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    Análisis del aire exhalado "off-line" para la búsqueda de biomarcadores de enfermedades respiratorias en la clínica pediátrica
    (Universidad de Murcia, 2022-07-11) Sola Martínez, Rosa Alba; Cánovas Díaz, Manuel; Diego Puente, Teresa de; Escuela Internacional de Doctorado
    En el aire exhalado humano es posible distinguir una gran variedad de compuestos orgánicos volátiles (VOCs). Sin embargo, el conjunto de VOCs, “volatiloma”, presentes en el aire exhalado y su concentración en cada individuo pueden depender de diversos factores, como diferencias en el metabolismo, presencia de patologías o exposición a contaminantes ambientales, entre otros. Por todo ello, en los últimos años, el aire exhalado humano ha sido considerado una fuente prometedora de biomarcadores para el diagnóstico y la monitorización de numerosas patologías como enfermedades respiratorias de alta prevalencia. Asimismo, también se ha sugerido que el análisis del aire exhalado podría ser útil para controlar las exposiciones a contaminantes ambientales y para el seguimiento del estrés oxidativo. Una de las principales ventajas de este enfoque, es que se trata de una metodología no invasiva. La estrategia más extendida para la determinación de VOCs en el aliento humano es el análisis del aire exhalado fuera de línea u off-line mediante tecnologías basadas en espectrometría de masas. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral ha sido aplicar y avanzar en el desarrollo del análisis del aire exhalado off-line para la búsqueda de biomarcadores de enfermedades respiratorias y/o atópicas en población pediátrica y en mujeres en edad fértil. Gran parte de la presente Tesis Doctoral se enmarca dentro del estudio NELA (Nutrition in Early Life and Asthma) que ha reclutado una cohorte de 738 parejas madre/hijo de la Región de Murcia desde la semana 20 de embarazo, con la finalidad de esclarecer el origen del asma durante la infancia y determinar qué factores influyen en su desarrollo. Así, en esta tesis se ha recogido y analizado las muestras de aire exhalado de las parejas de madres e hijos de la cohorte NELA a los 3 meses de edad del niño. En el Capítulo 3, se ha realizado una revisión sistemática de los estudios previos donde se ha aplicado el análisis del aire exhalado en población pediátrica. En el Capítulo 4, se expone el desarrollo de un flujo de trabajo de código abierto para el preprocesamiento de datos brutos obtenidos mediante espectrometría de masas. Además, en este capítulo se muestra un protocolo de recogida de aire exhalado para adultos y niños de corta edad, y un protocolo de análisis del aire exhalado off-line mediante TD-GC/q-MS (desorción térmica acoplada a cromatografía de gases-espectrometría de masas de cuadrupolo simple). En el Capítulo 5, se han identificado perfiles de VOCs en el aire exhalado de mujeres en edad fértil que permiten discriminar entre asmáticas con otras enfermedades atópicas coexistentes y no asmáticas. Asimismo, también se evaluó el impacto de la época del año cuando se realizaron las determinaciones de VOCs, sobre el proceso de descubrimiento de biomarcadores de enfermedades mediante el análisis del aire exhalado off-line, y se desarrollaron estrategias para afrontar los posibles sesgos introducidos. En el Capítulo 6, se estudió la relación entre los VOCs exhalados y la función pulmonar en lactantes sanos. En el Capítulo 7, se determinó la influencia de la exposición a la humedad en los hogares sobre los VOCs en el aire exhalado. Por último, en el Capítulo 8, se evaluó el efecto del almacenamiento de muestras de aire exhalado antes de su análisis mediante sistemas analíticos on-line, concretamente SESI-HRMS (ionización secundaria por electrospray-espectrometría de masas de alta resolución). En base a los resultados obtenidos, las principales conclusiones que se pueden extraer de la presente Tesis Doctoral son: 1) La introducción de las prácticas típicas del campo de la metabolómica es fundamental para alcanzar la traslación clínica del análisis del aire exhalado; 2) Se ha diseñado un protocolo para la recogida y análisis de muestras de aire exhalado mediante TD-GC/q-MS adecuado para población adulta y pediátrica; 3) Se ha desarrollado un flujo de trabajo de código abierto para el preprocesamiento de datos obtenidos en el análisis del aire exhalado off-line mediante TD-GC/q-MS; 4) El análisis del aire exhalado off-line mediante TD-GC/q-MS en mujeres en edad fértil permite diferenciar entre asmáticas con otras enfermedades atópicas coexistentes y no asmáticas (con o sin enfermedades atópicas); 5) Se ha caracterizado la varianza causada por los factores experimentales por implementación de ASCA, que combina el análisis de varianza (ANOVA) y el análisis de componentes simultáneos y se ha solventado el sesgo causado por la estación del año en la que se recolectaban las muestras de aliento; 6) Existe una asociación entre los VOCs exhalados y la función pulmonar en lactantes sanos; 7) La exposición prolongada a humedad en el hogar puede influir en el volatiloma exhalado, concretamente en los niveles del contaminante 2-etil-1-hexanol en mujeres en edad fértil y 8) Las muestras de aire exhalado pueden ser almacenadas durante horas en bolsas de muestreo de gas sin una pérdida determinante de intensidad de los compuestos, y posteriormente ser analizadas mediante SESI-HRMS.
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    Analysis and discrimination between substrates and inhibitors of tyrosinase= Análisis y discriminación entre sustratos e inhibidores de tirosinasa
    (2016-07-20) Ortiz Ruiz, Carmen Vanessa; García Cánovas, Francisco; Tudela Serrano, José; Facultad de Biología
    OBJETIVOS: Los objetivos fundamentales de esta Tesis Doctoral consisten en la profundización en el mecanismo de actuación e inhibición de la enzima tirosinasa, teniendo en cuenta las actividades monofenolasa y difenolasa, además del establecimiento de una metodología que permita discernir entre moléculas fenólicas inhibidoras y sustratos alternativos de la enzima. También la identificación y caracterización cinética como sustratos de algunas de las moléculas descritas como inhibidores de tirosinasa y usadas como tales en la industria cosmética y / o alimentaria. METODOLOGÍA: Ensayos espectrofotométricos, para realizar medidas de actividad monofenolasa y difenolasa de tirosinasa y estudiar su inhibición; ensayos oximétricos, para realizar medidas de actividad de tirosinasa siguiendo el consumo de oxígeno, cosustrato de la enzima; ensayos de RMN, para determinar los valores de desplazamiento químico los átomos de carbono de las moléculas de interés; ensayos de simulación, para comprobar la validez de los resultados obtenidos experimentalmente; docking computacional, para entender los modos de unión de tirosinasa a distintos ligandos; cromatografía de proteínas en FPLC, para la purificación de la tirosinasa comercial; análisis por regresión lineal y no lineal. CONCLUSIONES: Se ha establecido un diseño experimental que permite discernir entre moléculas fenólicas inhibidoras y sustratos alternativos de tirosinasa, teniendo en cuenta las actividades monofenolasa y difenolasa de la enzima. Las medidas de actividad monofenolasa se deben realizar añadiendo al medio de reacción la cantidad de o-difenol necesaria para suprimir el periodo de retardo que aparece al inicio de los registros de actividad. Siguiendo esta metodología, se han identificado los compuestos alcohol p-hidroxibencílico, tirosol, floretina y floricina como sustratos alternativos de tirosinasa. Se han identificado como sustratos de la enzima a los compuestos 4-hexilresorcinol, descrito como inhibidor y usado en la industria cosmética y alimentaria como despigmentante y antipardeante, y oxiresveratrol, propuesto para los mismos fines debido a su ya descrito efecto inhibidor sobre esta enzima. Estas moléculas son hidroxiladas por la enzima y posteriormente oxidadas a una o-quinona que rápidamente isomeriza a una p-quinona, más estable. Además, estos sustratos han sido caracterizados cinéticamente, llegando a la obtención de los parámetros cinéticos KM (constante de Michaelis) y kcat (constante catalítica). Mediante métodos espectrofotométricos se ha identificado como sustrato de tirosinasa al ácido elágico, compuesto descrito como inhibidor y usado como despigmentante en la industria cosmética. Se ha llevado a cabo su caracterización cinética como sustrato, llegando a la obtención de los valores de KM y kcat. Se ha determinado que el ácido elágico inhibe la ruta de biosíntesis de melaninas por su efecto antioxidante, reaccionando con el anión superóxido, las o-quinonas y semiquinonas producidas durante el proceso. Se investigó el mecanismo de actuación de inhibidores análogos a sustratos fenólicos de tirosinasa, llegando a la conclusión de que aquellos que producen el mismo grado de inhibición en las actividades monofenolasa y difenolasa, se unen a las mismas especies enzimáticas en ambas actividades, siendo el tipo y las constantes de inhibición aparentes también similares. Se estableció una metodología para el estudio de inhibidores de tirosinasa y se observó que los valores de muestran una ligera dependencia de la naturaleza del sustrato, a través de las constantes k2 y k6. Finalmente, se estudió el efecto del pH en la catálisis de tirosinasa. Se propuso que un grupo con un pKa de 4.63 ± 0.04 podría ser el responsable de dicho efecto. Este grupo podría corresponder al ácido glutámico E322, que controlaría el acceso de los sustratos al sitio activo según su estado de protonación. Los protones actúan como inhibidores competitivos, uniéndose a las formas metatirosinasa y oxitirosinasa. El pKa de los hidroxilos fenólicos y la carga de grupo R también son importantes. ABSTRACT OBJECTIVES: The main objectives of this report are (1) to investigate further the mechanisms of action and inhibition of tyrosinase enzyme, considering the monophenolase and diphenolase activities, (2) to establish a methodology in order to distinguish phenolic inhibiting molecules from alternative substrates of the enzyme, and finally, (3) to identify and kinetically characterize as substrates some molecules described as inhibitors in the scientific literature and used as such in the cosmetic and food industries. METHODOLOGY: Spectrophotometric assays, to measure the monophenolase and diphenolase activities of tyrosinase and study its inhibition; oxymetric assays, to measure tyrosinase activity by following the oxygen consumption (oxygen is a cosubstrate of the enzyme); RMN assays, to determine carbon atom chemical shift values of the molecule of interest; simulation assays, to test the validity of the experimental results; computational docking, to understand the binding modes of tyrosinase with different ligands; protein chromatography in FPLC equipment, to purify commercial tyrosinase; lineal and non-lineal regression. CONCLUSIONS: An experimental design has been established which permits to distinguish inhibiting phenolic molecules from alternative substrates of tyrosinase, considering the monophenolase and diphenolase activities of the enzyme. The measurements of the monophenolase activity should be made by adding the quantity of o-diphenol, needed to abolish the lag period at the beginning of the activity recordings, to the reaction medium. The compounds p-hydroxybenzyl alcohol, tyrosol, phloretin and phloridzin have been identified as alternative substrates of tyrosinase, by following this methodology. The compounds 4-hexylresorcinol, described as inhibitor and used in the cosmetic and food industries as a depigmenting and anti-browning agent, and oxyresveratrol, proposed for the same purposes due to the described inhibitory effect on this enzyme, have been identified as tyrosinase substrates. These molecules are hydroxylated by the enzyme and subsequently oxidized to an o-quinone, which rapidly isomerizes to a more stable p-quinone. Moreover, these substrates have been kinetically characterized, obtaining the kinetic parameters KM (Michaelis constant) and kcat (catalytic constant). Ellagic acid, a compound described as inhibitor and used as a depigmenting agent in the cosmetic industry, has been identified as a tyrosinase substrate by spectrophotometric methods. Its kinetic characterization as a substrate has been carried out, obtaining the KM and kcat values. It has been determined that ellagic acid inhibits the melanin biosynthesis pathway due to its antioxidative effect, by reacting with superoxide anions, o-quinones and semiquinones produced during the process. The action mechanism of inhibitors which are analogous to phenolic substrates was studied. We concluded that those inhibitors which produce the same degree of inhibition on the monophenolase and diphenolase activities, bind to the same enzymatic species in the two activities, being the type and the apparent inhibition constants the same too. A methodology was established in order to study tyrosinase inhibitors. It was observed that values show a slight dependence on the substrate nature, through the constants k2 and k6. Finally, the pH effect on the catalysis of tyrosinase was studied. It was proposed that a group with a pKa value of 4.63 ± 0.04 might be responsible for this effect. This group could correspond to the glutamic acid E322, which would control the substrate access to the active site depending on its protonation state. Protons act as competitive inhibitors, binding to the met-tyrosinase and oxy-tyrosinase forms. The pKa value of the phenolic hydroxyl groups and the charge of the R group are important too.
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    Aportación de la secuenciación masiva de nueva generación en el diagnóstico del síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario mediante el uso de un panel de genes
    (2019-07-17) Castillo Guardiola, Verónica; Sarabia Meseguer, Mª Desamparados; Ruiz Espejo, Francisco; Alonso Romero, José Luis; Escuela Internacional de Doctorado
    La incorporación de la secuenciación de nueva generación, en el Laboratorio de Genómica del Servicio de Análisis Clínicos del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca (HCUVA), ha permitido estudiar el Síndrome de Cáncer de Mama y Ovario Hereditario (SCMOH) mediante la realización de un panel de 26 genes, en el que se incluyeron genes de alta y moderada penetrancia. Sin embargo, este aumento de información, con respecto al estudio genético de solo BRCA1 y BRCA2, debe ir acompañado de una correcta interpretación de la misma. Por lo tanto, fue necesario evaluar la utilidad clínica de los estudios genéticos mediante paneles de genes en la población estudiada. Teniendo en cuenta este objetivo general se abordaron también otros objetivos secundarios como: determinar el rendimiento diagnóstico del análisis mediante paneles de genes en la población estudiada y con un test previo de BRCA1 y BRCA2 no informativo, evaluar los criterios de selección, caracterizar las variantes genéticas encontradas desde el punto de vista molecular y clínico, evaluar la frecuencia mutacional de los distintos genes estudiados, llevar a cabo un estudio de correlación genotipo-fenotipo en aquellas variantes clínicamente relevantes y describir la incidencia de variantes de significado clínico desconocido (VUS) obtenidas, así como de las VUS priorizadas. En la presente tesis se partió de una población de 138 familias con estudio previo no informativo para BRCA1 y BRCA2, procedentes de las consultas de consejo genético de los servicios de Oncología del HCUVA y del Hospital General Universitario Morales Meseguer, las cuales habían sido incluidas por cumplir criterios adicionales de selección a los propuestos por la Sociedad Española de Oncología Médica (SEOM). Tras la aplicación del panel de genes BRCA Hereditary MasterTM Plus de Agilent®, se procedió a categorizar las variantes halladas desde el punto de vista molecular y clínico con la ayuda de diferentes herramientas informáticas, bases de datos, publicaciones y programas in silico. Utilizando esta metodología se desarrolló un algoritmo de priorizaron de variantes de significado clínico desconocido. Posteriormente, mediante secuenciación Sanger, se realizó la comprobación de aquellas variantes con relevancia clínica (patogénicas y probablemente patogénicas), cuyo estudio fue ampliado a los familiares, obteniéndose información entre el genotipo y el fenotipo. Finalmente, para comprobar el efecto fundador de la variante c.8251_8254del en ATM se realizó un estudio de microsatélites en las familias afectadas y en población control. Tras la aplicación del panel de genes descrito se ha conseguido mejorar el rendimiento diagnóstico en un 8% en la población estudiada, resultado similar a lo descrito previamente en la bibliografía. Para ello, la aplicación de criterios adicionales de selección de familias no ha contribuido de manera significativa a aumentar el rendimiento diagnóstico con respecto a los criterios de selección propuestos por la SEOM. Con respecto a la categorización de variantes a nivel clínico y molecular, se han detectado un gran número de variantes missense que, en la mayoría de los casos se categorizaron clínicamente como variantes de significado clínico desconocido, mientras que la mayoría de las variantes clasificadas como patogénicas y probablemente patogénicas fueron de tipo nonsense o frameshift. Gracias a la incorporación de un algoritmo de priorización de variantes VUS se consiguió reducir el porcentaje de familias portadoras de este tipo de variantes de un 52% a un 20%, por lo que sería recomendable la utilización de esta herramienta en el análisis de los estudios genéticos. Este estudio también ha aportado la identificación de 14 variantes (4 clínicamente relevantes y 10 VUS) previamente no descritas. Así mismo, destacar que la incidencia de mutaciones en el gen ATM (4,35%) ha sido la más alta descrita hasta la actualidad, y la aportación al rendimiento diagnóstico de la variante 8251_8254del en ATM, presente en dos familias del estudio, provenientes probablemente de un ancestro común de la Región de Murcia. En relación a los estudios de correlación genotipo-fenotipo en los portadores de variantes patogénicas en los genes no BRCA destaca el cáncer de mama unilateral como el fenotipo más frecuente, seguido del cáncer de ovario. En cuanto a las características histopatológicas de los casos cáncer de mama, todos fueron positivos para receptores hormonales, excepto en la portadora de la variante patogénica en TP53. Este resultado es similar a los comunicados en otros estudios.
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    Aspectos actuales de la investigación en Bioquímica.
    (Murcia : Universidad de Murcia, Sevicio de Publicaciones, 1968) Lozano Teruel, José Antonio; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Química Orgánica
    La finalidad de este artículo es exponer concisamente cuál es la situación actual en este campo, deteniéndonos a considerar junto a la teoría "clásica" de la fosforilación, como podemos denominar a la química, otras aportaciones modernas como la quimiosmótica y la conformacional, que aun cuando aparentemente parten de bases muy distantes, los resultados más recientes parecen indicar que en el fondo podrían tener bastantes puntos en común.
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    Bases moleculares de la interacción, de proteínas de transporte vesicular
    (Universidad de Murcia, 2022-05-31) López Martínez, David; Corbalán García, María Senena; Escuela Internacional de Doctorado
    Las vesículas intracelulares se transportan de un orgánulo a otro en respuesta a distintos estímulos. La dirección y eficacia de la entrega de vesículas hasta su membrana de destino están mediadas por la señalización celular, llevada a cabo por numerosas proteínas y segundos mensajeros. Rabfilina3A (Rph3A) es una proteína del tráfico de membranas, sensible a dos segundos mensajeros, calcio (Ca2+) y fosfatidil inositol 4,5-bisfosfato (PIP2). PKCε es una proteína quinasa implicada en rutas de señalización que actúa fosforilando a otras proteínas, y responde a distintos lípidos como diacilglicerol (DAG) y ácido fosfatídico (PA). Nuestro grupo de investigación en colaboración con el Instituto de Biología Molecular de Barcelona, han resuelto las estructuras 3D de los dominios C2 de Rabfilina3A unidos a Ca2+ y PIP2, y también del dominio C2B unido a SNAP25. Además, se determinó previamente que PKCε responde a PA. Por tanto, uno de los objetivos de esta tesis doctoral fue caracterizar la función de Rabfilina3A y descubrir nuevas proteínas moduladoras de su función. El segundo objetivo fue investigar el papel que podría tener el PA sobre PKCε en la secreción de vesículas de los mastocitos. Para lograr estos objetivos, se utilizaron técnicas de biología molecular para clonar y mutar genes. Se usaron dos líneas celulares como modelos vivos: la línea celular PC12 como modelo adrenal, también diferenciada con factor de crecimiento neuronal (NGF) a un modelo neuronal, y la línea celular RBL-2H3 como modelo de mastocitos. Se empleó el ensayo de ligación por proximidad (PLA) con microscopía confocal para estudiar la localización e interacciones proteína-proteína. Además, se utilizaron técnicas "ómicas" para la identificación masiva de proteínas cercanas a Rabfilina3A, acoplando la técnica de marcaje por proximidad dependiente de biotina (BioID2) con espectrometría de masas. Los resultados obtenidos muestran que el dominio C2B de Rabfilina3A presenta una fuerte región electropositiva, en la zona de interacción con SNAP25 que no está conservada en Sinaptotagmina1. Rabfilina3A parece interaccionar con VAMP2, Sinaptotagmina1 y SNAP25 en las vesículas de transporte, pero sólo con SNAP25 y Sinaptotagmina1 en la membrana plasmática. La zona de interacción de SNAP25 con Rabfilina3A, y la interacción de Rabfilina3A con PIP2 parecen ser claves para la correcta localización de SNAP25 en la membrana plasmática. Además, la sobreexpresión de Rabfilina3A en un fenotipo neuronal promueve la localización de SNAP25 en la membrana plasmática. Se caracterizó el interactoma circundante a Rabfilina3A y se descubrió que Rabfilina3A interacciona con STIM1, y Tcp11l1. STIM1 es una proteína del retículo endoplasmático (RE) encargada de detectar y ayudar a restaurar los valores de Ca2+ en el RE. Tcp11l1 es una proteína de función desconocida. El interactoma realizado de Tcp11l1 muestra que es una proteína que interacciona con proteínas del citoesqueleto como tubulina y β-actina. En consecuencia, en relación con el primer objetivo de este tesis, se propone un modelo en el que Rabfilina3A contribuye al transporte de vesículas y de SNAP25 a la membrana plasmática gracias a la interacción con Tcp11l1, posteriormente Rabfilina3A vuelve a su situación de partida gracias a STIM1. Los resultados del segundo objetivo sugieren que el borde del bolsillo de unión a DAG del dominio C1B de PKCε es fuertemente electropositivo permitiendo su unión a PA. La activación de PKCε por PA junto con el Ca2+ desencadena un incremento de la fusión de vesículas en mastocitos. Este hallazgo se correlaciona con el aumento de la fosforilación de SNAP23 en respuesta a la interacción de PKCε con PA. Por tanto, se sugiere un modelo en el que PKCε es activada por PA y fosforila a SNAP23 facilitando la fusión de vesículas.
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    Biosynthesis, production and biological activity of singular betalain pigments
    (Universidad de Murcia, 2022-07-13) Henarejos Escudero, Paula; Gandía Herrero, Fernando; García Carmona, Francisco; Escuela Internacional de Doctorado
    Tradicionalmente se ha considerado que la unidad estructural que compartían todas las betalaínas era el ácido betalámico, el cual se obtiene tras la ciclación espontánea de 4,5-seco-DOPA, molécula resultante de la acción de la enzima 4,5-DOPA-extradiol-dioxigenasa (DODA) sobre el aminoácido aromático L-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). Sin embargo, los trabajos realizados en esta Tesis Doctoral cambian este paradigma, mostrando una nueva unidad estructural y descubriendo fuentes alternativas de pigmentos betalámicos singulares. Los objetivos de esta Tesis fueron: 1- Búsqueda de fuentes alternativas de betalaínas en plantas. 2- Caracterización fisicoquímica de nuevas betalaínas y estudio de sus rutas biosintéticas. 3- Desarrollo de procesos biotecnológicos para la producción de betalaínas, tanto con estrategias microbiológicas como de origen vegetal. 4- Caracterización del potencial promotor de la salud de betalaínas singulares en el modelo animal Caenorhabditis elegans. En la búsqueda de nuevas fuentes de betalaínas, los pigmentos de Dionaea muscipula Ellis, también conocida como Venus atrapamoscas, fueron estudiados. El establecimiento inequívoco de antocianinas en D. muscipula apoya la exclusión de la familia Droseraceae del orden Caryophyllales desde un punto de vista fitoquímico y su inclusión en el orden Nepenthales. Se han establecido las condiciones para el desarrollo de líneas de callos de Chenopodium quinoa en medio sólido que producen diferentes betalaínas. Indicando que el aumento de la hormona 6-benzilaminopurina y la disminución de nitrógeno en el medio de cultivo son factores clave para activar la ruta biosintética de las betalaínas. La detección de dos betaxantinas derivadas de dopamina en granos de quinua abrió la posibilidad de la existencia de múltiples pigmentos derivados de dopamina en la naturaleza. Probablemente ocultos como compuestos menores en los registros de HPLC de plantas. Se ha descrito una nueva ruta biosintética capaz de producir betalaínas descarboxiladas in planta, como se ha demostrado en C. quinoa. La enzima clave en la ruta derivada de dopamina es una 4,5-extradiol-dioxigenasa (DODA) que escinde el anillo de esta amina, y que se ha caracterizado a nivel cinético y molecular. La proteína es una enzima dual y expresa actividad frente a los sustratos de relevancia fisiológica, L-DOPA y dopamina. Con la sola expresión de la enzima DODA, se reprodujo biotecnológicamente el perfil de betalaínas presentes de forma natural en los granos de quinua. Esto se considera una clara demostración de la simplicidad de la ruta biosintética, propuesta con forma cuadrada, necesaria para producir los pigmentos. Se ha descubierto, descrito y caracterizado toda una nueva familia de betalaínas, las 6-descarboxibetalaínas. Todos los miembros caracterizados presentan propiedades de color similares y una fuerte fluorescencia. Sin embargo, las doce betalaínas descarboxiladas estudiadas en esta Tesis presentan diferentes comportamientos in vivo en ensayos de capacidad antioxidante y promotora de la salud en el animal modelo Caenorhabditis elegans. Además, se ha estudiado el potencial de las 6-descarboxibetalínas como moléculas antiagregantes de β-amiloide in vitro. Cuatro betalaínas descarboxiladas han mostrado resultados prometedores con valores IC50 en el rango micromolar, de posible interés en el tratamiento o prevención de la enfermedad de Alzheimer. También se ha estudiado como betalaínas carboxiladas tradicionales y extractos naturales reducen el crecimiento tumoral in vivo y amplían la vida media del modelo tumoral de Caenorhabditis elegans (gld-1). La molécula más eficaz en la reducción del tamaño tumoral es la L-triptófano-betaxantina. Las betalaínas actúan no solo como antioxidantes, sino también regulando el factor de transcripción DAF-16. Así, las betalaínas se revelan como potenciales fitoquímicos anticancerígenos, de posible importancia en las estrategias de quimioprevención y tratamiento. Profundizando en esta actividad, se han diseñado nuevas betaxantinas que parten de L-triptófano-betaxantina como molécula líder. Los nuevos pigmentos se han producido biotecnológicamente y se han caracterizado sus propiedades. Todos estos nuevos pigmentos muestran una reducción significativa del tamaño de las gónadas tumorales en C. elegans (gld-1).
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    Biotechnological production of antioxidant pigments betalains and evaluation of their functional capacity in the in vivo model Caenorhabditis elegans
    (Universidad de Murcia, 2020-10-01) Guerrero Rubio, Mª Alejandra; Gandía Herrero, Fernando; Escuela Internacional de Doctorado
    La metodología biotecnológica desarrollada en esta Tesis Doctoral ha permitido estudiar las propiedades promotoras de la salud de diecisiete betalaínas individuales empleando el modelo animal Caenorhabditis elegans. Los resultados mostraron que los gusanos alimentados con betalaínas puras experimentaron un aumento en su tiempo de vida útil. El mecanismo molecular subyacente a este efecto se analizó usando cepas mutantes y realizando ensayos de microarrays a partir de extracción de ARN. Los resultados mostraron que las betalaínas modulan la expresión de daf-16 o skn-1, genes ortólogos a FOXO y Nrf2 humanos, respectivamente. En ambas especies, estos genes están involucrados en vías relacionadas con la longevidad y la resistencia al estrés oxidativo y conducen a la sobreexpresión de HSPs, proteínas involucradas en la resistencia al cáncer y al Alzheimer. Estos resultados pueden abrir nuevas líneas de investigación en la búsqueda de tratamientos efectivos basados en estas moléculas de origen vegetal
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    Biotransformación de picrocrocina con B-Glucosidasa inmovilizada / Mª Rosario Castellar Rodríguez ; directores José Luis Iborra Pastor, Manuel Cánovas Díaz.
    (Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular e Inmunología,, 1992) Castellar Rodríguez, María Rosario
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    Ca2+ - ATPasa y muerte celular inducida por Ca2+ en células cardíacas H9c2 / Antonio Manuel Lax Pérez; directores, Francisco Fernández Belda, Fernando Soler Pardo.
    (Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular A,, 2009) Lax Pérez, Antonio Manuel
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    Ca2+-ATPasa y Muerte Celular Inducida por Ca2+ en células Cardíacas H9c2
    (2015-02-16) Lax Pérez, Antonio Manuel; Fernández Belda, Francisco; Soler Pardo, Fernando; Departamento de Bioquímica y Biología Molecular A
    La Ca2+-ATPasa de RS puede hidrolizar ATP a través de una ruta alternativa en la que solo intervienen conformaciones de la proteína que no unen Ca2+. El mecanismo molecular de esta actividad hidrolítica implica un cambio conformacional inducido por ATP que produce aproximaciones de los dominios citosólicos. El uso de indicadores fluorescentes y compuestos que movilizan Ca2+ permite caracterizar flujos y depósitos intracelulares de Ca2+ que están implicados en la generación de señales intracelulares de Ca2+ en células H9c2. La mitocondria es capaz de interpretar señales citosólicas de Ca2+ que se generan en el retículo sarco-endoplásmico (RSE). El efecto apoptótico que se observa en presencia del inhibidor Tapsigargina (TG) es dependiente de la concentración usada. La muerte celular se produce antes cuando TG provoca apertura del poro de permeabilidad transitoria mitocondrial. El daño producido en el RSE activa la ruta apoptótica mitocondrial con participación de cas pasa 8 en un lazo que amplifica la cascada degradativa de las caspasas. Las células disponen de mecanismos alternativos de muerte celular en los que no participan caspasas.
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    Caracterización cinética y aplicaciones biotecnológicas de peroxidasas
    (2014-07-22) Parra Carrillo, Magdalena; Tomás Martínez, Virginia; Tudela Serrano, José; Facultad de Biología
    Objetivos • Estudio de la bibliografía especializada y realización de ensayos preliminares que permitan la proposición de un mecanismo de reacción sometido a análisis cinético, que aporte expresiones útiles para un diseño experimental , aplicable para comprobar la validez del mecanismo de reacción planteado, así como para la caracterización cinética de los sistemas enzimáticos investigados, superando a otros métodos descritos en la bibliografía. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación enzimática por peroxidasas, de los colorantes Índigo Carmín (IC) y Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR), mediante un método espectrofotométrico. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación de IC, por sistemas enzima-mediador en presencia de mediadores naturales. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación de RBBR por sistemas enzima-mediador en presencia de mediadores naturales. • Caracterización cinética y optimización de la determinación de fenoles con aplicaciones biotecnológicas, mediante un método espectrofotométrico y ultrasensible de bioanálisis enzimático. Metodología Ensayos espectrofotométricos Los espectros de absorción fueron registrados con un espectrofotómetro de visible-ultra violeta Perkin-Elmer Lambda 35, otros datos cinéticos o de punto final en la zona del visible fueron obtenidos mediante un lector de microplaca SpectraMax 340PC384. Ensayos de cromatografía líquida líquida de alta resolución (HPLC) Los cromatogramas realizados se llevaron a cabo con un cromatógrafo HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution. Las especies eluídas fueron monitorizadas a diferentes longitudes de onda, tomando el máximo de absorción para cada una de ellas. Biodegradación de IC con peroxidasas La reacción se realizó en tubos de plástico con una concentración de enzimas HRP y SBP que varió entre 2.5-30 nM , la concentración de contaminante entre 10-120 M y la de peróxido de hidrógeno también entre 10 y 120 M , todo ello a pH óptimo de 10 mM de tampón citrato de pH 5.0 y 4.0 para HRP y SBP respectivamente, a 25 ºC.Se analizaron las reacciones en el espectrofotómetro y en el HPL, determinando los parámetros cinéticos como la absorbancia máxima (Amax), la velocidad en estado estacionario VSS y la constante de biodegradación (). Biodegradación de IC con sistemas lacasa/peroxidasa-mediador Se comparó el estudio a 25 ºC de SBP con el de TvL para la degradación de IC entre con los mediadores MSG, ASG, SGA y SGO con el fin de contrastar los rendimientos de biodegradación del colorante. Biodegradación de RBBR con sistemas lacasa-mediador Se optimizaron las condiciones de reacción para la degradación de RBBR con sistemas EML a temperatura ambiente, eligiendo el sistema mediador más eficaz para dicha reacción. Bioanálisis enzimático de fenoles Se diseña y optimiza un método de análisis enzimático espectrofotométrico para el análisis de distintos tipos de fenoles industriales (fármacos, contaminantes y fitoquímicos). La reacción se realiza en presencia de AA como reductor acoplado y biomolécula detectora, catalizada por HRP. Conclusiones • Se ha caracterizado cinéticamente y optimizado la biodegradación enzimática de IC y RBBR por H2O2, catalizada por las peroxidasas HRP y SBP, mediante un método espectrofotométrico • Se ha conseguido la caracterización cinética y la optimización de la biodegradación enzimática del IC, por varios sistemas enzima-mediador (EMS). En concreto, las enzimas SBP con H2O2 y TvL con O2, en presencia del premediador natural SGO, y de los mediadores naturales, MSG, ASG y SGA. • Se ha estudiado la caracterización cinética y la optimización de la biodegradación enzimática de RBBR por TvL con O2, ante el premediador natural SGO y los mediadores naturales MSG, ASG y SGA. • Se ha desarrollado un método espectrofotométrico y ultrasensible de bioanálisis enzimático, útil para la determinación de concentraciones nanomolares, de diferentes contaminantes, fármacos y fitoquímicos fenólicos de interés biotecnológico. En consecuencia, se han alcanzado satisfactoriamente, los objetivos propuestos al comienzo de esta Tesis Doctoral. Objectives • Kinetic characterization and optimization of a spectrophotometric method, for the enzymatic biodegradation by peroxidases, of the dyes Indigo Carmine (IC) and Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR). • Kinetic characterization and optimization of the IC biodegradation, by enzyme-mediator systems in the presence of natural mediators. • Kinetic characterization and optimization of the RBBR biodegradation, by enzyme-mediator systems with natural mediators. • Kinetic characterization and optimization of the determination of bioactive phenols, by using a spectrophotometric and ultrasensitive method of enzymatic bioanalysis. Methodology Spectrophotometric assays Absorption spectra were recorded in a visible-ultraviolet Perkin-Elmer Lambda 35 spectrophotometer and other data adquisition in endpoint or kinetic were recorded with an absorbance microplate reader SpectraMax 340PC384. Liquid chromatography Chromatograms were realized with an HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution chromatograph. The monitoring of the eluted species was performed at different wavelengths, taking the maximum absorbance wavelengths of the different substances. Biodegradation of the dyes IC and RBBR by POD. This chapter describes a new ecofriendly alternative for removal Remazol Brilliant Blue (RBBR) and Indigo Carmine by soybean (SBP) and horseradish (HRP) peroxidases. Thus, studies for optimization of reaction conditions (pH, concentration of enzymes/substrates/hydrogen peroxide) have been proposed. Biodegradation of IC by enzyme-mediator systems. A reaction mechanism is proposed beside the pH results. This mechanism involves enzymatic and nonenzymatic reactions, in which a premediator (PM), mediator (M) and the mediator radical (MR) are considered. Vss values were determined from enzymes, mediator and IC effects. Thus, the assay conditions for biodegradation of IC, with the enzyme-mediator systems, were optimized. Vss values were determined from enzyme, mediator and RBBR effects. The experimental data obtained confirmed the reliability of the reaction mechanism proposed. Thus, the assay conditions for biodegradation of RBBR, with the enzyme-mediator systems, were optimized. Biodegradation of RBBR by laccase-mediator systems. Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR) biodegradation was carried out by laccase from Trametes villosa (TvL) using the natural mediators ASG, MSG, SGA and SGO Enzymatic bioanalysis of phenols. A number of analytical methods with different sensitivity, complexity, quickness and cost have been proposed The aim of this chapter is the possible determination of phenols of biotechnological interest, in nanomolar concentrations, by using an enzymatic and spectrophotometric method of bioanalysis, easy, quick and with low cost. Conclusions • It has characterized kinetically and optimized the enzymatic biodegradation of IC and RBBR by H2O2, catalyzed by the peroxidases HRP and SBP, with a spectrophotometric method. • It has reached the kinetic characterization and the optimization of the enzymatic biodegradation of IC, by several systems enzyme-mediator (EMS). In particular, the enzyme SBP with H2O2 and TvL with O2, in presence of the natural premediator SGO and the natural mediators MSG, ASG and SGA. • It has been studied the kinetic characterization and the optimization of the enzymatic biodegradation of RBBR by TvL and O2, with the natural premediator SGO and the natural mediators MSG, ASG and SGA. • It has carried out a spectrophotometric and ultrasensible method of enzymatic biodegradation, useful for the determination of nanomolar concentrations of different phenolic contaminants, drugs and phytochemicals of biotechnological interest. In consequence, the proposed objectives at the beginning of this Doctoral Thesis have been successfully reached.
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    Caracterización de los sistemas enzimáticos responsables del pardeamiento de la fresa / Matías López Serrano.
    (Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Biologia Vegetal,, 1998) López y Serrano, Matías
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    Caracterización de nuevas moléculas y enzimas que regulan los niveles de NAD+
    (Universidad de Murcia, 2019-03-25) García Saura, Antonio Ginés.; Sánchez Ferrer, Álvaro; Escuela Internacional de Doctorado
    En la Tesis Doctoral titulada “Caracterización de nuevas moléculas y enzimas que regulan los niveles de NAD+”, los objetivos fueron; el diseño de un método para la clasificación del gran número de nicotinamidasas presentes en las bases de datos; el desarrollo de un método para la producción biotecnológica de compuestos precursores del NAD+, usando una nueva NAD+ difosfatasa bacteriana; el estudio in silico y posterior caracterización de una nueva NAD+ difosfatasa no bacteriana; la caracterización de una poli-ADP-ribosa polimerasa bacteriana con alta eficiencia catalítica; y la caracterización de un macrodominio bacteriano, capaz de eliminar las modificaciones proteicas por polímeros de ADP-ribosa. Para la clasificación de los miembros de la familia de las nicotinamidasas, un nuevo patrón compatible con Prosite fue desarrollado. Este patrón basado en el sitio de unión a metal, común a todas las nicotinamidasas, permitió identificar más de diez mil secuencias. Basados en este patrón, otros cuatro nuevos patrones más específicos fueron desarrollados, incluyendo el tipo Firmicutes, Mycobacteria, Archaea y Multi-origen. La clasificación establecida en base al sitio de unión a metal correlaciona bien con la obtenida al considerar las secuencias completas, indicando este sistema como un método útil para la clasificación de nicotinamidasas. Para la producción de precursores de NAD+, una nueva NAD+ difosfatasa bacteriana fue purificada e inmovilizada en forma de BSA-CLEAs. El importante incremento en su estabilidad operacional y reusabilidad tras la inmovilización hicieron posible su aplicación para la producción de precursores de NAD+ (NMN). El uso combinado de esta enzima con una NMN deamidasa de E. coli, permitió una sencilla producción de NaMN. Este compuesto fue testado en dos líneas celulares diferentes de hepatocitos y adipocitos, produciendo un claro incremento en los niveles de NAD+. Siguiendo con el interés despertado por la producción de precursores de NAD+, una nueva NAD+ difosfatasa obtenida de hongos fue caracterizada bioquímicamente, tras un profundo estudio bioinformático. La enzima alcolófila, mostró una alta eficiencia catalítica, varias veces superior a la de las enzimas descritas en la bibliografía incluyendo las bacterianas, con excepción de la humana NUDT12. Sin embargo, la razón de eficiencia catalítica NAD+/NADH fue mayor en la enzima aislada en esta tesis que en la enzima humana, señalando el potencial biotecnológico de esta nueva enzima. La búsqueda de una nueva poli-ADP-ribosa polimerasa bacteriana condujo al descubrimiento de la enzima de Clostridioides difficile CD160 (CdPARP). Esta posee una alta actividad, que es tres veces superior a la de la enzima descrita de la bacteria Herpetosiphon auranticus. Además, se llevó a cabo un análisis filogenético de PARPs bacterianas, mostrando una organización de dominios atípica en CdPARP comparada con otras enzimas de clostridios. Esto puede ser debido a una larga divergencia de C. difficile CD160, relacionada con la presencia de un toxigenotipo único (A-B+CDT-). Este organismo tiene gran interés, debido a su capacidad de un metabolismo de PAR completo, apoyado no solo por una poli-ADP-ribosa polimerasa y una PAR glicohidrolasa, sino también por un macrodominio. El mayor hito de este estudio fue el descubrimiento de un nuevo inhibidor, altamente selectivo para la PARP1 humana. Finalmente, un nuevo macrodominio bacteriano de Fusobacterium mortiferum ATCC 9817 fue descrito, siendo el primero de origen bacteriano en pertenecer al tipo OARD1. Los macrodominios del tipo OARD1 se caracterizan por ser capaces de catalizar tres reacciones enzimáticas distintas, la desacetilación de OAADPr, de-MARilación y de-PARilación. La capacidad de este nuevo macrodominio para eliminar las modificaciones de poli-ADP-ribosa es de gran importancia, debido a que esta actividad solo ha sido descrita en un macrodominio humano (hOARD1).
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    Caracterización de ODCp como una nueva proteína inhibidora de antizimias (AZIN2). Aspectos estructurales y funcionales
    (Universidad de Murcia, 2009-02-05) López Contreras, Andrés Joaquín; Peñafiel García, Rafael; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Bioquímica y Biología Molecular B e Inmunología
    Las poliaminas regulan procesos de crecimiento y diferenciación celular, y su desregulación está relacionada con diferentes patologías incluyendo el cáncer. Las antizimas (AZs) de ornitina descarboxilasa (ODC) inhiben tanto su biosíntesis, como su captación, regulando los niveles intracelulares de poliaminas. En esta tesis se ha caracterizado una nueva proteína inhibidora de antizimas (AZIN2) que posee alta homología con ODC y el inhibidor de antizimas previamente conocido (AZIN1). Esta nueva proteína está desprovista de actividad enzimática, pero es capaz de revertir la acción que las tres antizimas conocidas ejercen sobre la actividad ODC y la captación de poliaminas. A diferencia de sus proteínas homólogas, AZIN2 se localiza subcelularmente en el ERGIC, y se expresa específicamente en cerebro y testículo, pero de forma muy abundante en espermátidas y espermatozoides, al igual que AZ3, indicando que estas dos proteínas juegan un importante papel regulando los niveles de poliaminas durante la espermiogénesis. Abstract Polyamines regulate cell growth and differentiation, and the alteration of their homeostasis is related to different diseases, including cancer. Ornithine decarboxylase (ODC) antizymes (AZs) regulate polyamine levels by inhibiting both their biosynthesis and the cellular uptake. In this work, a new ODC paralogue has been characterized as a novel antizyme inhibitor protein that has been named AZIN2. This protein lacks decarboxylating activity, but it is able to reverse the action of any of the three antizymes on ODC activity and polyamine uptake. Unlike its homologue proteins ODC and AZIN1, AZIN2 is located in the ERGIC, and it is specifically expressed in brain and testes. The abundant expression in spermatids and spermatozoa, concomitantly with AZ3, suggests that both proteins may play an important role in regulating polyamine levels during spermiogenesis