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    Caracterización de la microbiota intestinal mediante "NGS" en patología neoplásica de colón
    (2015-09-07) Galán Ros, Jorge; Conesa Zamora, Pablo; Escuela Internacional de Doctorado
    Objetivos: Nuestro objetivo consistió en caracterizar, mediante secuenciación de próxima generación (NGS), la microbiota colónica en muestras de mucosa normal y tumoral de pacientes con cáncer colorrectal (CCR), así como en muestras de heces de pacientes sanos y enfermos, además de estudiar las diferencias en la composición microbiana según el tipo, estadío y localización tumoral, con el fin de sugerir qué tipo de bacterias podrían estar previsiblemente involucradas en la localización, desarrollo y evolución del CCR. Material y métodos: En este estudio se analizaron 59 muestras de tejido de pacientes con CCR, donde n=39 correspondían a tejido tumoral (TT) y n= 20 a tejido normal (TN), 9 muestras de tejido adenomatoso (TA) y 7 muestras de heces, donde n=3 procedían de pacientes sanos y n=3 de pacientes con CCR. El estudio de NGS se llevó a cabo en 38 muestras, donde n= 10 correspondían a TN, n=19 a TT, n=2 a TA y n=7 a heces. Posteriormente, escogimos aquellos grupos bacterianos que resultaran de interés y mostraran diferencias significativas entre las comparaciones objeto de estudio para cuantificarlos y validarlos por qPCR, tanto en esta serie de pacientes como en otra serie independiente de pacientes con 37 muestras, donde n=10 correspondía a TN, n=20 a TT y n=7 a TA. Las muestras de tejido tumoral se clasificaron según el tipo (convencional o serrado), localización (distal o proximal) y el estadío mediante el sistema TNM. Tras la extracción del DNA, la amplificación por PCR se llevó a cabo empleando cebadores 27F y 533R que amplifican la región V1-V3 del gen rRNA 16S con los adaptadores A y B de la química Titanium correspondientes a los kits tipo “shot-gun” Lib-L, empleando el equipo 454-Junior de Roche. La qPCR se realizó mediante el uso de cebadores genéricos y específicos de especie/género del gen 16S RNA, con la sonda inespecífica SybrGreen (QuantiTec-Qiagen). El estudio bioinformático para el análisis de calidad, filtrado de secuencias, búsqueda de quimeras y clasificación taxonómica se realizó mediante los programas “FAST QC”, “prinseq-lite.pl script”, “USEARCH” y “RDP classifier” respectivamente. El análisis estadístico relativo a los resultados obtenidos mediante NGS y qPCR se llevó a cabo mediante el empleo del test de Wilcoxon (R-Studio y SPSS 21.0). Resultados: El tejido tumoral se encontraba representado fundamentalmente por el género Fusobacterium (p=0.033) además de otros géneros bacterianos estrechamente relacionados al tejido tumoral, tales como Porphyromonas, Streptococcus y Enterococcus. En el tejido normal observamos un predominio del género Akkermansia (p=0.039). Según el tipo de carcinoma, encontramos que los géneros Fusobacterium, Aeromonas, Streptococcus y Enterobacter fueron más frecuentes en adenocarcinoma serrado (CS) (p=0.045, p=0.033, p=0.013 y p=0.009, respectivamente), a diferencia del género Enterococcus el cual fué más frecuente en adenocarcinoma convencional (CC) (p=0.045). En cuanto al estadío del tumor, solamente encontramos diferencias significativas para el género Faecalibacterium, el cual mostró una asociación con estadíos tumorales avanzados (T3-4) (p=0.042). Según la localización del tumor, los géneros Haemophilus, Prevotella, y Blautia (p=0.029, p=0.044 y p=0.008) se asociaron a tumores de localización proximal, mientras que Enterococcus (p=0.027) mostró una asociación a tumores de zona distal. Del mismo modo, encontramos una mayor presencia de géneros pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae en la zona proximal. Tras el análisis mediante qPCR en ambas series de pacientes, observamos de forma significativa la misma tendencia de resultados para Fusobacterium nucleatum, Akkermansia muciniphila, Faecalibacterium prausnitzii y Enterococcus. En cuanto a las muestras de heces, encontramos un importante predominio de A. muciniphila en pacientes con CCR a diferencia de lo observado en muestras de heces de pacientes sanos donde predominó F. prausnitzii. Conclusiones: F. nucleatum fue una bacteria asociada no sólo con el desarrollo del CCR en general como había sido descrito con anterioridad sino específicamente con el subtipo del adenocarcinoma serrado, siendo la primera vez que se demuestra que la histología del CCR tiene relación con el tipo de microbiota. En tumores con estadíos T3-T4 se asoció un perfil microbiano caracterizado fundamentalmente por bacterias de tipo passengers, ya sea con actividad proinflamatoria como F. nucleatum o de actividad antiinflamatoria como F. prausnitzii. Del mismo modo, la localización anatómica se asoció con diferentes perfiles microbianos cuando se comparó el colon distal y proximal. Nuestro estudio demuestra que la caracterización de la microbiota en el desarrollo del CCR es fundamental para conocer la participación de la misma en las distintas localizaciones y rutas patogénicas implicadas en este tumor. Además los perfiles bacterianos pueden constituir interesantes biomarcadores para la detección temprana y el diagnóstico del CCR así como para el diseño de estrategias preventivas basadas en la administración de cepas probióticas capaces de corregir la disbiosis. Objectives: The aim of this work was to characterize, through next-generation sequencing (NGS), the colonic microbiota in samples from normal and tumor mucosa of patients with colorectal cancer (CRC) and also in stool samples of healthy and affected patients, so we could establish the differences in microbial composition according to the type, stage and location of the tumor. Material and methods: In our study, 59 tissue samples from CRC patients were analyzed, n= 39 corresponded to tumor (TT) and n= 20 to normal tissue (TN), 9 adenomatous tissue samples (TA) and 7 stool samples, where n= 3 were from healthy patients and n= 3 from patients with CRC. The study of NGS, was carried out on 38 samples, corresponding to TN (n=10), TT (n=19), TA (n=2) and feces (n=7). Subsequently, those bacterial groups that were found of interest by showing significant differences between the study comparisons, were validated by quantitative PCR (qPCR) in this patient series and in an independent set of patients consisting of 37 samples, where n= 10 corresponded to TN (n=10), TT (n=20) and TA (n=7). The samples of tumor tissue were classified according to the histological type (conventional or serrated), location (distal or proximal) and stage by TNM system. After DNA extraction, PCR amplification was performed using primers 27F and 533R, that amplify the V1-V3 region form the 16S rRNA gene with adapters A and B corresponding to the kits Titanium "shot-gun" chemical type Lib-L, and the 454-Junior pyrosequencer by Roche. The validation by qPCR was performed using 16S RNA gen primers specific for species or genus and the SybrGreen probe chemistry (QuantiTec-Qiagen). The bioinformatic study for quality analysis, filtering sequences, chimeras withdrawal and taxonomic classification was performed using the "FAST QC", "prinseq-lite.pl script", "USEARCH" and "RDP classifier" programs, respectively. The statistical analysis of the NGS and qPCR results was carried out by applying the Wilcoxon test (R -Studio and SPSS 21.0). Results: The genus Fusobacterium was singnifncantly more abundant in the tumor tissue (p = 0.033) and others bacterial genera closely related, such as Porphyromonas, Streptococcus and Enterococcus. In normal tissue, we observed a predominance of Akkermansia (p = 0.039) and regarding the histological type of carcinoma, we found that Fusobacterium Aeromonas, Streptococcus and Enterobacter were more common in serrated adenocarcinoma (CS) (p= 0.045, p= 0.033, p= 0.013 and p= 0.009, respectively) than conventional (CC), unlike the genus Enterococcus, which was more common in CC (p= 0.045). Concerning tumor stage, we found significant differences for Faecalibacterium, which showed an association with advanced tumor stages (T3-4) (p= 0.042). According to tumor location, Haemophilus, Prevotella, and Blautia (p= 0.029, p= 0.044, p= 0.008) were associated with proximal location tumors, while Enterococcus (p= 0.027) showed a relationship with distal area tumors. Similarly, we observed a higher presence of genera belonging to the family Enterobacteriaceae in the proximal area. After qPCR analysis in both sets of patients, we observed significantly the same trend of results for Fusobacterium nucleatum, Akkermansia muciniphila, Faecalibacterium prausnitzii and Enterococcus. As for the stool samples, we found a significant prevalence of A. muciniphila in patients with CRC, unlike that observed in stool samples from healthy patients predominated F. prausnitzii. Conclusions: F. nucleatum was identified as a bacteria asociated with not only the CRC development in general, as was previously described, but also specifically with the CRC subtype of serrated adenocarcinoma, being the first study reporting that CRC histology could be related with a microbiota type. In tumors with stages T3-T4, we observed a microbial profile characterized essentially by passenger bacteria, either with proinflammatory activity as F. nucleatum or antiinflammatory activity as F. prausnitzii. Regarding the anatomical location, we found different microbial profiles between the distal and proximal colon. Our study shows that microbiota characterization in CRC development is crucial for knowing the bacteria participation in the different locations and pathogenic pathways implicated in this tumor. Besides, bacteria profiles could be interesting biomarkers for the early detection and diagnose of CRC, as well as important elements for the design of preventive strategies based on probiotic treatments which could restore normal microbiota.
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    Caracterización de la microbiota intestinal mediante next generation sequencing (NGS) en precursores neoplásicos del colon
    (Universidad de Murcia, 2018-10-26) Martín Ibánez, José Juan; Conesa Zamora, Pablo; Morán Sánchez, Senador; Trujillo Santos, Antonio Javier; Escuela Internacional de Doctorado
    Objetivos:Nuestro objetivo consistió en la caracterización mediante técnicas de secuenciación de nueva generación (NGS) de la microbiota intestinal en muestras de pólipos de colon así como en muestras de mucosa sana colónica .Se analizaron las diferencias encontradas en la composición bacteriana de los pólipos según los distintos tipos histológicos, distintas localizaciones anatómicas y la presencia o no de displasia alto grado con el fin de sugerir qué poblaciones bacterianas pudieran asociarse al inicio y desarrollo del cáncer colorrectal (CCR). Material y método: Se analizaron mediante NGS 53 muestras de tejido colónico donde 24 pertenecían a pólipos colónicos y 29 a mucosa sana. Los géneros/especies que mostraron diferencias significativas o resultaron de interés fueron cuantificados y validados por qPCR. Los pólipos colónicos se clasificaron según su histología en adenomas convencionales, pólipos serrados y pólipos mixtos, según su localización en el colon proximal o distal y según la presencia o no de displasia de alto grado/carcinoma in situ. Tras la extracción del DNA, para el análisis NGS, la amplificación de PCR se llevo a cabo empleando cebadores adaptados a ILLUMINA (“16S Metagenomic Sequencing Library Preparation Protocol”).El estudio bioinformático para la limpieza de secuencias con obtención de secuencia solapante , procesamiento por calidad con eliminación de cebadores, eliminación de secuencias quimera y clasificación taxonómica se realizó mediante los programas “PEAR V.0.9.1” , “CUTADAPT versión 1.4.1.” ,“UCHIME” y “BLAST” respectivamente. El estudio de validación mediante qPCR se realizó con el uso de cebadores genéricos y específicos de género y especie del gen 16S RNA con la sonda inespecífica SybrGreen PCR Master Mix (QuantiTec-QUIAGEN).El análisis estadístico de los datos derivado de NGS se realizó mediante test de Wilcoxon (R-Studio) y los datos de qPCR mediante test U de Mann Withney (SPSS versión 21.0) . Resultados: Los pólipos colorrectales presentaron una mayor abundancia significativa de los géneros Escherichia (P=0.020), Bacteroides (P=0.002) y Flavonifractor (P=0.039) con respecto a las muestras de mucosa sana. En la mucosa sana el único género con mayor presencia significativa (P=0.05) fue Intestinibacter. En los adenomas convencionales se asociaron significativamente los géneros Roseburia, Eubacterium , Coprococcus , Streptococcus, Haemophilus, ,Fusicatenibacter y Erysipelatoclostridium respecto a pólipos serrados. La especie Escherichia coli fue más abundante (P<0.05) en pólipos mixtos respecto a pólipos serrados por qPCR . No se encontraron poblaciones bacterianas diferentes significativamente al comparar pólipos serrados con pólipos mixtos . Los pólipos localizados en colon distal presentaron una mayor presencia significativa del género Bacteroides (P=0.033) . La especie Escherichia coli fue más abundantes en colon proximal (P  0.05) respecto a colon distal. La especie Escherichia coli predominó de forma significativa en pólipos con displasia alto grado/carcinoma in situ respecto a pólipos sin displasia. Los pólipos sin presencia de displasia mostraron una mayor presencia del género Eubacterium de forma significativa (P=0.05) respecto a los pólipos con presencia de displasia alto grado/carcinoma in situ mediante NGS. La especie Escherichia coli fue mas abundante (<0.05) en pólipos con displasia de alto grado. Conclusiones:Los géneros prooncogénicos , Bacteroides y Escherichia, se asociaron de forma significativa a pólipos de colon respecto a mucosa sana colónica. El género Intestinibacter con un potencial papel probiótico está asociado de forma significativa a mucosa sana del colon. Los adenomas convencionales mostraron una composición bacteriana diferente respecto a pólipos serrados con mayor presencia de géneros con actividad antiinflamatoria como Roseburia, Coprococcus, Eubacterium y Fusicatenibacter pudiendo contribuir a ralentizar la evolución menos agresiva del CCR convencional comparado con el CCR serrado. Hemos encontrado un perfil bacteriano diferente según la localización anatómica de los pólipos colónicos mostrando el género Bacteroides una asociación significativa en lesiones situadas en colon distal respecto a las de colon proximal y la especie Escherichia coli asociada significativamente a lesiones de colon proximal. La especie proinflamatoria Escherichia coli se asoció a pólipos avanzados con displasia mientras que el género Eubacterium con propiedades antitumorales se asoció a pólipos sin displasia. Las diferencias observadas en las poblaciones bacterianas entre los grupos del estudio aportan nuevas evidencias que podrían contribuir a la compresión del papel de la microbiota en la carcinogénesis colorrectal . Objectives: The aim of this study was to characterize, through next-generation sequencing (NGS) the colonic microbiota in samples from colonic polyps and normal mucosa. We also studied the bacterial communities associated to specific colorectal polyp types, advanced polyps and anatomical location to determine a bacterial profile associated with the early stage of colorectal carcinogenesis Materials and Methods: 53 tissue samples from colonic polys (24) and normal colonic mucosa (29) were analysed throug NGS. Genus and species wich were significantly different were validated by quantitative PCR (qPCR) . Colonic polys were classificated according to the histological type (adenomatous, serrated and mixed polyp) , according to different anatomic locations (proximal and distal colon) and according to high-grade dysplasia (HGD) / early-stage carcinoma or not. After DNA extraction, PCR amplification was performed using adapted primers as recommended by Illumina (“16S Metagenomic Sequencing Library Preparation Protocol”).NGS analysis of microbial community structure in each simple was performed with Miseq (Illumina) .The bioinformatics analysis for quality analysis, filtering secuences, chimeras withdrawal and taxonomic classification was performed using “PEAR V.0.9.1” , “CUTADAPT versión 1.4.1.” ,“UCHIME” and “BLAST” programs respectively. The validarion by qPCR was performed using 16S RNA gen specific primers for species or genus and the SybrGreen probe chemistry (QuantiTec-QUIAGEN). The statistical analysis of NGS and qPCR results was carried out by applying the T-Student , Wilcoxon test (R-Studio) and Mann-Withney test (SPSS versión 21.0) . Results:Genera Escherichia (P=0.020), Bacteroides (P=0.002) and Flavonifractor (P=0.039) were significantly more abundant in polyp group than in normal mucosa group. Intestinibacter (P=0.05) was the only genus we found significantly more abundant in normal mucosa group . Regarding the histological type of polyp we observed a significantly predominance of Roseburia, Eubacterium , Coprococcus , Streptococcus, Haemophilus, ,Fusicatenibacter y Erysipelatoclostridium (P0.05) in conventional adenoma group than serrated polyp group. Escherichia coli was more abundant (P<0.05) by qPCR in mixed polyp group than in serrated polyp group. No differences was observed between mixed group and conventional adenoma group. Genera Bacteroides (P=0.033) was significantly associated with de distal colon polyps group .Escherichia coli (P<0.05) was significantly more common in proximal colon polyps group by qPCR. Genus Eubacterium (P=0.05) was significantly associated with no dysplasia polyp group than high-dysplasia group. The proportions of Escherichia coli were significantly higher in high-dysplasia group (P<0.05) by qPCR . Conclusions:The proinflammatory genera, Bacteroides and Escherichia, were significantly associated with colon polyps. Intestinibacter, with probiotic activity , was significantly associated with normal colonic mucosa. Conventional adenomas showed differences in community composition with a microbial profile characterized by antiinflammatory genera such as Roseburia, Coprococcus, Eubacterium and Fusicatenibacter and it may contribute to a less aggressive evolution of conventional CRC compared with serrated CRC. We observed different bacterial profile according to the anatomic location of the colonic polyps, showing the driver bacteria Bacteroides a significant association in lesions located in the distal colon with respect to those of the proximal colon. Escherichia coli was significantly associated with proximal colon lesions as was previously described. Escherichia coli also was associated with advanced polyps ( high-grade dysplasia ) , with a well known oncogenic activity. Genus Eubacterium with antioncogenic activity was associated with polyps without dysplasia. The differences observed in bacterial composition between the groups provide new evidence that could contribute to the understanding of the role of the microbiota in colorectal carcinogenesis
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    Factores de riesgo de dehiscencia de sutura en cirugía de cáncer de colon
    (2015-06-15) Vicente Ruiz, María; González Valverde, Miguel; González Sequeros, Ofelia; Facultad de Medicina
    Introducción: La dehiscencia de anastomosis (DA) tras una resección de cáncer de colon (CC) es una de las complicaciones más importantes en la cirugía colorrectal. Su incidencia varía del 2% al 4% en las anastomosis de colon proximal, y de un 6% a un 19% en las de tipo distal y extraperitoneal. Estos porcentajes son variables ya que la definición de DA no está consensuada así como tampoco sus factores de riesgo. Objetivos: El principal propósito de esta investigación fue describir y analizar los factores de riesgo (FR) de DA tras cirugía de CC con el desarrollo de un modelo predictivo que permitiera predecir el riesgo de aparición de dicha complicación en un paciente de nuestro medio. Otros propósitos fueron analizar la supervivencia específica para el CC de nuestra población y determinar si la DA influye en la mortalidad de los pacientes y por último, comprobar la bondad y aplicación del sistema POSSUM como ecuación predictiva de mortalidad y morbilidad en nuestra población. Material y métodos: Se realizó un estudio retrospectivo de casos y controles anidado en una cohorte de la que se analizaron 300 pacientes intervenidos de CC, para estimar los FR de desarrollo de DA. Se realizó un análisis descriptivo de la muestra y se midió la asociación de la DA con posibles variables predictoras mediante una regresión logística simple. Para la predicción de los FR de DA se realizó una regresión logística multivariante seleccionado el mejor modelo posible. Se determinó el punto de corte óptimo mediante curva COR. La validez interna del modelo se evaluó usando técnicas de remuestreo (bootstraping). Posteriormente se evaluó la capacidad discriminativa de la escala POSSUM con curvas ROC para mortalidad y morbilidad y la bondad de ajuste o grado de calibración entre los valores observados y los esperados se evaluaron con la técnica de Chi cuadro de Hosmer–Lemeshow (HL). Y por último, se realizó un análisis de supervivencia mediante el método actuarial o de tabla de vida. Resultados: Los FR incluidos en el modelo predictivo de DA fueron: anticoagulación oral en el preoperatorio, no ser diabético, anastomosis de tipo latero-lateral, proteínas totales preoperatorias <7/dl, hemoglobina <10 g/dl (HL=8,4 p=<0,001; R2 Nagelkerke=0,17) y refuerzo de la anastomosis. Se determinó 0,2, como punto de corte óptimo, clasificando correctamente al 65,7% de los pacientes con una con una Sensibilidad del 78,3% y una Especificidad del 62,5%. Los resultados del remuestreo (bootstrapping) mostraron una buena validez interna. La capacidad discriminativa de la escala POSSUM obtuvo un ABC para mortalidad de 0,745 y para morbilidad de 0,570 con una bondad de ajuste de HL:7,93; p=0,440 y de HL:12,22; p=0,055 respectivamente. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas (Wilcoxon-Gehan=47,282 p<0,001) para la mortalidad preoperatoria de los pacientes con DA sin encontrarlas en cuanto a mortalidad tardía Conclusiones: Los FR asociados a la DA de una manera independiente en nuestro medio e incluidos en el modelo predictivo fueron: anticoagulación oral en preoperatorio, no ser diabético, realización de una anastomosis latero-lateral, refuerzo de la anastomosis, hemoglobina <10g/dl y proteínas totales <7g/dl. Este modelo predictivo es una herramienta válida para la detección de pacientes que sufrirán una DA en nuestro medio aunque con poca eficacia predictiva. El punto de corte óptimo se encuentra en el valor 0,21 con una sensibilidad alrededor del 75% y una especificidad alrededor del 71%. El sistema POSSUM es un buen predictor para la mortalidad en el postoperatorio de CC en nuestro medio, con una buena capacidad discriminativa (ABC = 0,745), no siendo demasiado bueno para el cálculo de la morbilidad (ABC = 0,570). Los pacientes que presentan DA en el postoperatorio tienen una supervivencia perioperatoria menor que los que no desarrollan dicha complicación ABSTRACT Introduction: Anastomosis leak (AL) after colon cancer resection is one of the most important complications in colorectal surgery. Its incidence is from 2% to 4% in proximal colon anastomosis and 6% to 19% in distal and extraperitoneal anastomosis. These percentages are variable because the definition of AL is not yet established even not its risk factors. Objectives: First proposal of this investigation was to describe and analysed the risk factors (RF) of AL after colon cancer surgery by developing a predictive model for AL in patients of our environment. Other objectives were to analyze the specific survival for patients with colon cancer in our population and to define if AL is relationed with mortality. Lastly, to prove the goodness and aplication of POSSUM system as predictive ecuation of mortality and morbidity in our hospital. Material and Method: A retrospective nested case-control study was performed where there were analysed 300 patients with colon cancer surgery to determine RF of AL. A sample descriptive analysis was performed and the association between AL and the variables studied was measured by a univariate logistic regression. A multivariate logistic regression was performed and the best model was chosen. The best point for classification of the predictive model was defined. Intern validity of the predictive model was evaluated by bootstrapping test. After all, an actuarial survival analysis test was made with the sample. Finally the discriminative capacity for mortality and morbidity of POSSUM ecuation was evaluated with ROC curves and its goodness between observed and expected values were measured with Hosmer-Lemeshow test (HL). Results: RF included on the predictive model were: oral anticoagulation as preoperatory treatment, not having diabetes mellitus, side to side anastomosis, total seric proteins <7g/dl, haemoglobine <10g/dl and reinforcement of anastomosis (HL=8,4 p=<0,001; R2 Nagelkerke=0,17). The value 0,2 was determined as best classification point which classified correctly 65,7% of the patients, its sensibility was of 78,3 % and its specificity was 62,5%. A well intern validity was arranged with bootstraping test. Discriminative capacity of POSSUM obtained an AUC of 0,745 and 0,570 for mortality and morbidity, respectively and a well goodness-of-fit test (HL:7,93; p=0,440) for mortality and HL:12,22; p=0,055 for morbidity. Significant stadistic differences were shown between preoperative mortality of AL patients (Wilcoxon-Gehan=47,282 p<0,001). There were not found significant statistic differences for the long-term mortality. Conclusions: Independent risk factors associated to AL and which were included in our predictive model were: oral anticoagulation as preoperatory treatment, not having diabetes mellitus, side-to-side anastomosis, total seric proteins <7g/dl, haemoglobine <10g/dl and reinforcement of anastomosis. This model is valid for identification of patients with AL in our environment but with a lack of predictive value. Best classification point was on 0,2 , and its sensibility was of 78,3 % and its specificity was 62,5%. POSSUM system is a good predictor for mortality in our hospital but not good for the morbidity. AL patients have a high mortality rate in early postoperative than patients without AL.
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    Immunoreactivity of Lewis blood group and mucin peptide core antigens: Correlations with grade of dysplasia and malignant transformation in the colorectal adenoma-carcinoma sequence
    (Murcia : F. Hernández, 2002) Baldus, S.E.; Hanisch, F.G.; Pütz, C.; Flucke, U.; Mönig, S.P.; Schneider, P.M.; Thiele, J.; Hölscher, A.H.; Dienes, H.P.
    Previous studies on the immunoreactivity of various mucin peptide and carbohydrate antigens in neoplastic colorectal tissues led to at least in part contradictory results. Therefore, we investigated a series of 42 adenomas and 44 carcinomas applying monoclonal antibodies (mabs) directed against Lewis blood group antigens (sialyl-Lea, Lex, sialyl-Lex, Ley) as well as mucin peptide cores (MUC1, MUC2 and MUC5AC) by i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y. A statistically significant positive correlation between the development of highgrade dysplasia in colorectal adenomas and the immunoreactivity of Le y and MUC1 epitopes was observed, whereas MUC2 exhibited a significant negative correlation. The reactivity of the other epitopes did not show an association with the progression of malignant transformation. Colorectal carcinomas were subdivided according to their histopathological subtype. The immunohistochemical staining resulted in a significantly stronger MUC2 reactivity of mucinous vs. tubular adenocarcinomas. Immunoreactivity of the MUC1-specific mab, which does not react with the fully glycosylated peptide core, showed a statistically nonsignificant inverse tendency, whereas all carbohydrate antigens displayed a strong expression in both tumor subtypes. Furthermore, correlations between mucin peptide and carbohydrate epitope labelling were evaluated. Progression of the adenoma-carcinoma sequence was accompanied by an increase of Ley as well as MUC1 antigen and an increase of all Lewis antigens compared to MUC2 immunoreactivity. On the other hand, mucinous carcinomas exhibited an inverse pattern. In conclusion, these results demonstrate that Ley a n d MUC1 immunoreactivity correlate with malignant transformation in the colorectum, whereas MUC2 represents a marker for low-grade dysplasia and the subtype of mucinous carcinomas.
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    Poliposis adenomatosa familiar hiperatenuada
    (Universidad de Murcia, 2018-10-23) Macías Cerrolaza, José Antonio; Carbonell Meseguer, Pablo; González-Billalabeitia, Enrique; Escuela Internacional de Doctorado
    En este trabajo se realiza un análisis descriptivo clínico de 28 familias portadoras de una misma alteración en el gen APC que conlleva un fenotipo muy atenuado de poliposis familiar, asociado a un incremento moderado del riesgo de cáncer colorrectal. Desde la Unidad de Consejo Genético en Cáncer del Hospital Morales Meseguer de Murcia entre los años 2007 y 2014 detectamos 28 sujetos (casos índice) aparentemente no relacionadas, que compartían una misma mutación en el exón 2 de APC (APC: c.147_150delACAA). Todas las familias provenían de un área geográfica concreta dentro de la Región de Murcia: el Valle de Ricote y la Vega Media del Segura. Los objetivos principales de la tesis fueron: 1) demostrar el origen común o efecto fundador de esta mutación en el área. 2) caracterizar de forma detallada el fenotipo en los portadores, haciendo hincapié en el carácter especialmente atenuado del mismo en comparación con otras familias similares descritas en la literatura. 3) realizar una estimación de la datación de dicha mutación en la Región de Murcia. 4) proponer un protocolo de diagnóstico y seguimiento específico para los portadores de esta mutación. Metodología. Tras oportuno Consejo Genético se procedió a testar a los familiares de los casos índices hasta un total de 354 sujetos, detectando 194 portadores, los cuales fueron objeto de un análisis exhaustivo de sus características clínicas (historia clínica, datos de colonoscopias, casos de CCR, manifestaciones extracolónicas, etcétera). Para confirmar el origen común de la mutación identificada, se realizó análisis de ligamiento con marcadores genéticos próximos al gen APC. Para hacer una aproximación de la datación de la mutación se emplearon dos métodos diferentes, uno calculando el número de generaciones transcurridas desde el antecesor común más reciente (ACMR) de todos los alelos mutados analizados y otro empleando no un solo marcador sino el haplotipo completo. Resultados y Conclusiones. Se pudo comprobar el carácter fundacional de la mutación, así como realizar un cálculo aproximado de la aparición de dicha mutación en esta área geográfica concreta entre 875 y 950 años. Se determinaron las características fenotípicas que la presencia de dicha mutación confería a los portadores, principalmente en cuanto al número y tipo de pólipos colónicos y la presencia o no de cáncer colorrectal, con un hallazgo fundamental: el marcado carácter atenuado que esta alteración genética provocaba, dando lugar a un menor número de adenomas, con un menor riesgo y una edad más elevada de diagnóstico de cáncer colorrectal en los portadores, comparado con otras series de Poliposis Adenomatosa Familiar Atenuada (PAFA) publicadas. Por último planteamos una propuesta de protocolo de diagnóstico de nuevos casos y de seguimiento clínico/endoscópico en los pacientes con PAFA de estas áreas de salud. In this work we carried out a descriptive clinical analysis of 28 families carrying the same alteration in the APC gene, that leads to a very attenuated phenotype of familial polyposis, associated with a moderate increase in the risk of colorectal cáncer. From the Cancer Genetic Counseling Unit of Hospital Morales Meseguer in Murcia between 2007 and 2014, we detected 28 subjects (index cases) apparently unrelated, who shared the same mutation in exon 2 of APC (APC: c.147_150delACAA). All the families came from a specific geographical area within the Region of Murcia: Ricote Valley and the Vega Media del Segura. The main objectives of this work were: 1) to demonstrate the common origin or founding effect of this mutation in the area. 2) characterize in detail the phenotype in the carriers, emphasizing the especially attenuated nature of it, in comparison with other similar families described in the literature. 3) make an estimate of the dating of the mutation in the Region of Murcia. 4) propose a specific diagnosis and monitoring protocol for the carriers of this mutation. Methodology. After opportune Genetic Counsel we proceeded to test the relatives of the index cases up to a total of 354 subjects, detecting 194 carriers, who underwent an exhaustive analysis of their clinical characteristics (clinical history, colonoscopy data, cases of CRC, extracolonic manifestations, etc.). To confirm the common origin of the identified mutation, linkage analysis was performed with genetic markers next to the APC gene. To make an approximation of the mutation dating, two different methods were used, one calculating the number of generations passed from the most recent common ancestor (ACMR) of all the mutated alleles analyzed and another using not a single marker but the complete haplotype. Results and conclusions The foundational character of the mutation could be verified, as well as an approximate calculation of the appearance of the mutation in this specific geographical area between 875 and 950 years. We determined the phenotypic characteristics that the presence of this mutation conferred to the carriers, mainly regarding the number and type of colonic polyps and the presence or not of colorectal cancer, with a fundamental finding: the marked attenuated character that this genetic alteration caused, giving rise to a lower number of adenomas, with a lower risk and a higher age of diagnosis of colorectal cancer in the carriers, compared with other published series of Attenuated Familial Adenomatous Polyposis (AFAP) Finally, we propose a protocol for the diagnosis of new cases and clinical / endoscopic follow-up in patients with AFAP in this geographic área.