencial capacidad de fusión de vesículas. Mediante mutaciones se ha determinado que la zona del conector entre ambos dominios podría actuar como freno de la capacidad de agregación, porque cuando los residuos son mutados la capacidad de agregación se ve aumentada de manera significativa. Otro punto de control en la capacidad de formar agregados se encuentra en los lazos de unión a calcio del dominio C2A, actuando como punto de control positivo de la unión del dominio a la membrana. La obtención de la estructura cristalina del dominio C2B de rabfilina con SNAP25 ha permitido determinar los residuos clave en la interacción. Mediante la combinación de diferentes técnicas bioquímicas y biofísicas se ha propuesto que los dominios C2AB dispuestos en tándem son capaces de coordinar calcio y PI(4,5)P2 por la zona de unión a calcio y de la región rica en lisinas; mientras que se une al SNAP25 a través de la hélice H2 del dominio C2B. Se ha determinado que la interacción entre C2AB de rabfilina 3A y SNAP25 ocurría también con los complejos SNAP25/STX1A y SNAP25/STX1A/VAMP2. Esta unión es dependiente de calcio y precisa del dominio completo para que tenga lugar esta interacción. Con todos estos resultados se propone un modelo que trata de explicar cómo la rabfilina 3A participa en el proceso de fusión vesicular con la cooperación de calcio y PI(4,5)P2.This PhD thesis deals with both the structural and functional characterization of the C2 domains of Rabphilin 3A. This protein contains two C2 domains, C2A and C2B, located in tandem. There are some precedents that show the participation of this protein in several processes such as exocytosis or vesicle fusion due to its ability to interact with the SNARE complex. Rabphilin 3A controls the process of recaption of new vesicles, being the interaction with SNAP25 the key regulation step of the overall process. Several biochemical and biophysical studies have demonstrated that each of the C2 domains shows a different mode to bind to calcium, as well as different affinities for phosphoinositides, what could imply a difference in the regulation of the synaptic transmission and the processes related to vesicle secretion. The tandem domain C2AB has a characteristic behaviour markedly different form that of the independent C2A and C2B domains, which has been studied through biophysical, biochemical, and molecular biology techniques. The comparison of the behaviour of the wild type protein with several mutant constructs have served to characterize the binding mode of this protein to the membrane and the SNARE complex. The isothermal titration calorimetry (ITC) technique has been used to determine that the C2A domain of the Rabphilin 3A binds to the membranes formed by POPC/POPS/PI(4,5)P2 mainly through its lysine-rich cluster. The presence of calcium in the media allows the anchoring of the domain to the lipid membrane through a different region, also called the calcium-binding region. The binding areas of the C2B domain remain blocked due to the relative tandem orientation of the two domains in the C2AB structure, being accessible the H2 helix, which in turn becomes the main area able to interact with the SNARE complex. The C2AB domain of Rabphilin 3A is not able to form aggregates on its own, but the presence of vesicles containing phopholipids allows that the domains of the proteins bind to two membranes in a calcium-dependant manner, hence bringing them together and provoking the enlargement of the size of the aggregate particles. This experimental fact can easily observed by analyzing the sample with the dynamic light scattering (DLS) technique. The use of transmission electronic microscopy has corroborated the size of these aggregates, visualizing the potential ability of this protein to fuse vesicles. The generation of mutant constructs have served to determine that the linker among both domains could hamper the aggregation ability, since a mutation on the aminoacid residues of the linker provoked a significant enhancement of the binding capability. Another checkpoint of the ability to bind membrane was found in the loops of the calcium binding region of the C2A domain, acting as a positive control checkpoint of the binding of the domain to the membrane. The determination of the crystal structure of the C2B domain of Rabphilin 3A interacting with SNAP25 has allowed the identification of the key residues involved in this interaction. A combination of several biophysical and biochemical techniques have been used to propose that the tandem C2AB domains are able to coordinate calcium and PI(4,5)P2 through the calcium-binding region and the lysine rich cluster, while the binding to the SNAP25 takes place through the H2 helix of the C2B domain. In addition, it has been determined that the interaction observed of the C2AB of Rabphilin 3A and SNAP25 also occurs in the complexes SNAP25/STX1A and SNAP25/STX1A/VAMP2. This binding is calcium-dependant and needs the whole domain to happen. With all these results in mind we have proposed a model to explain how the Rabphilin 3A participates in the vesicle fusion process along with the cooperation of calcium and PI(4,5)P2.
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Caracterización funcional de la tiorredoxina Trxo1 de Pisum sativum y Arabidopsis thaliana : estudio en germinación y bajo condiciones inductoras de estrés oxidativo
(2015-05-22) Ortíz Espín, Ana María; Sevilla Valenzuela, Francisca; Jiménez Hurtado, Ana Mª; Camejo López, Daymi Mercedes; Facultad de Biología
Las tiorredoxinas (Trx) son proteínas pequeñas y ubicuas implicadas en la reducción de los enlaces disulfuro de sus proteínas diana. El grupo de las Trxs está organizado en distintas clases. Los animales cuentan con sólo dos tipos, una citoplasmática y otra mitocondrial. En plantas hay, al menos, diez familias de TRXs con más de 40 miembros presentes en casi todos los compartimentos celulares. En mitocondrias vegetales sólo se han descrito dos tipos de Trxs; la Trxh en álamo (Populus) y la Trxo1 en Arabidopsis (A. thaliana) y guisante (Pisum sativum), donde ha sido también co-localizada en el núcleo. En esta Tesis hemos llevado a cabo diferentes aproximaciones experimentales con el fin de estudiar con detalle algunas de las posibles funciones de la Trxo1 en células vegetales. En primer lugar, hemos identificado posibles proteínas diana nucleares de PsTrxo1 a través de la utilización de técnicas de cromatografía de afinidad. La identificación de la proteína PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular) y el componente regulador de rutas de ácido abcísico, el receptor de pirabactina 1 (PYR1) establece nuevas funciones para la PsTrxo1 relacionadas con la síntesis de ADN, ciclo celular, metabolismo hormonal y respuesta al estrés. Otra de las funciones descubiertas para esta Trxo1 durante esta Tesis ha sido su papel durante la germinación de la semilla de Arabidopsis. Ensayos de expresión de AtTrxo1 han señalado un alto nivel durante la germinación, particularmente en el embrión de las semillas sugiriendo un papel para AtTrxo1 durante la movilización de reservas en este proceso. Además, ensayos de germinación mostraron que las semillas del mutante KO AtTrxo1 germinaban antes que las semillas silvestres (Wt) en condiciones salinas, si bien, bajo condiciones estándar de crecimiento, ambos genotipos germinaban y se desarrollaban normalmente sugiriendo la importancia de la Trxo1 en el proceso germinativo y la adaptación a la salinidad. La escasa información relativa a la regulación transcripcional de las Trxs vegetales nos condujo en la búsqueda de elementos cis-trans en el promotor de AtTrxo1. Para ello, se realizaron estudios filogenéticos donde se identificaron seis elementos en cis-funcionalmente relevantes que fueron validados por ensayos de β-glucuronidasa. Posteriormente, los ensayos de un híbrido en levadura nos permitieron identificar más de 30 factores de transcripción pertenecientes a seis familias diferentes como posibles reguladores de la expresión de AtTrxo1. Entre ellos, bZIP9 mostró una fuerte interacción con pAtTrxo1 y se comportó como un posible regulador positivo de AtTrxo1, mientras que AZF2, un factor de dedo de zinc fuertemente relacionado con la respuesta a salinidad, se mostró como un posible represor. Finalmente, se iniciaron estudios de muerte celular. Para ello, utilizamos cultivos de células TBY-2 que sobre-expresaban PsTrxo1 y H2O2 como un inductor de PCD (Programmed Cell Death). La respuesta de las células dependió de la intensidad del tratamiento aplicado. Una concentración 15 mM H2O2 provocó una ligera disminución en la viabilidad del cultivo celular sin diferencias entre líneas. Sin embargo, concentraciones superiores a 35 mM causaron un efecto diferenciador sobre la viabilidad de ambas líneas y la línea sobre-expresante murió varios días después que la línea control. En este sentido, las células sobre-expresantes presentaron un menor estrés oxidativo y diferentes marcadores de PCD que justificaron el retraso observado en la muerte celular. En conclusión, estos resultados podrían sugerir la implicación de PsTrxo1 en la tolerancia de TBY-2 a un tratamiento con H2O2 y en el proceso de muerte celular desarrollado en estas condiciones. ABSTRACT Thioredoxins (Trxs) are ubiquitous small proteins involved in the reduction of disulfide bonds of target proteins. Trxs´ group is organized in different types. Animals contain only two types, one cytoplasmic and one mitochondrial. In plants there are at least ten families of Trxs with more than 40 members present in almost all the cellular compartments. In plant mitochondria only two types of Trx have been described, Trxh found in Populus and Trxo1 type in Arabidopsis (A. thaliana) and pea (Pisum sativum), where it has been also co-localized in the nucleus. In this thesis we have carried out different experimental approaches in order to study in greater depth some of the possible functions of the Trxo1 in plant cells. Firstly, we have identified specific potential nuclear targets of PsTrxo1 using affinity chromatographic techniques. The identification of PCNA protein (Proliferating Cell Nuclear Antigen) and the pyrabactin resistance 1 (PYR1) regulatory component of abscisic acid (ABA) receptor establishes new functions of PsTrxo1 related to DNA synthesis, cell cycle, hormonal metabolism and stress response. The role of Trxo1 in seed germination has been studied in this Thesis. Expression assays of AtTrxo1 pointed out a high level during germination, particularly in seeds embryo suggesting the feasible role of AtTrxo1 in storage proteins mobilization occurring in this process. In addition, germination tests showed that mutant seeds (KO AtTrxo1) germinated earlier than wild type seeds (Wt) in saline conditions, although under standard growth conditions, both genotypes germinated and developed normally, suggesting the importance of Trxo1 in germination and adaptation to salinity. The scarce information on the transcriptional regulation of plant Trxs led us to search cis-trans elements in the promoter of AtTrxo1. For this purpose, phylogenetic studies were done and six cis-functionally relevant elements were found. These elements were validated performing tests of β-glucuronidase. Subsequently, one hybrid assays in yeast allowed us to identify more than 30 transcription factors belonging to six different families showed as feasible regulators of AtTrxo1 expression. Among them, bZIP9 showed a strong interaction with pAtTrxo1 and it was identified as a positive regulator, while AZF2, a transcription factor strongly related with salinity response, was identified as a feasible AtTrxo1 repressor. Finally, we initiated different studies on the possible involvement of Trxo1 in cell death. We used overexpressing PsTrxo1 TBY-2 cell cultures and H2O2 as a PCD (Programmed Cell Death) inductor. The response of cells depended on the severity of the treatment. A concentration of 15 mM H2O2 caused a slight decrease in the viability of the cell culture with no differences between control versus overexpressing line. However, concentrations above 35 mM caused a differentiating effect on the viability and the over-expressing line died several days after the control line. In this situation, over-expressing cells presented lower oxidative stress and several PCD markers justifying the observed delay in cell death. In conclusion, these results could suggest the involvement of PsTrxo1 in TBY-2 of H2O2 treatment and in the cell death process developed in these conditions.
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Chemical modification of proteins, applications in inmobilization, catalytic performance and fluorescent labeling = Modificación química de proteínas, aplicaciones en inmovilización, actividad catalítica y marcaje fluorescente
(2017-05-15) Hernández García, Samanta; García Carmona, Francisco; García García, Mª Inmaculada; Facultad de Biología
Esta tesis doctoral titulada “Modificación química de proteínas, aplicaciones en inmovilización, actividad catalítica y marcaje fluorescente” tiene como objetivo desarrollar metodologías de modificación química de proteínas y aplicaciones de las mismas. La tesis se ha dividido en cuatro bloques en cada uno de los cuales se aborda una metodología de modificación de proteínas y se propone una o más aplicaciones de la metodología. En un primer bloque de contenido se plantea mejorar la tecnología de inmovilización “sin soporte”: CLEAs (cross-linked enzyme aggregates) usando reactivos diepóxido para unir entre si las proteínas. El método de fabricación de epoxy-CLEAs se estudió y optimizo con la metodología de superficie de respuesta, obteniéndose epoxy-CLEAs estables y activas. Las expoxy-CLEAs se fotografiaron mediante microscopia tomográfica. El método de fabricación también se aplicó a la fabricación de CLEAs magnéticas. Los agregados conservan igualmente la actividad catalítica y tienen la ventaja de poder ser retirados del medio de reacción usando un imán de neodimio, facilitando la purificación del producto final y el reusó del biocatalizador. En el segundo bloque la lacasa de Trametes versicolor inmovilizó sobre soportes de sílice o dentro de los poros de los soportes, tanto comerciales como sintetizados en el laboratorio. Se preparó así un biocatalizador de lacasa que se aplicó a la síntesis de dos fenoxiazonas: Curie 22 y el ácido cinabarinico. En un tercer bloque se propone la modificación directa de nanopartículas magnéticas (9-12 nm). Estas partículas son funcionalizadas directamente por sustitución nucleofílica con haluros orgánicos. Usando las nanopartículas funcionalizadas se propone un método sostenible para obtener un acetato de bencilo seminatural en un sistema libre de disolvente, usando lipasas inmovilizadas sobre las partículas. El cuarto y último bloque es la aplicación de derivados fluorescentes sintetizados en el laboratorio para aplicarlos en biología molecular y celular. Se han sintetizado compuestos incorporando moléculas fluorescentes a reactivos que tienen algún tipo de afinidad con proteínas. Los compuestos se han usado para marcar proteínas en medio líquido, teñir geles de acrilamida, cuantificar proteínas y teñir células, obteniéndose resultados alentadores. ABSTRACT This doctoral thesis entitled “Chemical modification of proteins, applications in immobilization, catalytic performance and fluorescent labeling.” aims to develop methodologies of chemical modification of proteins and applications thereof. The thesis has been divided into four sections in each of which a methodology of protein modification is addressed and one or more applications of the methodology are proposed. In a first section, is proposed to improve the "carrier-free" immobilization technology: CLEAs (cross-linked enzyme aggregates) using diepoxide reagents to bind proteins together. The epoxy-CLEAs manufacturing method was studied and optimized with the response surface methodology, obtaining stable and active epoxy-CLEAs. The expoxy-CLEAs were photographed by tomographic microscopy. The manufacturing method was also applied to the fabrication of magnetic CLEAs. The aggregates also retain the catalytic activity and have the advantage of being remove from the reaction medium using a neodymium magnet, facilitating the purification of the final product and the reuse of the biocatalyst. In the second section the laccase from Trametes versicolor was immobilized on silica supports or inside the pores of the supports, both commercial and synthesized in the laboratory. A laccase biocatalyst was thus prepared which was applied to the synthesis of two phenoxiazones: Curie 22 and cinnabarinic acid. In a third section a direct modification of magnetic nanoparticles (9-12 nm) is proposed. These particles are functionalized directly by nucleophilic substitution with organic halides. Using the functionalized nanoparticles a sustainable method to obtain a semi-natural benzyl acetate in a solvent-free system is proposed, using lipases immobilized on the particles. The fourth and final section is the application of fluorescent derivatives synthesized in the laboratory for application in molecular and cellular biology. Compounds incorporating fluorescent molecules and compounds with some kind of affinity with proteins have been synthesized. The compounds have been used to label proteins in liquid media, to stain acrylamide gels, to quantify proteins and to stain cells, obtaining encouraging results.
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Composición físico-química del queso colonial(Brasil)
(Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 2004) Pianta, C.; López Díaz, T. María; García Fernández, María C.; Facultad de Veterinaria
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Conferencia: 'Proteínas estructurales y no estructurales de virus con envuelta'
(2010-05-21) Urbina, Luis
Conferencia: 'Proteínas estructurales y no estructurales de virus con envuelta'. José Villalaín Boullón, Universidad Miguel Hernández, Elche. Facultad de Biología. Campus de Espinardo.
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Conferencia: 'RMN. Determinación de estructuras de biomacromoléculas: proteínas y ácidos nucleicos'
(2010-04-20) Urbina, Luis
Conferencia: 'RMN. Determinación de estructuras de biomacromoléculas: proteínas y ácidos nucleicos'. María de los Ángeles Jiménez López, CSIC. Madrid. Organiza: Vicerrectorado de Investigación. Facultad de Química. Campus de Espinardo.
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Control diferencial de la ruta de MAP quinasas de integridad celular por GTPasas de la familia Rho en Schizosaccharomyces pombe
(2014-09-08) Sánchez Mir, Laura; Cansado Vizoso, José; Soto Pino, Teresa; Facultad de Biología
Las rutas de señalización mediadas por MAP quinasas (MAPK) tienen un papel fundamental en la respuesta de células eucariotas frente a estímulos ambientales. La levadura con fisión Schizosaccharomyces pombe representa un modelo particularmente adecuado para abordar estudios básicos sobre dichas rutas de señalización, debido a la gran homología funcional que existe entre sus circuitos reguladores y los de organismos superiores. En S. pombe, la ruta de MAPKs de integridad celular (CIP) participa en la regulación de numerosos procesos biológicos como la construcción de la pared celular, la citocinesis, la morfogénesis, la fusión de vacuolas durante el estrés hipotónico, y la homeostasis iónica mediante la modulación de la activación de la MAPK Pmk1 en respuesta a cambios en las condiciones ambientales. Aunque la GTPasa Rho2 es el principal activador de la ruta de integridad celular a través del ortólogo de PKC Pck2, Pmk1 puede ser activada en ausencia de ambos dependiendo de la naturaleza del estímulo recibido, lo que indica la existencia de elementos reguladores adicionales aguas arriba del módulo de MAPKs. Se ha propuesto a la GTPasa Rho1 como candidata para tal función, mientras que el ortólogo de PKC Pck1 parece regular negativamente la actividad de la CIP. Hemos investigado el posible papel de Rho1 y Pck1 como reguladores de la CIP empleando un mutante hipoactivo de Rho1 (rho1-596) y un mutante carente de Pck1 en distintos fondos genéticos. Las evidencias obtenidas mostraron que Rho1 y Pck1 son activadores de la ruta adicionalmente a Rho2 y Pck2, lo que pone de manifiesto la naturaleza ramificada de los mecanismos de señalización que actúan aguas arriba del módulo de MAPKs. Por otra parte Rho2 se localiza en la membrana plasmática y en el área de división celular, y es farnesilada in vivo en el motivo -CAAX de su extremo C-terminal, siendo esta modificación esencial para su localización y función activadora de la CIP. Sin embargo, la presencia de un residuo de cisteína previo al motivo -CAAX sugiere que Rho2 podría encontrarse palmitoilada en dicho residuo. Para estudiar la relevancia biológica de la palmitoilación de Rho2 creamos una serie de cepas que expresan versiones mutantes tanto de Rho2 como de Rho1 afectadas en lipidación, y estudiamos su localización y función biológica. Los resultados obtenidos permitieron concluir que en la levadura con fisión, la GTPasa Rho2 es palmitoilada in vivo, siendo esta modificación crítica para su correcta localización en membrana plasmática y para ejercer su regulación de la morfogénesis y la ruta de integridad celular. Por último, son numerosos los estudios que han puesto de manifiesto la importancia de la localización subcelular de los componentes de los módulos de MAP quinasas en la respuesta a estrés. En el caso de la ruta de integridad celular, la MAPK Pmk1 muestra una localización núcleo/citoplasmática constitutiva, así como en el huso mitótico, el corpúsculo polar del huso, y en el septo durante la separación celular. Sin embargo, a diferencia del modelo descrito en ERK1/2 en mamíferos, el patrón de localización de Pmk1 no se modifica en respuesta a estrés, lo que indica que tanto la forma activa como inactiva de la MAP quinasa son capaces de entrar en el núcleo. En base a esto, nos planteamos el estudio de la relevancia biológica de la localización nuclear de Pmk1 sobre su función biológica. Para ello recurrimos a la caracterización de mutantes de S. pombe que expresan una versión de Pmk1 anclada a la membrana plasmática y excluida del núcleo constitutivamente en distintos fondos genéticos. Los resultados mostraron que aunque la localización nuclear de Pmk1 en Schizosaccharomyces pombe no es crítica para ejercer la mayor parte de sus funciones biológicas, sí es necesaria para la regulación transcripcional en respuesta al estrés de pared celular, lo que revela la importancia del control espacio-temporal de la actividad de las MAPKs en los organismos eucariotas. SUMMARY Mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways play a fundamental role in the response of eukaryotic cells to environmental changes. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe has emerged as an excellent model organism to study mechanisms and cellular events linked to MAPK activation, given the significant functional homology between their regulatory circuits and those of higher cells. In S. pombe the cell integrity pathway (CIP) participates in multiple biological processes like cell wall construction, vacuole fusion during hypotonic stress, cytokinesis, morphogenesis, and ionic homeostasis by fine tuning of MAPK Pmk1 activation in response to various environmental conditions. Although the small GTPase Rho2 is a main positive regulator operating upstream the CIP through protein kinase C ortholog Pck2, Pmk1 can still be activated in the absence of either Rho2 or Pck2 depending on the nature of the stimulus, suggesting the existence of additional upstream regulatory elements to modulate its activity. The essential GTPase Rho1 is a candidate to control the activity of the CIP, whereas Pck1 appears to negatively regulate Pmk1 activity. To study the role of Rho1 GTPase and PKC ortholog Pck1 in the CIP, we characterized a S. pombe mutant that expresses hypomorphic Rho1 allele (rho1-596) and a mutant lacking Pck1 in distinct genetic backgrounds. The evidences obtained in this study revealed that Rho1 and Pck1 are positive upstream activators of the CIP in addition to Rho2 and Pck2 during cell growth and cell wall stress. This model shows the branched nature of the upstream signal network that regulates the CIP. Rho2 positively regulates the CIP and is involved in the control of cell polarity and cell wall biosynthesis in fission yeast. Rho2 locates along the plasma membrane and the division area and it has been described that becomes farnesylated in vivo at its -CAAX motif. This lipid modification appears essential for both localization and function within the MAPK pathway. Moreover, there is a second conserved cysteine residue upstream the Rho2 CAAX motif which might be palmitoylated in vivo like other Rho GTPases such as human RhoB. To investigate the role of palmitoylation in Rho2-signaling we constructed rho2Δ strains expressing the wild type, unpalmitoylated, or unprenylated versions of Rho2 as well as Rho2 chimeras fused to the carboxyl end from the essential GTPase Rho1, and we study their location and Rho2-dependent signalling within the CIP. Our results showed that in fission yeast Rho2 becomes palmitoylated in vivo and this modification is required for plasma membrane localization and proper signaling to the CIP. Pmk1 is constitutively localized in both cytoplasm and nucleus, as well as in the mitotic spindle and septum during cytokinesis. However, contrary to the current model for ERK1/2, its localization pattern appears unaffected by its activation status. In this context, we questioned the biological significance of nuclear localization of MAPK Pmk1. We have addressed this issue by characterization of mutants expressing Pmk1 versions excluded from the cell nucleus and anchored to the plasma membrane in different genetic backgrounds. We have found that nuclear localization of Pmk1 is not critical to exert their biological functions, although its presence in the nucleus is necessary for transcriptional regulation under cell wall stress. These evidences highlight the relevance of the spatial/temporal activity control of MAPK activity in eukaryotes.
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Determinación de proteínas en hojas de Citrus. II. Extracción, fraccionamiento y cuantificación.
(Murcia : Universidad, Servicio de Publicaciones, 1984) Sánchez-Rojas, J.; García, A.L.
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Determinación de proteínas en hojas de Citrus. I. Métodos e interferencias
(Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 1984) García, A.L.; Sánchez-Rojas, J.; Facultad de Biología
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Efecto del 17a-etinilestradiol sobre el sistema inmunitario y reproductor de la dorada (Sparus aurata L.). Caracterización funcional del receptor de estrógenos asociado a proteína G = Effect of 17a-ethinylestradiol on inmune and reproductive system of the gilthead seabream (Sparus aurata L.). Functional characterization of the G protein-couplet estrogen receptor
(2013-09-04) Cabas Sánchez, Isabel; García Ayala, Alfonsa; Mulero Méndez, Victoriano Francisco; Meseguer Peñalver, José; Facultad de Biología
OBJETIVOS: 1. Evaluar la capacidad del EE2 de provocar una respuesta estrogénica en vivo en ejemplares macho de dorada 2. Evaluar la capacidad del EE2 de alterar la fisiología y la respuesta inmunitaria local de la gónada 3. Evaluar la habilidad del EE2 de alterar la respuesta inmunitaria sistémica, analizando actividades inmunitarias de leucocitos de riñón cefálico, el perfil de expresión de macrófagos y la capacidad en vivo de responder a un reto inmunológico. 4. Realizar una caracterización funcional del receptor de estrógenos asociado a proteína G tanto in vitro como in vivo. METODOLOGÍA: Se llevo realizó una experimentación in vivo e in vitro. Se usaron ejemplares sanos de dorada (Sparus aurata L.), especie hermafrodita protándrica y de puesta estacional, mantenidos en el Centro Oceanográfico de Murcia (IEO, Mazarrón, Murcia). La experimentación in vivo se llevo a cabo exponiendo a los ejemplares a EE2 o G1 a diferentes dosis y tiempos. En algunos casos, la exposición se simultaneó con una inmunización programada. A continuación, se realizaron, entre otros, análisis de supervivencia, de calidad del esperma, histológicos, determinación de hormonas e IgM en suero, de expresión génica y de citometría de flujo. La experimentación in vitro se desarrollo, principalmente, tratando con leucocitos de riñón cefálico con EE2 o G1 (para la activación específica de la señalización de GPER para su caracterización funcional) a diferentes dosis y tiempos y analizando actividades inmunitarias como fagocitosis y explosión respiratoria y el perfil de expresión génica. CONCLUSIONES: 1. La exposición in vivo a EE2 promueve una respuesta estrogénica evidente caracterizada por un descenso en el IGS, alteración en los niveles séricos de E2, T y 11KT y una inducción en la expresión hepática de vtg. Estos efectos son más evidentes cuando el EE2 se administra en la dieta que cuando se administra en el agua del baño. Además, estos efectos dependen, ligeramente, del estado de desarrollo de los ejemplares. 2. El EE2 incrementa la sensibilidad a estrógenos en gónada y en riñón cefálico ya que aumenta la expresión del REα. 3. La exposición in vivo a EE2 interrumpe la espermatogénesis e induce en el testículo la morfología característica de la etapa de post-puesta. Aunque los túbulos seminíferos continúan llenos de espermatozoides se observa una reducción en el volumen y motilidad de los espermatozoides. Además, el EE2 genera un proceso pro-inflamatorio en la gónada, promoviendo una infiltración masiva de leucocitos y un incremento en la expresión de citoquinas y moléculas implicadas en el reconocimiento y presentación de antígenos. 4. El EE2 disminuye la capacidad de los ejemplares de responder a un estímulo inmunológico in vivo ya que inhibe la producción de citoquinas pro-inflamatorias tras una inmunización aunque no se comporta como inmunosupresor. Además, el EE2 inhibe in vitro las actividades inmunitarias de leucocitos de riñón cefálico y dirige hacia un fenotipo anti-inflamatorio en macrófagos. 5. EL GPER se expresa en tejidos reproductores e inmunitarios de dorada y su expresión no es modulada por su activación. 6. Los granulocitos acidófilos son las células del riñón cefálico que tienen un mayor nivel de expresión de GPER. Éstos expresan un GPER funcional cuya activación in vitro dirige, de manera general, hacia un fenotipo anti-inflamatorio. Dichos efectos son regulados, en parte, por la activación de la ruta de señalización AMPc/PKA/CREB. 7. La activación de GPER no promueve una respuesta estrogénica aunque provoca, en general, un efecto anti-inflamatorio y modula ligeramente la respuesta inmunitaria adaptativa. OBJETIVES: 1. To evaluate the ability of EE2 to provoke an estrogenic response in vivo in male gilthead seabream. 2. To evaluate the ability of EE2 to alter the physiology and the local immune response of the gonad. 3. To evaluate the ability of EE2 to alter the systemic immune response, analysing immune activities of head kidney leukocytes, the expression profile of macrophages and the in vivo capabilities to respond to an immune challenge. 4. To perform a functional characterization of the G protein-coupled estrogen receptor, GPER, both in vitro and in vivo. METHODOLOGY: In vivo and in vitro experimentation was carried out. For this, healthy specimens of gilthead seabream (Sparus aurata L.) were bred and kept at the Centro Oceanográfico de Murcia (IEO, Mazarrón, Murcia). In vivo experiments were carried out by exposing the specimens to EE2 or G1 at different doses and times. In some cases, the exposure was simultaneous to a scheduled immunization. Afterwards, analysis of survival, sperm quality, histological, determination of hormones and IgM in serum, gene expression and flow cytometry were performed. In general, for the in vitro experiments, leukocytes from head kidney (bone marrow equivalent) were treated with several doses of EE2 and G1 (to specifically activate GPER signalling) at different time points, and analyzing immune activities such as phagocytosis and respiratory burst and gene expression profile. CONCLUSIONS: 1. Exposure to EE2 in vivo promotes an evident estrogenic response characterized by decreased GSI, altered serum levels of E2, T and 11KT, and induced hepatic expression of vtg. These effects are more evident when EE2 is administered in the diet than when is administered in bath water. In addition, its effects slightly depend on the development stage of the specimens. 2. EE2 increases the sensitivity to estrogens in the gonad and the head kidney by increasing the expression of the gene coding for ERα. 3. Exposure to EE2 in vivo disrupts spermatogenesis and induces a characteristic morphology of the post-spawning in the testis. However, the seminiferous tubules were filled with sperm, causing a reduction in the volume and sperm motility. Moreover, EE2 also generates a pro-inflammatory process in the gonad, promoting a massive infiltration of leukocytes and an increased expression of the genes encoding cytokines and molecules involved in antigen recognition and presentation. 4. EE2 decreases the ability of specimens to respond to an immune stimulus in vivo by inhibiting the production of pro-inflammatory cytokines after immunization but does not behave as an immunosuppressor. Moreover, EE2 inhibits in vitro the immune activities of head kidney leukocytes and direct primary macrophages towards an anti-inflammatory phenotype. 5. GPER is expressed in reproductive and immune tissues in gilthead seabream and its expression is not modulated by its activation. 6. Acidophilic granulocytes are the head kidney cells with a higher level of expression of GPER. They express a functional GPER whose activation in vitro leads, in general, to an anti-inflammatory phenotype. These effects are regulated, in part, by activation of the cAMP/PKA/CREB signalling pathway. 7. GPER activation in vivo does not promote an estrogenic response, although in general, provokes an anti-inflammatory effect and slightly modulates the adaptive immune response.
Open Access
Estudio de la estructura y función de la familia de proteínas quinasas C
(Universidad de Murcia, 2010-07-20) Sánchez Bautista, Sonia; Gómez Fernández, Juan Carmelo; Corbalán García, María Senena; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Bioquímica y Biología Molecular A
La Proteína Quinasa C (PKC) participa en numerosos procesos de señalización celular y está implicada en multitud de funciones fisiológicas como crecimiento, diferenciación celular, apoptosis, respuesta inmunitaria, secreción hormonal, entre otras. En la presente tesis se ha estudiado el papel de la región reguladora de las isoenzimas clásicas y nuevas. Además se ha estudiado la estructura secundaria del dominio catalítico de una isoenzima atípica: la PKC zeta. Dentro de la región reguladora se distinguen dos dominios, el C1 que se enlaza a diacilglicerol (DAG) y ésteres de forbol y el dominio C2 que en las PKC clásicas une fosfolípidos aniónicos en presencia de calcio y en las PKC nuevas lo hace de un modo independiente de calcio. Por su parte, el dominio catalítico contiene los sitios de unión del ATP y del sustrato susceptible de fosforilación por la PKC.