Ciencias de la Salud

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https://hdl.handle.net/10201/61
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    Análisis de la degeneración de los fotorreceptoes en modelos experimentales de retinosis pigmentaria, degeneración macular asociada a la edad y glaucoma =Analysis of photoreceptor degeneration in experimental models of retinitis pigmentosa, aging macular degeneration and glaucoma
    (2015-07-24) Ortín Martínez, Arturo; Vidal Sanz, Manuel; Agudo Barriuso, Marta; Villegas Pérez, María Paz; Facultad de Medicina
    . Objetivo. Determinar el número total y la topografía de la población de conos en roedores adultos utilizando rutinas automatizadas que nos permita investigar objetivamente los efectos de diferentes modelos experimentales de patologías humanas tales como la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), retinosis pigmentaria (RP) y la neuropatía óptica glaucomatosa (NOG) sobre la población de fotorreceptores. Material y métodos. Se han utilizado cinco cepas distinta de roedores: Sprague-Dawley (SD), Piebald Virol Glaxo (PVG) y la rata transgénica P23H-1, y ratones Swiss y C57/BL6. Todos los experimentos y procedimientos se han realizado bajo el estricto cumplimiento de las recomendaciones de la “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO)” y la “European Union guidelines for the use of animals in research”, y todos los procedimientos utilizados han sido previamente aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal (CEEA) de la Universidad de Murcia. Se han utilizado diferentes técnicas para el estudio histológico y morfológico y se han analizado en retinas montadas a plano y en secciones transversales; se han utilizado tecnologías de imagen avanzadas como la Spectral Domain Optical Coherence Tomography (SD-OCT)y se ha realizado análisis de proteínas mediante Western Blot. Como modelo de RP se ha utilizado la rata transgénica P23H-1, esta rata es portadora de una mutación autosómica dominante en el gen de la rodopsina que causa distrofia y muerte de los fotorreceptores. Se ha desarrollado un nuevo modelo experimental útil para la comprensión de la patología de la DMAE, la fototoxicidad localizada de los fotorreceptores tipo cono inducida por LED (FTIL). Por último se ha utilizado un modelo experimental de hipertensión ocular (HTO) inducida mediante láser que permite la evaluación de los efectos de la NOG sobre la población de fotorreceptores. Resultados. El número medio de conos que expresan la opsina-L es de 231.736 ± 14.517 en la rata SD; 239.939 ± 6.494 en la rata PVG; 117.424 ± 17.721 en el ratón Swiss y 135.155 ± 8.742 en el ratón C57/BL6. El número medio de conos que expresan la opsina-S es de 41.028 ± 5.074 en la rata SD; 27.316 ± 2.235 en la rata PVG; 146.682 ± 24.958 en ratones Swiss y 119.616 ± 8.756 en ratones C57/BL6. El porcentaje de conos duales en la rata SD es del 3,2%, del 2,9% en la PVG, de un 73% en el ratón Swiss y de un 40% en el C57/BL6. En todas las cepas de ambas especies existe un paralelismo en la distribución de las células ganglionares de retina (CGR) y los conos-L. La topografía de los conos-L en todas las cepas de rata y ratón analizadas es similar, se observan zonas de alta densidad en el eje nasotemporal superior, las densidades medias alrededor del nervio óptico y un descenso de densidad gradual desde las zonas centrales hacia las periféricas. Sin embargo, existen claras diferencias en la distribución de los conos-S entre las especies y cepas analizadas. El la rata P23H-1, la degeneración de los bastones ocurre antes que la de los conos y de forma rápida: primero con el acortamiento de los segmentos externos, a P30 existe una gran pérdida de bastones y a P180 la pérdida es prácticamente en la totalidad de la retina exceptuando la extrema periferia. La degeneración de bastones y conos está espaciotemporalmente relacionada, ocurre en forma de anillos que aparecen alrededor de P90 y se extiende por toda la retina. A P180, los anillos de degeneración son más abundantes en la retina ecuatorial y de mayor tamaño en la retina dorsal. En un nuevo modelo in vivo de fototoxicidad focal de los fotorreceptores inducido por LED, la SD-OCT muestra un daño en una región circular situado en la retina superotemporal. En esta región se observa una disminución progresiva del espesor de la retina desde 183,4 ± 5 mm (12 h) hasta 114,6 ± 6 mm (7 d). Las secciones transversales muestras una pérdida masiva de bastones y conos en la región dañada por la luz. En las retinas montadas a plano se observa una región circular con disminución del número de conos-L y conos-S. En este área circular en las retinas izquierdas y en la región correspondiente de la retina control derecha, el número total de conos-L o conos-S es de 7.118 ± 842 ó 661 ± 125 en las retinas fotoexpuestas (n=7) y de 14.040 ± 1.860 ó 2.255 ± 193 en las retinas control (n=7), respectivamente. Aunque el CNTF no, la brimonidina, el BDNF, PEDF y el bFGF muestran efectos neuroprotectores significativos sobre los conos-L y conos-S. La HTO provoca sectores con su vértice en el disco óptico carentes de CGR Brn3a pero que aún contienen gran número de núcleos DAPI positivos. Los niveles de todas las opsinas disminuyen a las 2 semanas y esta disminución progresa hasta el 20% de los niveles basales a los 3 meses. Las secciones transversales revelan áreas focales de degeneración en las capas externas de la retina (CER). Las CGR supervivientes a los 15 días representan aproximadamente el 28% y no cambian con el tiempo, mientras que de las poblaciones de conos-L y conos-S sobreviven un 80% y un 65% a un mes o un 35% y un 20% a 6 meses, respectivamente. Conclusiones. Se ha establecido, por primera vez, el número total y la distribución topográfica de los conos-L y conos-S en dos cepas de rata y dos de ratón y se ha demostrado el paralelismo topológico de la distribución de los conos-L y las CGR. Se han proporcionado las bases para estudiar la degeneración de conos y su prevención en condiciones patológicas. Se ha descrito por primera vez que, en la rata P23H-1, la degeneración de bastones y conos está espaciotemporalmente relacionada y se produce en anillos. La pérdida de conos sigue a la pérdida de bastones, que comienza de forma temprana, incluso antes de P30, la primera edad analizada. Las características de los anillos sugieren que la degeneración secundaria de conos está influenciada por la localización en la retina y / u otros factores intrínsecos o extrínsecos. Se ha evidenciado que la FTIL provoca una pérdida de conos y bastones y es un modelo fiable, cuantificable y reproducible para estudiar la degeneración de los fotorreceptores. La administración intravítrea de BDNF, PEDF o bFGF, o la administración tópica de brimonidina proporcionan neuroprotección significativa sobre los conos, en este modelo. Se ha demostrado que la HTO induce una pérdida selectiva de CGR en la capa de la CGR que no progresa después de 1 mes, mientras que los conos-L y conos-S presentan una pérdida progresiva hasta los 6 meses. Por lo tanto, HTO provoca graves daños tanto en las capas más internas como en las CER. SUMMARY. Purpose. To determine the total number and topography of the cone population in two rat and two mouse strains using automated routines which allowed us to investigate objectively the effects of different experimental models of human pathologies such as Aging Macular Degeneration (AMD), Retinitis Pigmentosa (RP) and Glaucomatous Optic Neuropathy (GON) on the photoreceptor population. Material y methods. A total of 303 rats and 23 mice were used in this thesis, five different strains of rodents were used: albino Sprague-Dawley (SD), pigmented Piebald Virol Glaxo (PVG) and P23H-1 transgenic rats, albino Swiss and pigmented C57/BL6 mice. All experimets and procedures were carried out in strict accordance with the recommendations in the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) and the European Union guidelines for the use of animals in research, and all the protocols were approved by the Ethical and Animal Studies Committee of the University of Murcia. Several techniques such as, the identification of the three different types of photoreceptors and other retinal populations by immunohistofluorescence analyzed in whole flat-mounted retinas and in oriented radial sections, classical staining as H-E, imaging advanced technologies as Spectral Domain Optical Coherence Tomography (SD-OCT), and protein analysis by western blot, have been used. In this thesis the P23H-1transgenic rat has been used as a model of RP, this animal bears an autoasomal dominat mutation in the rhodopsin gene (proline to histidine substitution at codon 23 of the rodopsin protein) that causes photorecptor dystrophy and death. A new experimental model useful to understand the AMD pathology, has been developed for this thesis, Light Emmitting Dioede (LED)-induced cone-photoreceptor phototoxicity (LIP), the blue-light LED exposition on the rat retina causes a damage-area located in the retinal zone with maximun L-cones densities and a cone to rod ratio similar to the human macular fovea. And finally, an experimental model of Laser-induced ocular hypertension developed recently in our Laboratory of Experimental Ophthalmology at the University of Murcia has been used to understand the effects of GON on the cone population. Results. The mean number of L-opsin+cones is 231,736 ± 14,517 in SD rat; 239,939 ± 6,494 in PVG rat; 117,424 ± 17,721 in Swiss mouse and 135,155 ± 8,742 in C57/BL6 mouse. The mean number of S-opsin+cones 41,028 ± 5,074 in SD rat; 27,316 ± 2,235 in PVG rat; 146,682 ± 24,958 in Swiss mouse and 119,616 ± 8,756 in C57/BL6 mouse. The percentage of dual cones is 3.2% in SD rat; 2.9% in PVG rat; 73% in Swiss mouse and 40% in C57/BL6 mouse. In all strains, and both species, there is a parallel distribution of retinal ganglion cells (RGC) and L-cones. The topography of L-cones is similar in all strains of rats and mice analyzed, the highest densities are observed in the superior nasotemporal axis, medium densities around the optic nerve, and this density gradually decreases from the center to the periphery. However, obvious differences are found in S-cones distribution. While in the two rat strains there is a increasing gradient of S-cones density along the inferonasal quadrant and the highest densities are found in the retinal rim, in the Swiss mouse strains S-cones are abundant in the dorsal retina although their highest densities are ventral but the C57/BL6 mouse shows a low number of S-cones in the dorsal retina and very dense population in the ventral retina, being densest in its nasal aspect. In P23H-1 rats, rod degeneration occurs rapidly: first the rod outer segment shortens, at P30 there is extensive rod loss, and by P180 rod loss is almost complete except for the most peripheral retina. The numbers of L cones are, at all postnatal ages, lower in P23H-1 rats than in control SD rats, and decrease significantly with age (by P180). Rod and cone degeneration is spatiotemporally related and occurs in rings that appear already at P90 and spread throughout the entire retina. At P180, the rings of rod-cone degeneration are more abundant in the equatorial retina and are larger in the dorsal retina. In a novel in vivo model of focal LED-induced photoreceptor phototoxicity SD-OCT showed damage in a circular region of the superotemporal retina, whose diameter varied from 1,842.4 ± 84.5 mm (at 24 hours) to 1,407.7 ± 52.8 mm (at 7 days). This region had a progressive thickness disminution from 183.4 ± 5 mm (at 12 h) to 114.6 ± 6 mm (at 7 d). Oriented cross-sections showed within the light-damaged region of the retina massive loss of rods and cone-photoreceptors. Wholemounts documented a circular region containing lower numbers of L- and S-cones. Within a circular area (1 mm or 1.3 mm radius, respectively) in the left and in its corresponding region of the contralateral-fellow-retina, total L- or S-cones were 7,118 ± 842 or 661 ± 125 for the LED exposed retinas (n=7) and 14,040 ± 1,860 or 2,255 ± 193 for the fellow retinas (n=7), respectively. Brimonidine, BDNF, PEDF and bFGF but not CNTF showed significant neuroprotective effects on L- and S-cones. Ocular hypertension (OHT) resulted in wedge-like sectors with their apex on the optic disc devoid of Brn3aRGC but with large numbers of DAPI+nuclei. The levels of all opsins diminished by 2 weeks and further decreased to 20% of basal-levels by 3 months. Cross-sections revealed focal areas of outer retinal layers (ORL) degeneration. RGC survival at 15 days represented approximately 28% and did not change with time, whereas the L-cone and S- populations diminished to 80% and 65%, or to 35% and 20% at 1 or 6 months, respectively. Conclusions. It has been established, for the first time, the total number and the topographical distribution of S- and L-cones in two rat and two mouse strains and demonstrated the correlation of L-cones and RGC spatial distribution. It has been provided the basis to study cone degeneration and its prevention in pathologic conditions. It has been described for the first time that in the P23H-1 rat, rod and cone degeneration is spatiotemporally related and occurs in rings. Cone loss follows rod loss and starts very soon, even before P30, the first age analyzed here. The characteristics of the rings suggest that secondary cone degeneration is influenced by retinal position and/or other intrinsic or extrinsic factors. It has been evidenced that LIP results in rod and cone-photoreceptor loss, and is a reliable, quantifiable model to study cone-photoreceptor degeneration. Intravitreal BDNF, PEDF or bFGF, or topical BMD afford significant cone neuroprotection in this model. It has been demostrated that OHT induces in the ganglion cell layer selective RGC loss that does not progress after 1 month, whereas the S- and L-cones exhibit progressive loss up to 6 months. Thus, OHT results in severe damage to both the innermost and the ORL. Palabras clave: Retina, Fotorreceptores, Conos, Retinosis Pigmentaria, Degeneración Macular Asociada a la Edad, Glaucoma. Key words: Retina, Photoreceptors, Cones, Retinitis Pgmentosa, Aging Macular Degeneration, Glaucoma.
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    Caracterización de las células ganglionares de la retina melanopsínicas y estudio de la degeneración y neuroprotección de las células ganglionares de la retina en el roedor
    (2014-03-13) Galindo Romero, Caridad; Agudo Barriuso, Marta; Vidal Sanz, Manuel; Villegas Pérez, María Paz; Facultad de Medicina
    Objetivos Caracterizar la población de células ganglionares de la retina melanopsínicas (CGRm) en la rata adulta en relación con la población total de células ganglionares de la retina (CGR) y analizar su distribución espacial en la retina. Caracterizar si el Brn3a es un buen marcador de las CGR en ratones albino (Swiss) y pigmentado (C57BL/6). Analizar la curva temporal de muerte de las CGR de ratón después de la sección del nervio óptico (SNO), y evaluar el efecto neuroprotector del factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) sobre estas neuronas. Investigar la respuesta de las células de microglía fagocítica en las retinas axotomizadas y en las contralaterales a la lesión. Material y métodos La caracterización de las CGRm se llevó a cabo en 16 ratas albinas adultas Sprague-Dawley (SD). Para saber si las CGRm envían sus axones a través del nervio óptico (NO), se aplicó Fluorogold (FG) en el muñón del NO. Para conocer la proporción de CGRm que proyectaban a los colículos superiores (CS), región retinorrecipiente a la que proyectan el 98,4% de las CGRs en la rata, se aplicó FG en ambos CS. para saber si las CGRm expresan Brn3a y cuantificar automáticamente y comparar el número y distribución espacial de ambas poblaciones, se realizó la inmunodetección doble de melanopsina y Brn3a en retinas de animales intactos. Se utilizaron 158 ratones adultos pigmentados C57BL/6 y 34 albinos Swiss. Una semana antes de la SNO (a 0,5 mm del disco óptico), las CGR se trazaron retrógradamente con metanosulfonato de hidroxistilbamidina (OHSt), un análogo del FG. Para caracterizar el Brn3a como marcador de las CGR y su curso temporal de muerte tras SNO, los animales fueron sacrificados a diferentes intervalos de supervivencia tras la SNO (2, 5, 7, 9, 14 o 21 días). Como control se usaron animales intactos. Las retinas se disecaron en montajes globales y se incubaron con anticuerpos contra Brn3a. En un segundo grupo de experimentos se evaluó el efecto de una inyección intravítrea de BDNF (2,5 µg) o vehículo (PBS) en la población de CGR y de la microglía fagocítica. A tiempos crecientes tras la cirugía (3, 5, 7 y 14 días) se disecaron las retinas a plano y se inmunodetectó el Brn3a (CGR) e Iba1 (células de la microglía). Las CGR-OHSt+ y Brn3a+ se cuantificaron y se analizó la distribución espacial de las CGR-Brn3a+ construyendo mapas de isodensidad celular. Además, se cuantificaron las células de microglía fagocítica marcadas transcelularmente con OHSt e inmunodetectadas con Iba1 y se analizó su distribución espacial mediante mapas de vecinos. El mismo análisis de las CGR y las células de microglía se realizó en las retinas contralaterales a la SNO. Resultados En las retinas de rata en las que las CGR habían sido marcadas con FG aplicado en el MNO, se observó que el 99,05% de las CGR que expresan melanopsina se marcaban también con FG, por lo que estas neuronas proyectan sus axones a través del NO. Un 90,62% de las CGRm se encontraban marcadas con FG aplicado en los CS, por lo que estas células emiten proyecciones retinotectales. Tan sólo un 0,20% de las CGRm expresan Brn3a. La población total de CGRm fue de 2.046±48, lo cual supone un 2,62% de la población de CGR de rata adulta. Los mapas de vecinos revelaban una mayor densidad de CGRm en la periferia de la retina, y más concretamente en la región superotemporal. Esta distribución es complementaria a la distribución de la población de general CGR. En la retina de ratón, el Brn3a se expresa únicamente en las CGR y su expresión no se afecta por la SNO. En la retina de ratón pigmentado C57BL/6 y albino Swiss, el Brn3a se expresa en un 85,5% y 92,6% de las CGR-OHSt+, respectivamente. En ambas estirpes de ratones, los mapas de isodensidad revelan que la distribución de las CGR-Brn3a+ es muy similar a las CGR-OHSt+. En ambas cepas de ratón, la pérdida de CGR después de la SNO comienza a ser significativa con ambos marcadores a los 3 días después de la SNO y disminuye significativamente hasta los 9 días postlesión, momento en el que sobrevive un 15% de la población original Los mapas de isodensidad muestran que la muerte de CGR inducida por la SNO es difusa. En los grupos tratados con BDNF, la muerte se retrasa hasta los 5 días después de la SNO y la supervivencia de CGR es, a todos los tiempos post-lesión, significativamente mayor que al tratar con vehículo. Los mapas de isodensidad muestran que el BDNF retrasa la muerte de las CGR por toda la retina, no únicamente en la zona de la inyección. Conforme aumenta el tiempo después de la SNO, aumenta el número de células de microglía fagocítica, tanto en los grupos tratados con BDNF como en los tratados con vehículo, pero el número es menor en las retinas tratadas con BDNF. Los mapas de vecinos revelan que las células de microglía fagocítica aparecen a los 3 días de manera homogénea por toda la retina y que, conforme aumenta el tiempo post-SNO, aumenta el número de células microgliales que se distribuyen con un gradiente de densidad decreciente del centro a la periferia de la retina. Finalmente, en las retinas contralaterales a la SNO, se observa un aumento significativo del número de células de microglía fagocítica en comparación con las retinas control, aumento que es igual en los grupos tratados con BDNF o con vehículo. Estas células aparecen a los 3 días después de la SNO y su número y distribución se mantiene estable hasta los 14 días post-SNO. En cuanto a la población de CGR en estas retinas contralaterales a la SNO, el número de CGR es significativamente menor a los 21 días después de la SNO comparado con retinas control. SUMMARY Objectives To characterize the total numbers and spatial distribution of melanopsin retinal ganglion cells (mRGC) in the adult rat retina, in relation with the total population of retinal ganglion cells (RGC). To characterize whether Brn3a is a good marker for RGC in two mouse strains, an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) one. To analyze the temporal loss of RGC after optic nerve transaction (ONT), to assess the neuroprotective effect of BDNF in axotomized RGCs. To investigate the response of phagocytic microglial cells after ONT in the injured and contralateral to the lesion retinas. Material and methods Two months old albino Sprague-Dawley (SD) rats (n=16) were used to characterize the mRGC population. To investigate whether all retinal neurons immunodetected with melanopsin sent their axons through the optic nerve (ON), FG was applied in the ON stump. To assess the proportion of mRGC that project their axons to the superioir colliculi (SCi), the retinotectal area where 98.4% of the RGC project their axons in the rat, FG was applied onto both SCi. To assess whether mRGC express Brn3a and to quantify and compare the numbers and spatial distribution of both populations, Brn3a and melanopsin were double immunodetected in retinas from intact animals For the study in mouse, two months old mice were used (n= 158 pigmented C57BL/6 mice, and n= 34 albino Swiss mice). RGC were traced one week before ONT (at 0.5 mm from the optic disk), or euthanasia with hydroxystilbamidine methanesulfonate (OHSt, a FG analogue). To characterize Brn3a as a RGC marker and analyze the temporal loss of RGC after ONT, animals were sacrificed at increasing intervals post-ONT (2, 5, 7, 9, 14 or 21 days). As control, retinas from naive animals were used. Retinas were dissected as flat-mounts and immunodetected for Brn3a. In a second experimental group, the effect of an intravitreal injection of BDNF (2,5 µg) or vehicle (PBS) on RGC and phagocytic microglia was investigated. At increasing times post-surgery, ( 3, 5, 7, and 14 days) retinas were dissected as flatmounts, and Brn3a (RGC) and Iba1 (microglial cells) were double immunodetected. OHSt+RGC and Brn3a+RGC were quantified and the spatial distribution of Brn3a+RGC was assessed by isodensity maps. Phagocytic microglial cells transcellularly labelled with OHSt and Iba1+ were also quantified and their spatial distribution analyzed with neighbour maps. The same analyses were carried out in the contralateral to the lesion retinas. Results In rat retinas traced with FG from the ON, 99.05%, of the RGC that express melanopsin (mRGC) were traced. Thus, mRGC send their axons through the ON. When the tracer was applied to both SCi, 90.6% of the mRGC were traced, thus, most of the mRGC project to them. Finally, Brn3a and melanopsin were doubly immunodetected to assess whether ipRGCs express this transcription factor, and we found that only 0.20% of them were Brn3a+. In flat-mounted retinas, the total number of mRGC was 2,047±309, which amounts to a 2.6% of the total population of RGC. Neighbour maps disclosed that mRGC are placed preferentially in the retinal periphery and that their density is higher in the supero-temporal quadrant. This distribution is complementary to the general RGC population. In mouse retinas, Brn3a is only expressed by RGC and its expression does not change after ONT. In flat-mounted retinas of pigmented C57BL/6 and albino Swiss mice, Brn3a is expressed in 85.5% and 92.6% of the OHSt+RGC, respectively. In both mouse strains, isodensity maps reveal a similar distribution of Brn3a+RGC and OHSt+RGC. In mouse, RGC loss after ONT is first significant 3 days after ONT with both markers, OHSt and Brn3a. From 3 to 9 days post-ONT, the number of RGC decreases significantly. At 9 days, only 15% of the total population is still alive. Isodensity maps reveal that ONT induces a diffuse loss of RGC in the whole retina. In the experimental groups treated with BDNF, RGC death is delayed until 5 days after ONT, and the survival of RGC was higher than in the vehicle-treated groups at all time post-ONT. Isondensity maps showed that BDNF delays RGC death across the whole retina and not only in the localized area of the injection. In both experimental groups, phagocytic microglial cells appeared at 3 days after ONT and the number of these cells increased as the time post-lesion increased, although this response was significantly attenuated by BDNF administration. At 3 days, phagocytic microglial cells were distributed homogenously across the retina. As the time post-lesion increased, their density was higher in the centre than in the periphery of the retina. Finally, in the contralateral to the lesion retinas, there was a significant increase of phagocytic microglial cells compared to control retinas and this increease was the same in the BDNF and vehicle treated groups. These cells appear at 3 days post ONT and their number and distribution is stable up to 14 days post-ONT. Concerning the RGC population in the contralateral retinas, their number significantly decreased at 21 days after ONT, compared to control retinas.
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    Caracterizacion en roedores adultos de la población de células ganglionares de retina melanopsínicas y estudio de la degeneración de las células ganglionares tras hipertensión ocular y neuroprotección
    (2015-07-02) Valiente Soriano, Francisco Javier; Vidal Sanz, Manuel; Agudo Barriuso, Marta; Avilés Trigueros, Marcelino; Facultad de Medicina
    Objetivos • Caracterizar la población de CGRm del ratón pigmentado y albino adulto. • Estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO en ratón pigmentado. • Estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO y su protección con BDNF en rata albina adulta. Material y métodos Para la realización de los experimentos se utilizaron ratones machos pigmentados y albinos adultos y ratas hembras adultas albinas. Las manipulaciones de los animales se realizaron siguiendo la normativa europea (Directiva 2010/63/UE) y nacional (RD 53/2013) sobre la protección de los animales utilizados para la experimentación y otros fines científicos. Para caracterizar la población de CGRm del ratón pigmentado y albino adulto, se inmunodetectaron secciones transversales de retina y retinas a plano con el anticuerpo contra la melanopsina, con el anticuerpo contra Brn3a y se contratiñeron los núcleos de todas las células de la retina con DAPI. Para estudiar la proyección de las CGRm, se aplicó en ambos CS o en el muñón del nervio óptico el trazador neuronal OHSt. Para estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO en ratón pigmentado, se caracterizó el modelo de HTO fotocoagulando con láser las venas perilimbares y epiesclerales del ratón. Para analizar el curso temporal de daño axonal y muerte de las CGR y las CGRm, las CGR fueron trazadas retrógradamente desde los CS con OHSt, las retinas se inmunodetectaron con Brn3a y melanopsina, y se analizaron a las 2 y 4 semanas. Para estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO y su protección con BDNF en rata albina adulta, se analizó el curso temporal de daño axonal y muerte de las CGR y CGRm tras HTO en retinas tratadas con BDNF o vehículo. Las CGR fueron trazadas retrógradamente desde los CS con FG, y las retinas se inmunodetectaron con Brn3a y se analizaron a 12 y 15 días tras la inducción de la HTO. Para el análisis estadístico, el test Kruskal-Wallis se utilizó cuando se compararon dos o más grupos y el test Mann-Whitney cuando se compararon dos grupos solamente. Las diferencias entre grupos se consideraron estadísticamente significativas para p<0.05. Resultados Los ratones pigmentados y albinos tienen un número similar de CGRm (1.021±109 CGRm pigmentado y 962±169 CGRm albino). En los ratones pigmentados las CGRm son más abundantes en la retina tempora y en los albinos están más localizadas en la retina superior. Ambos ratones también tienen CGRm desplazadas (CGRm-d) en la capa nuclear interna, que representan el 14% del total de CGRm en ratones pigmentados y el 5% en los albinos. El marcaje desde ambos CS muestra que el 98% (pigmentado) y el 97% (albino) de la población total de CGRm se marcan retrógradamente, mientras que el estudio de colocalización de melanopsina y Brn3a confirma que un porcentaje muy pequeño de CGRm expresa este factor de transcripción en ratones. En el estudio del marcaje retrógrado colocando OHSt en el muñón del nervio óptico demuestra que no todas las CGRm eran trazadas. Existía una subpoblación de CGRm-d (14% en pigmentados y 28% en albinos) y CGRm residentes en la zona ciliar marginal de la retina (20% en pigmentados y 24% en albinos) que no se trazaban desde el nervio óptico; por lo que estas células no envían el axón a través del nervio óptico y pueden ser consideradas interneuronas de la retina, quizá relacionadas con el reflejo pupilar intrínseco. En el estudio de la caracterización del modelo de hipertensión ocular en el ratón pigmentado observamos un aumento significativo de la presión intraocular desde las primeras 6 horas de la fotocoagulación láser hasta los 5 días. En ratón pigmentado, la HTO resulta en una pérdida difusa y/o sectorial de CGR trazadas con el trazador neuronal OHSt (CGR OHSt+) (50% a 2 semanas y 62% a 4 semanas). Sin embargo, a las 2 semanas aún se observa un 66% de CGR marcadas con Brn3a (CGR Brn3a+). Esto indica que sobreviven en la retina aproximadamente un 16% de CGR cuyo transporte axonal retrógrado está comprometido. Parte de estas CGR acaban muriendo y a las 4 semanas el número de CGR trazadas con OHSt e inmunodetectadas con Brn3a se iguala. La población de CGRm disminuyó aproximadamente al 59% a las 2 semanas y al 46% a las 4 semanas, valores similares a los de las CGR Brn3a+ para los mismos tiempos. La distribución topográfica de la pérdida de CGRm, aunque era mayor en la zona supero-temporal de retina, no era sectorial, sino difusa a lo largo de la retina y no se complementaba con la distribución de la pérdida del resto de CGR. En rata albina, la HTO resulta en una pérdida sectorial de las CGR FG+ (78 y 84% a los 12 y 15 días, respectivamente). El número de CGR Brn3a+ fue significativamente mayor para ambos tiempos de estudio, esto indica que una proporción considerable (≈21 - 26%) de CGR sobreviven en la retina con su transporte axonal retrógrado deteriorado. Las CGRm también presentaron una disminución significativa (50-51%) y esta pérdida, al igual que en ratón, fue difusa. La administración intravítrea de BDNF aumentó la supervivencia de las CGR Brn3a+ a 81 y 67% a los 12 y 15 días, respectivamente, pero no tuvo ningún efecto sobre las CGRm. D. Francisco Javier Valiente Soriano “Characterization in adult rodents of the melanopsin retinal ganglion cells population and study of the retinal ganglion cells degeneration after ocular hypertension and neuroprotection” SUMMARY Objetives • Characterization of the mRGC population of adult pigmented and albino mouse. • Study the RGC and mRGC degeneration after OHT in the pigmented mouse. • Study the RGC and mRGC degeneration after OHT and their protection with BDNF in adult albino rat. Material and methods To perform the experiments we used adult pigmented mice, adult albino mice and female adult albino rats. Manipulations of animals were carried out according to the European (Directive 2010/63/UE) and National (RD 53/2013) regulations existing on the protection of animals used for experimentation and other scientific purposes. To study the characterization of the mRGC population of adult pigmented and albino mouse, cross sections of retina and whole mounts were immunoreacted with anti-melanopsin antibody, with anti-Brn3a antibody and stained with DAPI. To study the projection of the mRGC, the neuronal tracer OHSt was applied in both SC or in the optic nerve. To study the RGC and mRGC degeneration after OHT in the pigmented mouse, ocular hypertension model was performed by laser photocoagulation of the perilimbar and epiescleral veins of the experimental eye. To study the time course of the axonal damage and RGC and mRGC death caused, the RGC were traced from the SC with OHSt and retinas were immunodetected with Brn3a and melanopsin and analyzed at 2 and 4 weeks. To study the RGC and mRGC degeneration after OHT and their protection with BDNF in adult albino rat, we analyzed the time course of the axonal damage and RGC and mRGC death after OHT in BDNF or vehicle-treated retinas, RGC were retrogradely traced from the SC with the retrogradely transported tracer fluorogold (FG), retinas were immunodetected with Brn3a and analyzed at 12 and 15 days after the induction of OHT. For statistical analysis, Kruskal–Wallis test was used when comparing more than two groups and Mann–Whitney when comparing two groups only. Differences were considered significant when p<0.05. Results Both pigmented and albino mice have a similar number of mRGC (1,021±109 mRGC in pigmented, 962±169 mRGC in albino). The mRGC are most abundant in the temporal retina in pigmented mice, and in dorsal retina in albino mice. Both mice also have displaced mRGC (d-mRGC) located in the inner nuclear layer representing 14% of the total population of mRGC in pigmented mice and 5% in albino mice. The 98% (pigmented) or 97% (albino) of the total population of mRGC were marked retrogradely from both SC, while the colocalization study of melanopsin and Brn3a confirms that a very small percentage of this transcription factor was expressed by mice mRGC. A surprising fact in the study of retrograde labeling with OHSt applied on the ON stump was that not all the mRGC were traced. A subpopulation of d-mRGC (14% in pigmented and 28% in albino) and mRGC located in the ciliary marginal zone of the retina (20% pigmented and 24% in albino) that were not traced from the optic nerve, that means that these cells do not send an axon into the optic nerve and can be considered an interneuron of the retina, perhaps related to the intrinsic pupil reflex. In the study of the characterization of ocular hypertension model in pigmented mouse, a significant increase of the intraocular pressure (IOP) was observed from 6 hours of laser photocoagulation up to 5 days. OHT results in a sectorial and/or diffuse loss of RGC traced with OHSt (OHSt+RGC) (50% at 2 weeks and 62% at 4 weeks). However, at 2 weeks, 66% of RGC, which were immunodetected with Brn3a (Brn3a+RGC) were still present. This indicates that at this time around 16% of RGC survive in the retina with their retrograde axonal transport committed. These RGC, however, died at 4 weeks and the number of traced OHSt+RGC and immunodetected Brn3a+RGC was equal. The mRGC population decreased to 59% at 2 weeks and to 46% at 4 weeks. These percentages of loss were similar to the Brn3a+RGC at the same time points. The loss of the mRGC was higher in the supero-temporal area of the retina. However, this loss was not sectorial, but was diffuse along the retina, and did not parallel the distribution of loss of the rest of RGC. In albino rat, OHT resulted in a sectorial loss of FG+RGC (78-84% at 12 and 15 days, respectively). The number of Brn3a+RGC was significantly higher in both times of study, which indicates that a significant proportion (≈21-26%) of RGC survive in the retina with their impaired retrograde axonal transport. The mRGC also presented a significant reduction of approximately 50-51%, and this loss, as in mice, was diffuse. The intravitreal administration of BDNF increased the Brn3a+RGC survival to 81% and 67% at 12 and 15 days, respectively, but had no effect on the mRGC. The study of the inner retinal vasculature did not show any abnormality that could explain the sectorial loss of RGC.
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    Curso de activación glial y muerte de las células ganglionares de la retina en dos modelos de degeneración
    (Universidad de Murcia, 2022-12-22) González Riquelme, María Josefa; Agudo Barriuso, Marta; Galindo Romero, Caridad; Escuela Internacional de Doctorado
    INTRODUCCIÓN El aplastamiento del nervio óptico (ApNO), es un modelo de degeneración de las células ganglionares de la retina (CGRs). Como consecuencia de la muerte de las CGRs, las células macrogliales y microgliales (CMs) se activan y cambian su morfología, además, estas últimas migran y fagocitan las CGRs muertas. La respuesta al ApNO no se limita a la retina lesionada. La retina contralateral responde como la retina lesionada, pero de una manera moderada. Así, tras el ApNO en la retina contralateral, se observa activación de CMs, aparición de microglía fagocítica, activación de astrocitos y células de Müller y pérdida de CGRs. Los cultivos organotípicos de retina (CORs) se están utilizando como un sustituto in vivo para estudiar la pérdida de CGRs. OBJETIVOS 1) Estudiar la respuesta glial en retinas axotomizadas y contralaterales. 2) Estudiar y comparar el curso de muerte de CGRs y la repuesta glial en CORs y en retinas axotomizadas 3) Analizar y comparar cuantitativamente la morfología de las CMs en retinas intactas, axotomizadas, contralaterales y en CORs. MATERIAL Y MÉTODOS Sé utilizaron ratones adultos pigmentados C57Bl / 6. El ApNO se realizó a 0,5 mm y los tiempos de análisis fueron de 1 a 45 días in vivo y de 1 a 7 días in vitro. Se realizó inmunofluorescencia en retinas a corte, a plano y en explantes de retina con diferentes marcadores para el estudio de distintas poblaciones celulares como las CMs, astrocitos y células de Müller y CGRs. La cuantificación de CGRs se realizó automáticamente y la cuantificación de microglía se realizó manualmente. Mediante el programa Image J se analizó la morfología de las CMs y la intensidad de fluorescencia. RESULTADOS En el curso de activación glial tras ApNO se caracterizaron los dos estados de las CMs. En retinas lesionadas, la densidad de CMs-Iba1+ y CMs-CD68+ en la CCG aumento significativamente volviendo a la normalidad a los 45 días. En las retinas contralaterales, la densidad de las CMs-Iba1+ aumento significativamente a 5 días, mientras que las CMs-CD68+ fue significativamente mayor después de la lesión. En secciones trasversales, la densidad de CMs aumentó significativamente en retinas lesionadas, pero no en contralaterales. Los astrocitos y las células de Müller se hipertrofiaron en ambas retinas. En el análisis comparativo del curso de muerte de CGRs y activación microglial entre CORs y retinas axotomizadas se observó una pérdida de CGRs-Brn3a+ similar en ambos modelos. In vivo, la expresión de Brn3a y RBPMS fue paralela, sin embargo, a partir de 5 días la señal de RBPMS in vitro se mantiene. Al probar otros marcadores de CGRs, se observó que el número de CGRs immunodetectadas era el mismo que al usar RBPMS. La cuantificación de las CMs en los CORs mostró una densidad menor que tras ApNO, La activación macroglial en CORs ocurre antes que in vivo, y abarca toda la retina, mientras que tras ApNO se circunscribe al complejo de CGRs. En el análisis comparativo de la morfología de la microglía entre ambos modelos se observaron cambios cualitativos en la morfología de las CMs-Iba1+. En los tres grupos experimentales, (retinas lesionadas, contralaterales y CORs), todos los parámetros analizados de las CMs difieren de las CMs en reposo. En cada grupo experimental la activación de las CMs siguió una cinética específica, y los cambios morfológicos en las retinas contralaterales fueron más tenues que en la retina axotomizada, y en estas, que en los CORs. CONCLUSIONES El ApNO desencadena una activación bilateral y persistente de las CMs-Iba1+ y una respuesta opuesta de las CMs M2 entre ambas retinas. La muerte de las CGRs en ambos modelos es similar hasta 5 días, lo que significa que pueden ser útiles para estudiar nuevos fármacos protectores de las CGRs. En todos los grupos experimentales, las CMs sufren cambios en el tamaño, número y longitud de sus prolongaciones. Estas alteraciones morfológicas son más marcadas en CORs seguido de retinas axotomizadas y finalmente de los encontrados en las retinas contralaterales.
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    Curso temporal de la degeneración axonal, muerte de células ganglionares de la retina y activación de la caspasa 3 en retinas de roedor adulto tras lesión axonal
    (2016-03-21) Sánchez-Migallón Carreras, María del Cielo; Agudo Barriuso, Marta; Vidal Sanz, Manuel; Facultad de Medicina
    Objetivos - Investigar si la expresión de Brn3a tras axotomía del nervio óptico desaparece porque las CGR mueren, o porque se ha producido una alteración celular como consecuencia de la lesión axonal, independientemente de que las CGR sigan vivas. - Analizar y comparar el curso temporal de pérdida de las CGR y la activación de caspasa 3 después de corte (SNO) o aplastamiento del nervio óptico (ApNO) en ratón. Evaluar la supervivencia de las CGR y la activación de la caspasa 3 tras la administración del factor trófico derivado de cerebro (BDNF) o del inhibidor de la caspasa 3 (ZDEVD_fmk). - Analizar, en ratón, la supervivencia de las CGR que expresan Brn3a o melanopsina a largo plazo después de SNO o ApNO y estudiar la degeneración de los axones intrarretinianos de las CGR. Material y Métodos Animales: Para la realización de estos objetivos se han utilizado ratas hembra adultas y albinas (Sprague-Dawley de 180-200 gr de peso) y ratones machos, adultos y albinos (Swiss de 30-32 gr de peso). Los animales han sido tratados según la normativa europea (Directiva 2010/63/UE) y nacional (RD53/2013) vigente sobre la protección de los animales que son utilizados para la experimentación y otros fines científicos. Todas las manipulaciones y procedimientos experimentales que implicaban dolor, sufrimiento o lesión fueron realizadas bajo anestesia. Los animales se anestesiaron intraperitonealmente (i.p.) con una mezcla de Ketamina (70 mg/kg de peso corporal) y Xilacina (10 mg/kg de peso corporal). La eutanasia se realizo con una sobredosis letal de una solución de pentobarbital sódico al 20% inyectado i.p. (0.5-1 ml). Lesión del nervio óptico: Se realizó la sección (SNO, en rata y ratón) o el aplastamiento (ApNO, en ratón) del nervio óptico izquierdo. Ambas cirugías se realizaron a 0.5 mm de la cabeza del nervio óptico. Las retinas se analizaron a tiempos crecientes tras estas cirugías (de 1 a 90 días, n=4-8 por cirugía, tiempo y especie). Como control se usaron retinas de animales intactos o las retinas derechas, contralaterales a la lesión. Inyección intravítrea: Los productos administrados fueron: BDNF (5 μg en rata, 2,5 μg en ratón), el inhibidor irreversible de caspasa 3 ZDEVD_fmk (125 ng/inyección, en ratón), y los correspondientes vehículos. En general, se realizó un solo tratamiento justo después de la lesión de nervio óptico. En el caso del ZDEVD_fmk se hicieron grupos adicionales de animales en los que se administro a los 2 días de la lesión o se hicieron múltiples inyecciones. Para descartar posible toxicidad del inhibidor, éste se examinó en un grupo sin lesión de nervio óptico. Las retinas fueron analizadas a distintos tiempos tras el tratamiento (de 3 a 14 días, n=4-6/ grupo). Procesado y disección de las retinas: Para la realización de Western Blotting, las retinas se disecaron en fresco, y se congelaron inmediatamente. Para los estudios anatómicos, los animales se perfundieron con paraformaldehído y las retinas fijadas se disecaron a plano. Inmunodetección: Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: i/ cabra anti-Brn3a para detectar la población general de CGR, ii/ conejo anti-melanopsina, para identificar la subpoblación de CGR m+; iii/ conejo anti-caspasa 3 activa, para detectar células en apoptosis y, iv/ ratón anti-pNFH (clon RT97) para detectar los axones intrarretinianos de las CGR. La detección secundaria se efectuó con anticuerpos acoplados a los fluoróforos Alexa 488 o 594. Adquisición de imágenes: Todas las retinas montadas a plano se examinaron y fotografiaron en el microscopio de fluorescencia asociado a una cámara CCD y equipado con una platina motorizada controlada por un sistema de análisis de imagen: Image-Pro Plus® (IPP 5.1; Media Cybernetics). Para hacer reconstrucciones de las retinas completas se capturaron imágenes individuales de forma secuencial y no solapada comprendiendo toda la superficie de la retina y posteriormente fueron unidas para formar el fotomontaje (154/140 imágenes individuales por retina). Cuantificación: El número total de CGR trazadas en retinas control y de CGR Brn3a+ en retinas control o lesionadas se cuantificó automáticamente con el programa Image-Pro Plus. En retinas lesionadas el número de CGR trazadas se estimó a partir de contajes manuales de 12 muestras de la retina porque la presencia de células de microglía transcelularmente marcadas con el trazador impide el contaje automático.Las CGR m+, CGR a-caspasa 3+ y los somas de CGR pNFH+ se puntearon sobre el fotomontaje y su número se cuantificó automáticamente usando el programa Image-Pro Plus. Topografía: Para conocer la distribución topográfica de las CGR FG+ y CGR Brn3a+ se realizaron mapas de isodensidad. La distribución de las CGR m+, CGR-a-caspasa 3+ y somas de CGR pNFH+ se visualizó usando el método del vecino más próximo (mapas de vecinos). Estos mapas se realizaron con el programa Sigma Plot (SigmaPlot®11, Systat Software). Estadística: El análisis estadístico y de regresión se llevo a cabo con los programas SigmaStat (Systat Software) o GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). Las diferencias se consideraron significativas cuando p<0,05. Resultados Investigar si la expresión de Brn3a tras axotomía desaparece porque las CGR mueren, o porque se ha producido una alteración celular como consecuencia de la lesión axonal, independientemente de que las CGR sigan vivas. Para realizar este objetivo se usó como modelo la rata albina. Se realizaron dos grupos experimentales. Una semana antes de la lesión de nervio óptico se trazaron las CGR desde los CS con el trazador FG. Pasada esta semana, se seccionó el nervio óptico (SNO) izquierdo de todos los animales. En un grupo justo después de la SNO se administró 5 µg de BDNF intravitrealmente en la retina izquierda, y en el otro se administró el mismo volumen de vehículo. Las retinas fueron analizadas a 7, 9 y 12 días después de la lesión (n=6-8/ tiempo y tratamiento). Las retinas derechas fueron usadas como control. En ambos grupos, la supervivencia de las CGR disminuye con el tiempo post-lesión pero lo hace con mayor rapidez en el grupo tratado con vehículo. De hecho, el número de CGR fue significativamente mayor en el grupo tratado con BDNF comparado con el tratado con vehículo, a todos los tiempos (7, 9 y 12 días), y esto se observa con ambos marcadores, FG y Brn3a. Es más, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en el número de CGR Brn3a+ o FG+ a ninguno de los tiempos analizados, dentro de un mismo grupo. Estos datos indican que la expresión de Brn3a se mantiene en las CGR lesionadas siempre y cuando estén vivas. Finalmente, en los mapas de isodensidad de las CGR Brn3a+ se observo que la pérdida de CGR es homogénea en la retina y que una única inyección intravítrea de BNDF protege las CGR a lo largo de toda la retina. Analizar y comparar el curso temporal de pérdida de las CGR y la activación de caspasa 3 después de corte (SNO) o aplastamiento del nervio óptico (ApNO) en ratón. Evaluar la supervivencia de las CGR y la activación de la caspasa 3 tras la administración de BDNF o ZDEVD_fmk. Se utilizó como modelo el ratón adulto albino. Se realizaron varios grupos: i/ SNO, o ApNO; ii/ SNO + tratamiento con BDNF, iii/ SNO + tratamiento con el inhibidor de la caspasa 3, ZDEVD_fmk. Las retinas fueron analizadas de 1 a 10 días después de la lesión, y en todas se cuantifico el número de CGR Brn3a+ y de CGR que expresan caspasa 3 activa (CGR a-caspasa 3+). La pérdida temporal de CGR y la aparición de CGR a-caspasa 3+ es la misma después de SNO o ApNO. La pérdida de CGR se produce en dos fases exponenciales, una rápida y una lenta. Durante los primeros 7 días se pierde un 65% de CGR, desde el día 8 al 10 la pérdida es más lenta con un muerte adicional del 4% de las CGR. La aparición de CGR a-caspasa 3+ es Gaussiana, alcanzando su pico máximo a los 4 días de la lesión, disminuyendo a partir de entonces. La expresión de Brn3a disminuye cuando las CGR empiezan a expresar a-caspasa 3, y esto se revierte por el tratamiento con BDNF o ZDEVD_fmk. La tasa de rescate de las CGR de ambos tratamientos es la misma y ambos retrasan la pérdida de CGR en un día. Un tratamiento tardío con ZDEVD_fmk no rescata CGR y varias inyecciones (a 0, 2 y 4 días tras la lesión) no son más eficaces que una sola en el momento de la lesión. Tanto la pérdida de CGR como la aparición de CGR a-caspasa 3+ es uniforme por toda la retina. Analizar, en ratón, la supervivencia de las CGR que expresan Brn3a o melanopsina a largo plazo después de SNO o ApNO y estudiar la degeneración de los axones intrarretinianos de las CGR. Para llevar a cabo este objetivo, se utilizó como modelo el ratón adulto albino. Un grupo fue sometido a SNO y otro a ApNO. Las retinas se analizaron a tiempos crecientes tras cada lesión (de 3 a 90 días) y se analizaron las CGR Brn3a+, CGR m+, CGR pNFH+ y los axones de las CGR intrarretinianos. El número medio de CGR Brn3a+ y de CGR m+ en las retinas intactas y en las contralaterales a la lesión no fue diferente, indicando que la axotomía unilateral no causa muerte de CGR en las retinas no lesionadas. En cambio, el número de somas CGR pNFH+ en las retinas contralaterales fue estadísticamente mayor que en las retinas intactas. En retinas lesionadas la pérdida significativa de CGR ocurre a los 3 días y progresa exponencialmente hasta los 15 días momento en el cual sobrevive un 20% de CGR Brn3a+ y un 26% de CGR m+. Desde los 15 a los 90 días, el porcentaje de CGR m+ se mantiene constante, sin embargo dentro de la población Brn3a+ hay un descenso gradual, de manera que sólo 5% de CGR Brn3a+ sobreviven a este último tiempo. Las CGR pNFH+ se observan a partir del día 3, y su número aumenta progresivamente hasta los 5 días, cuando alcanzan su máximo. A partir del día 5 empieza a decrecer gradualmente el número de somas pNFH+, de manera similar a la activación de la caspasa 3. La degeneración axonal es más lenta que la pérdida de CGR. De hecho, la pérdida de axones se observa a los 14 días, momento en el que sólo sobreviven 22% de CGR. Sin embargo los síntomas de degeneración axonal comienzan a ser visibles ya a los 3 días tras la axotomía (CGR pNFH+). Finalmente, no se observó diferencia en ninguno de los parámetros analizados entre la sección y el aplastamiento del nervio óptico. Conclusiones 1. La expresión de Brn3a se mantiene en CGR vivas, independientemente de la lesión axonal, por lo que el Brn3a es un buen marcador de CGR tanto para estudiar su pérdida como para analizar el efecto neuroprotector de distintas terapias. 2. En rata y en ratón, la muerte de CGR tras axotomía es homogénea y afecta a toda la retina. 3. En ratón, el aplastamiento y la sección del nervio óptico inducen el mismo curso temporal de pérdida de CGR, activación de caspasa 3, aparición de somas pNFH+ y degeneración de los axones intrarretinianos. 4. La pérdida de CGR es significativa al tercer día tras la lesión y progresa en dos fases una rápida hasta los 7 días y una lenta desde los 8 días en adelante, por lo que la ventana terapéutica es muy estrecha (estos datos son clave para planear estrategias de neuroprotección). 5. El BDNF y el inhibidor de la caspasa 3 ZDEVD_fmk producen la misma tasa de rescate de las CGR tras la axotomía. Ambos retrasan el comienzo de la degeneración en 1 día. 6. Un tratamiento tardío con ZDEVD_fmk no rescata las CGR y varias inyecciones no son más eficaces que una sola en el momento de la lesión. 7. La axotomía a largo plazo no causa muerte de CGR en la retina contralateral a la lesión en el ratón albino. 8. La respuesta de la población general de CGR (Brn3a+) y la subpoblación que expresa melanopsina a la axotomía es diferente, siendo el porcentaje de supervivencia de esta última significativamente mayor. 9. La expresión de pNFH en los somas de las CGR es un evento temprano de degeneración neuronal que sigue un curso similar al de la activación de caspasa 3. 10. En ratón, como en rata, la pérdida axonal es más lenta que la pérdida de los somas neuronales. SUMMARY Objectives - To investigate whether the expression of Brn3a after optic nerve axotomy is lost because the RGCs die or because of the axonal injury, independently of the RGCs being still alive. - To analyze and compare the temporal course of RGC loss and the activation of caspase 3 after optic nerve transection (ONT) or crush (ONC) in mice. To evaluate the survival of RGC and activation of caspase 3 after administration of brain derived neurotrophic factor (BDNF) or a caspase 3 inhibitor (ZDEVD_fmk). - To analyze, in mice, the long term survival of the general RGC population (Brn3a+RGCs) and the melanopsin expressing subpopulation (m+RGCs) to ONT or ONC. To study the degeneration of RGC intraretinal axons. Material and methods Animals: In this thesis, we have used adult, albino female rats (Sprague-Dawley, 180-200 g, body weight) and adult, albino male mice (Swiss, 30-32 g body weight). All experimental procedures were carried out in accordance with the Association for Research in Vision and Ophthalmology and the European Unión Guidelines for the Use of Animals in Research and were approved by the Ethical and Animal Studies Committee of the University of Murcia (Spain). Animals subjected to surgery were anaesthetized with a mixture of xylazine (10 mg/kg body weight; ) and ketamine (70 mg/kg body weight) administered intraperitoneally (i.p.). All animals were sacrificed with an i.p. overdose of 20% pentobarbital (0.5-1 ml). Optic nerve lesion. In all instances the injury was performed to the left optic nerve. Optic nerve transection (ONT, in rats and mice) or optic nerve crush (ONC, in mice) were done at 0.5mm from the optic head. Retinas were analyzed at increasing time points after the injuries (from 1 to 90 days, n=4-8 per injury, time point and species). As control, we used retinas from intact animals or the right retinas, contralateral to the injured ones. Intravitreal injection. The following products were administered: BDNF (5 μg in rat, 2.5 μg in mice), the irreversible caspase 3 inhibitor, ZDEVD_fmk (125 ng/injection, in mice) and the corresponding vehicles. As a rule, a single injection was done just after the optic nerve injury. Regarding ZDEVD_fmk several additional groups were prepared, to which the injection was performed 2 days after the lesion, or they received multiple doses. To discard the possible toxicity of this inhibitor, this was tested in intact retinas. Retinas were analyzed at increasing time points after the treatment (from 3 to 14 days, n=4-6/group). Retinal processing and dissection: For western blot analysis, retinas were fresh dissected an immediately frozen. For anatomical studies, animals were perfused with paraformaldehyde and the fixed retinas dissected as flat mounts. Immunodetection: Primary antibodies: i/ goat anti-Brn3a to identify the general RGC population; ii/ rabbit anti-melanopsin, to identify the m+RGC subpopulation; iii/ rabbit anti-cleaved caspase 3 (active caspase 3) to detect cells in apoptosis; and iv/ mouse anti-pNFH (RT-97 clone) to identify the intraretinal RGC axons. Secondary detection was done with the appropriate antibodies coupled to Alexa 488 or Alexa 594 fluorophores. Image acquisition: All retinas were photographed under an epifluorescence microscope equipped with a computer-driven motorized stage controlled by Image-Pro Plus (IPP 5.1; Media Cybernetics). Retinal multiframe acquisitions were photographed in a raster-scan pattern in which frames were captured side-by-side with no gap or overlap between them with a 20x objective. Single frames were focused manually before acquisition of the image. All frames from each retina (140-154 acquisitions/retina) were then fed into the IPP image analysis program, to tile them and reconstruct the retinal photomontages. Quantification: The total number of traced RGCs in control retinas, and Brn3a+RGCs in control and injured retinas was automatically quantified with the Image-Pro Plus program using a computerized method developed in our lab. In the injured retinas, the number of traced-RGCs was inferred from manual counting of 12 retinal samples, since the presence of transcellularly labelled microglial cells impairs the automated routine. To achieve this, a new semi-automated macro was validated in control retinas. m+RGCs, c-caspase 3+RGCs, and the somas of pNFH+RGCs were dotted on the retinal photomontage and their number automatically quantified using the Image-Pro Plus program. Topography: To determine the spatial distribution of FG+RGCs and Brn3a+RGCs isodensity maps were used. The distribution of m+RGCs, c-caspase 3+RGCs and pNFH+RGCs was visualized using neighbor maps. These maps were constructed with SigmaPlot (SigmaPlot®11, Systat Software). Statistics: Statistical and regression analyses were carried out using SigmaStat (Systat Software) or GraphPad Prism 5 (GraphPad Software) programs. Differences were considered significant when p<0.05. Results To investigate whether the expression of Brn3a after optic nerve axotomy is lost because the RGCs die or because of the axonal injury, independently of the RGCs being still alive. For this objective the animal model was the albino rat. Two experimental groups were done. A week before the optic nerve lesion, RGCs were traced from the SC with FG. After this week the left optic nerve of all animals was transected (ONT). In the first group a single injection of 5 µg of BDNF was administered right after the ONT, the second group received the same volume of vehicle. Retinas were analyzed at 2, 9 and 12 days after the lesion (n=6-8/ time point and treatment. Right retinas were used as controls. In both groups the number of surviving RGCs decreases with the time post-lesion, but this decrease is quicker in the vehicle-treated group. In fact, the number of RGCs was significantly higher in the BDNF treated group at all time points (7, 9 and 12 days), and this is observed with both markers, FG and Brn3a. Furthermore, there were not significant differences in the number of Brn3a+RGCs or FG+RGCs at neither of the analyzed time points within the same group. These data indicate that the expression of Brn3a is maintained in injured RGCs as long as they are alive. Finally, Brn3a+RGC isodensity maps show that the loss of RGCs is homogeneous across the retina and that a single intravitreal injection of BDNF protects the entire retinal surface. To analyze and compare the temporal course of RGC loss and the activation of caspase 3 after optic nerve transection (ONT) or crush (ONC) in mice. To evaluate the survival of RGCs and activation of caspase 3 after administration of brain derived neurotrophic factor (BDNF) or a caspase 3 inhibitor (ZDEVD_fmk). For this objective the animal model was the albino mice. Several groups were made: i/ ONT or ONC; ii/ ONT + BDNF; iii/ ONT + the caspase 3 inhibitor ZDEVD_fmk. Retinas were analyzed from 1 to 7 days after the lesion, and in all of them the total number of Brn3a+RGCs and c-casp3+RGCs was quantified. The temporal loss of RGCs and the appearance of c-casp3+RGCs is the same after both lesions. RGC loss occurs in two exponential phases, one quick and one slow. During the first seven days, 65% of the RGCs die, from the eighth to the tenth day RGC death is slower causing an addition loss of 4%. The appearance of c-casp3+RGCs is Gaussian, peaking at 4 days after the lesion and decreasing thereafter. The expression of Brn3a decreases when the expression of c-caspase 3 increases, and this is reverted by BDNF or ZDEVD_fmk treatment. The RGC rescue rate in both treatments is the same, and both delay RGC loss by one day. The delayed treatment with ZDEVD_fmk does not rescue RGCs, and several doses (at 0, 2 and 4 days after the lesion) are not better than a single injection at the same of the injury. Both, the loss of RGCs and the appearance of apoptotic (c-caspase 3+) RGCs is uniform across the retina. To analyze, in mice, the long term survival of the general RGCs population (Brn3a+RGC) and the melanopsin expressing subpopulation (m+RGC) to ONT or ONC. To study the degeneration of RGC intraretinal axons. For this objective the animal model was the albino mice. A group of animals received ONT and the other ONC. Retinas were dissected at increasing times after each lesion (from 3 to 90 days) and Brn3a+RGCs, m+RGCs, pNFH+RGCs and the RGC intraretinal axons were identified. The mean number of Brn3a+RGCs and m+RGCs in contralateral to the injured retinas did not differ from intact retinas, indicating that unilateral axotomy does not cause RGC death in the uninjured retina. However, the number of pNFH+RGC somas in the contralateral retinas was significantly higher than in intact retinas. In the injured retinas, RGC loss is first significant at day 3, and progresses exponentially till day 15, when 20% and 26% of Brn3a+RGCs and m+RGCs survive, respectively. From 15 to 90 days, the percent of surviving m+RGCs is constant, however within the Brn3a population there is a gradual decrease and so just 5% of them survive at 90 days. pNFH+RGC somas appear already at day 3 after the lesion and their number increases progressively till 5 days, when if peaks. Thereafter, their number decreases gradually, in a similar course as the appearance of c-caspase3+RGCs. Axonal degeneration is slower than the loss of RGCs, in fact axonal loss is observed at day 14, when only 22% of RGCs survive. However, the symptoms of axonal degeneration are visible already at 3 days after the axotomy (pNFH+RGCs). Finally, there were no differences in any of the analyzed parameters between ONC and ONT. Conclusions 1. Brn3a expression is maintained in alive RGCs independently of being injured. Thus, Brn3a is a good RGC marker to study the loss and to analyze the neuroprotective effect of different therapies. 2. In rats and mice, RGC death after axotomy is homogeneous and affects the whole retina. 3. In mice, ONT and ONC induce the same temporal course of RGC death, activation of caspase 3, appearance of RGC somas pNFH+ and degeneration of intraretinal axons. 4. RGC loss is significant 3 days after the lesion, and progresses in two phases, one quick until the seventh day, and one slow from the eighth day onwards, therefore the therapeutic window is very narrow. These data are essential to plan neuroprotective strategies. 5. Both, BDNF and the caspase 3 inhibitor ZDEVD_fmk induce the same RGC rescue rate after axotomy. Both delay the beginning of the degeneration by 1 day. 6. A delayed administration of ZDEVD_fmk does not rescue RGCs and several injections are not better than a single one at the moment of the lesion. La axotomía a largo plazo no causa muerte de CGR en la retina contralateral a la lesión en el ratón albino. 7. The response of the general RGC population (Brn3a+) and the melanopsin expressing subpopulation is different, being the survival percent of the latter significantly higher. 8. The expression of pNFH in the RGC somas is an early marker of neuronal degeneration and follows a similar trend to the activation of caspase 3. 9. In mice, as in rats, axonal loss is slower than the loss of neuronal somas.
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    Estudio de la respuesta glial y de las células ganglionares intrínsecamente fotosensibles en dos modelos animales de degeneración hereditaria de fotorreceptores y tras inyecciones intravítreas
    (2017-07-19) Di Pierdomenico, Johnny; Villegas Pérez, María Paz; García Ayuso, Diego; Agudo Barriuso, Marta; Facultad de Medicina
    Objetivos Estudiar el curso temporal de muerte de los fotorreceptores y la respuesta de las células de macro y microglia en el inicio de la degeneración de la retina, en dos modelos animales de degeneración hereditaria de los fotorreceptores con diferentes mecanismos: la rata P23H-1 y la rata Royal College of Surgeons (RCS). Estudiar la población de células ganglionares de la retina intrínsecamente sensibles a la luz que expresan melanopsina (mCGRs) en uno de los modelos de degeneración hereditaria de fotorreceptores: la rata P23H-1. Investigar la respuesta de las células de macro y microglia de la retina de la rata adulta tras una o varias inyecciones intravítreas (IIV). Material y métodos. Para estudiar la evolución de la degeneración de la retina se utilizaron dos modelos de degeneración hereditaria de los fotorreceptores con paradigmas diferentes, la rata P23H-1 y la RCS, y como controles sanos la rata Sprague Dawley (SD) y la Pieval Virol Glaxo (PVG), respectivamente. Los animales fueron procesados entre los 10 y 60 días de edad y se realizaron secciones transversales en criostato de sus retinas. Las secciones fueron inmunodetectadas con anticuerpos contra; i) rodopsina para detectar los segmentos externos de los bastones, ii) Opsinas L/M y S para detectar los segmentos externos de los conos, iii) molécula ionizadora adaptadora de enlace de calcio1 (Iba1) para detectar las células de microglia, iv) proteína ácida fibrilar glial (GFAP) para detectar las células de macroglia , v) antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) para detectar células en división celular, vi) isolectina B4 (IB4) para detectar las células de microglia y vasos sanguíneos. Además, se cuantificaron las filas de núcleos de los fotorreceptores en la capa nuclear externa y las células de microglía en todas las capas de la retina. Para estudiar la población de mCGRs en las ratas P23H-1 y P23H-3 se utilizaron animales con 30, 365 y 540 días de edad y como control se utilizaron ratas SD con la misma edad. Tras diseccionar y montar a plano las retinas, éstas se inmunodetectaron con anticuerpos contra melanopsina y/o Brn3a para detectar la población de mCGR y la población general de células ganglionares de la retina (CGR), respectivamente. Finalmente, se cuantificaron dichas poblaciones y se representó gráficamente su distribución en la retina mediante el uso de mapas de isodensidad para las CGRs y mapas de vecinos para las mCGRs. Además, de estas últimas se analizó su arborización dendrítica. Para investigar la respuesta de las células de macro y microglia tras una o varias IIV se utilizaron ratas hembra adultas SD. Estas recibieron una o tres IIV (una cada 7 días) de anticuerpo anti VEGF derata (5 μl, 0,015 μg / μl), triamcinolona (2,5 o 5 μl, 40 μg / μL, Trigón Depot), bevacizumab (5 μL y 25 μg / µL, Avastin), o sus vehículos (PBS y solución salina equilibrada (BSS)). Las retinas se analizaron 7 días después de la última inyección, se montaron a plano y se incubaron con anticuerpos contra: i) Iba1, ii) GFAP y iii) vimentina (marcador específico de las células de Müller). Las células de macro y microglia fueron analizadas cualitativamente, además las células de microglia fueron analizadas cuantitativamente mediante un método semiautomático. En todos los estudios las retinas fueron examinadas con un microscopio de fluorescencia. En el estudio de las IIV también se utilizó además microscopía confocal. Resultados. Al analizar las retinas en los animales con degeneración retiniana, se observó que la degeneración de los fotorreceptores comenzaba antes y progresaba más rápidamente en las ratas P23H-1 que en las ratas RCS. Sin embargo, en ambos modelos de degeneración, la activación de las células de microglía ocurría simultáneamente a la muerte de los fotorreceptores; mientras que la sobreexpresión de GFAP en los astrocitos y células de Müller, comenzaba más tarde y con mayor intensida en estas últimas. A medida que progresaba la degeneración, en contraste con los animales sanos, encontramos células microgliales en las capas nuclear externa y de los segmentos externos de los fotorreceptores. Además, el número de células microgliales aumentó en la totalidad de la retina, pero disminuyendo en la retina interna y aumentando en la retina externa. Tanto el número total de células de microglia como la migración de las mismas desde las capas internas hacia las externas fue mayor en las ratas RCS. El mayor número de células microgliales en las retinas degeneradas no se puede explicar solamente con la migración intrarretiniana y además la inmunodeteccion de PCNA reveló proliferación microglial en ambos modelos, aunque más importantemente en las ratas RCS. Cuando se analizó la población de mRGCs y de CGRs en las ratas P23H-1 jovenes comparadas con los animales controles se observó una disminución significativa en las CGRs que expresan Brn3a, pero no de mRGCs. Sin embargo, en las ratas P23H-1 adultas se observó una disminución del número de mRGCs y de CGRs de un 22.6% y un 28,2% a los 365 y 540 días de edad, respectivamente. Además, con el tiempo se observó una disminución en los parámetros de arborización dendrítica de las mRGCs tanto en las ratas P23H-1 como en las ratas P23H-3 (cepa en la que la degeneración de la retina es más lenta). Al analizar la coexpresión de Brn3a y melanopsina en las ratas P23H-1 se encontró un porcentaje significativamente superior de coexpresión de ambos marcadores ya a 30 días de edad (3.31%) con respecto a los animales control (0.27%), además, este porcentaje de coexpresión aumentaba con la edad en las ratas P23H-1 (10,65% a 540 días de edad). Estos cambios celulares y de expresión se observaron solamente en los animales con degeneración hereditaria de los fotorreceptores (P23H-1), ya que en las ratas SD no se observó ningún cambio en la población general de CGR, ni en las población de mRGCs, ni en el porcentaje que mostró coexpresión (0.27%). Finalmente, en las retinas tratadas con las IIV se encontró en la zona de la inyección y a lo largo de toda la retina una importante respuesta de las células de macro y microglia, sin importar la sustancia inyectada; y esta respuesta fue mayor en las retinas que habían recibido varias inyecciones. También se observó una leve respuesta de las células de microglia tras las IIV en las retinas contalaterales que no habían sido inyectadas. Cuando se inyectó el anticuerpo humanizado bevacizumab, este causó una reacción/respuesta microglial tan fuerte que no se pudieron cuantificar las células de microglia. Al analizar la respuesta de las células de macroglia a las IIV se observaron dos tipos de respuesta: hipertrofia astrocítica e hipertrofia de los pies de las células de Müller. La hipertrofia de los astrocitos se observó en toda la superficie de las retinas inyectadas, mientras que la hipertrofia de los pies de las células de Müller sólo se observó en zonas bien definidas de la retina tras las inyecciones de triamcinolona y/o tras inyecciones repetidas. Conclusiones. En las degeneraciones hereditarias de los fotorreceptores la degeneración de la retina tiene un patrón diferente dependiendo del mecanismo etiopatogenico. En los dos modelos estudiados, la activación y migración de las células de microglia es simultánea a la muerte de los fotorreceptores, mientras que la respuesta de las células de macroglia es más tardía. La respuesta de la microglia no se puede explicar solamente en base a la muerte de los fotorreceptores ya que en los dos modelos existe una muerte severa de los fotorreceptores pero la respuesta de la microglia es mayor en las ratas RCS. Por lo tanto, en las ratas RCS la inflamación retininana es mayor y probablemente respondería mejor a un tratamiento antinflamatorio dirigido a la inhibición de las células de microglia. Tras la degeneración de los fotorreceptores hay una perdida secundaria de la población general de CGRs y de mCGRs. Las mCGRs supervivientes mostraron parámetros de arborización dendrítica disminuidos y aumento de la coexpresión de Brn3a y melanopsina. Estos cambios fenotípicos y moleculares pueden representar un esfuerzo de las mCGRs capaces de expresar Brn3a para resistir a la degeneración y / o supervivencia preferencial de las mCGRs. Las inyecciones intravítreas causan una respuesta en las células de macro y microglia que varía dependiendo de las sustancias inyectadas y del número de inyecciones. A mayor número de inyecciones mayor respuesta. Además la respuesta inflamatoria de la glía puede influir en los efectos de las sustancias inyectadas en la retina. SUMMARY. Purpose. To study the temporal course of photoreceptor cell death and macro and microglial reactivity in two rat models of retinal degeneration with different etiologies: the P23H- 1 and the Royal College of Surgeons (RCS) rat strains. To study the population of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells (melanopsin-expressing RGCs, m+RGCs) in a rat model of inherited photoreceptor degeneration: theP23H-1 strain. To investigate the macro and microglial response of the normal rat retina after one or several intravitreal injections. Material y methods. To study the evolution of degeneration in two models of inherited retinal degeneration, we have used the P23H-1 and Royal College of Surgeon rat strains, and control age-matched animals: Sprague Dawley (SD) for the P23H1 rats and Pieval Virol Glaxo (PVG) for the RCS rats. The animals were sacrificed at different postnatal ages (P) (from P10 to P60), and their retinas were cryostat cross-sectioned. Sections were immunodetected with antibodies against: i) rhodopsin to label the rod outer segment, ii) L/M and S opsin to label the cone outer segments, iii) ionized calcium-binding adapter molecule1 (Iba1) to label microglial cells, iv) glial fibrillary acid protein (GFAP) to label macroglial cells, v) proliferating cell nuclear antigen (PCNA) to label cellular proliferation, and vi) isolectin B4 (IB4) to detect microglial cells and blood vessels. The numbers of photoreceptor nuclei rows in the outer nuclear layer and of microglial cells in the different retinal layers were quantified. To study the population of m+RGCs in P23H-1 rats we have used 30, 365, and 540 days old animals (P30, P365 and P540). As controls, we have used age-matched SD rats. The retinas were dissected as whole-mounts and immunodetected with antibodies against melanopsin and Brn3a to detect m+RGCs and the general population of RGCs, respectively. These populations were quantified and their distribution graphically represented with isodensity maps (for RGCs) and neighbour maps (for mRGCs). In addition, some morphometric dendritic parameters of m+RGCs were analysed. To investigate the response of macro and microglial cells after one or more intravitreal injections (IVI) we used SD rats. The left eye received one or three (one every 7 days) IVI of anti-rat VEGF (5 μL; 0.015 μg/μL), triamcinolone (2.5 or 5 μL; 40 μg/μL; Trigón® Depot), bevacizumab (5 μL; 25 μg/μL; Avastin®), or their vehicles (PBS and balanced salt solution). Seven days after the last injection retinas were dissected as whole mounts and incubated with antibodies against: i) Iba1, ii) GFAP, and iii) vimentin (to label Müller cells). Macroglial cells were qualitatively analysed, while microglial cells were quantified using a semiautomatic method. In all studies retinas were examined with a fluorescence microscope, and some retinas that received IVI were observed with confocal microscopy. Results. In young animals with inherited retinal degeneration, photoreceptor degeneration starts earlier and progresses quicker in P23H-1 rats than in RCS rats. However, in both models, microglial cell activation occurs simultaneously with the initiation of photoreceptor death while GFAP over-expression in astrocytes and Müller cells begins later. As degeneration progresses, the total numbers of microglial cells in the retina increase and the numbers of microglial cells in the different layers increase in the outer retinal layers, but decrease in the inner retinal layers, more markedly in RCS rats. Microglial cells reach the outer nuclear and outer segment layers in both models. The higher number of microglial cells in dystrophic retinas cannot be fully accounted by intraretinal migration and PCNA immunodetection revealed microglial proliferation in both models, but more importantly in the RCS rats. Young (P30) P23H-1 rats had significantly lower numbers of Brn3a+RGCs than P30 SD control rats, while the population of m+RGCs was similar in both strains at this age. However, in adult P23H-1 rats there was a decrease in the number of m+RGCs and RGCs of 22.6% and 28.2% at 365 and 540 days of age, respectively. In addition, a decrease in morphometric dendritic parameters of m+RGCs was observed over time in both P23H-1 and P23H-3 rats (a rat line with a slower retinal degeneration). When analysing the co-expression of Brn3a and melanopsin in the P23H-1 rats, a significantly higher percentage of co-expression of both markers was found in m+RGCs already at P30 (3.31%) when compared to control animals (0.27%). This co-expression increased with age reaching 10.65% at P540. Finally, in the retinas treated with IVI we found that all the injected substances caused an important micro- and macroglial response locally at the injection site and all throughout the injected retina. This response was exacerbated by repeated IVI. In the contralateral non-injected eyes there was a microglial response as well, but it was milder than in the injected eye. The IVI of the humanized antibody bevacizumab caused a very strong microglial reaction in the treated retina. Two types of macroglial response were observed: astrocyte hypertrophy and Müller end-feet hypertrophy. While astrocyte hypertrophy was widespread throughout the injected retina, Müller end-feet hypertrophy was observed only in a specific area of the retina and was more extensive with triamcinolone or after repeated injections. Conclusions. In hereditary photoreceptor degenerations, the observed retinal changes vary depending on the etiopathogenic mechanism. In both models, photoreceptor death and microglial cell activation and migration occurred simultaneously, while the macroglial cell response is delayed. The activation of microglial cells in the degeneration process cannot be explained in the basis only of photoreceptor death: these cells participate more actively in the RCS model. Thus, this model is more inflammatory and would probably respond better to interventions aimed to inhibit microglial cells. Inherited photoreceptor degeneration was followed by secondary loss of RGCs labelled with Brn3a and mRGCs. Surviving mRGCs showed decreased dendritic morphometric parameters and increased coexpression of Brn3a and melanopsin. These phenotypic and molecular changes may represent an effort of mRGCs to resist degeneration and/or preferential survival of the cells capable of synthesizing Brn3a. Intravitreal injections cause micro- and macroglial responses that vary depending on the injected agent and the number of injections. The higher the number of injections, the greater the response. This inflammatory glial response may influence the effects of the injected substances on the retina.
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    Estudio del efecto de la degeneración de los fotorreceptores en la población de células ganglionares de la retina
    (Universidad de Murcia, 2011-10-06) García Ayuso, Diego; Villegas Pérez, María Paz; Agudo Barriuso, Marta; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Oftalmología, Optometría, Otorrinolaringología y Anatomía Patológica
    En esta tesis estudiamos el efecto de la degeneración de los fotorreceptores en la población de células ganglionares de la retina. Utilizamos dos modelos animales de degeneración retiniana: uno inducido por fototoxicidad y otro hereditario (rata transgénica P23H) que producen una pérdida progresiva de fotorreceptores. A los 6 meses tras la fotoexposición o tras el nacimiento, según el modelo estudiado, se observa la aparición de complejos vasculares subretinianos que están conectados con los vasos de retina. A continuación, los vasos de la retina más interna sufren un desplazamiento y, en su trayectoria, estrangulan los haces axonales de las células ganglionares, provocando la muerte de éstas. El desplazamiento vascular posiblemente se deba a la migración de las células del epitelio pigmentario hacia la retina interna utilizando la superficie de los vasos. En conclusión, la degeneración de los fotorreceptores causa la muerte de las células ganglionares de r etina independientemente de su etiología. In this thesis we analyze the effect of photoreceptor degeneration on the retinal ganglion cell population. We use two different rat models of retinal degeneration, light-induced and inherited (transgenic P23H rat) in which there is a progressive loss of photoreceptors. Six months after light exposure or after birth, depending on the model studied, subretinal vascular complexes connected to the retinal vessels start to appear. Next, the inner retinal vessels are displaced towards the subretinal vessels and in their trajectory strangulate the retinal ganglion cell axons causing their death. Vascular displacement may be due to the migration over the vessels surface and towards the inner retina of retinal pigment epithelium cells. In conclusion, photoreceptor degeneration causes retinal ganglion cell death regardless of its etiology.
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    Identificación y caracterización de la población total de las células ganglionares de la retina en rata : nuevos métodos de trazado, expresión de melanopsina y de factores de transcripción Brn3:estudio de la respuesta neuronal y microglial a la axotomía y efecto del envejecimiento en la retina
    (2015-12-01) Nadal-Nicolás, Francisco Manuel; Agudo Barriuso, Marta; Vidal Sanz, Manuel; Facultad de Medicina
    Introducción La retina es parte del sistema nervioso central (SNC) y se localiza en la cara interna del globo ocular. Su función principal es la fototransducción de las ondas electromagnéticas del espectro de la luz visible en energía eléctrica. Esta función es realizada por los fotorreceptores (conos y bastones). Tras su procesamiento, la información llega a las células ganglionares de retina (CGR). Las CGR son las únicas neuronas aferentes de la retina y transmiten la información visual al cerebro a través de sus axones, que forman el nervio óptico (NO). En roedores, la mayoría de las CGR proyecta contralateralmente, siendo la población ipsilateral menor del 5%. Dentro de las CGR existe un subtipo que contiene un pigmento fotosensible, la melanopsina, que les confiere la propiedad de la fototransducción. Estas CGR melanopsínicas son responsables principalmente de funciones extravisuales o no formadoras de imágenes, como son el reflejo pupilar o la sincronización del ritmo circadiano con la luz. Objetivos 1º Caracterizar un muevo marcador para identificar las CGR de rata: Brn3a. 2º. Caracterizar la expresión de los factores de transcripción de familia Brn3 en las CGR de rata: Brn3a, Brn3b y Brn3c. 3º. Caracterizar las CGR desplazadas en rata albina y pigmentada. 4º. Caracterizar la población de CGR con proyección retino-retiniana en rata. 5º. Desarrollar nuevos métodos de trazado de las CGR de rata: desde el nervio óptico intacto y desde el tracto óptico. 6º. Analizar el efecto del trazado y la lesión axonal en las CGR melanopsínicas y en la expresión de melanopsina en rata albina y pigmentada. 7º. Caracterizar el efecto a largo plazo de la lesión del nervio óptico en la población general de CGR y CGR melanopsínicas ortotópicas y desplazadas y en el resto de las células que componen la capa de células ganglionares en rata albina y pigmentada. 8º. Caracterizar la respuesta de las células microgliales en la retina de rata tras axotomía del nervio óptico. 9º. Caracterizar el efecto del envejecimiento en la retina de rata albina y pigmentada. Material y Métodos. Resultados y Conclusiones Para identificar las CGR clásicamente se han usado técnicas de trazado. Los trazadores como el Fluorogold® (FG) se aplican o en el NO, para identificar la proyección retinofugal completa, o en los colículos superiores (CS), adonde proyectan el 98,4%% de las CGRs en roedores. En esta tesis hemos puesto a punto dos métodos nuevos de trazado: desde el NO intacto o desde el tracto óptico mediante una inyección bilateral estereotáctica. Ambas técnicas son asequibles, reproducibles y fiables. Además, hemos caracterizado el Brn3a como marcador de CGR. El Brn3a es un marcador fiable y eficiente para identificar y cuantificar las CGR en retinas intactas y con lesión axonal y además, permite analizar la topografía de las CGR después del daño axonal ya que a diferencia de los trazadores neuronales, no presenta interferencia con la microglía fagocítica trazada transcelularmente. Conjuntamente hemos analizado la expresión de los tres miembros de la familia Brn3 en las CGR, y hemos demostrado que el 70% de las CGR co-expresan dos o tres miembros de la familia Brn3 y el 30% restante expresa solamente Brn3a (26%) o Brn3b (4%) en retina de rata. Por tanto, el Brn3a se expresa en todas las CGRs exceptuando las CGR melanopsínicas y la mitad de la población ipsilateral. La mayoría de las CGR se localizan en la capa de las células ganglionares (CCG), conocidas como CGR ortotópicas (CGRo), aunque una pequeña población de CGR se encuentra desplazada a la capa nuclear interna o a la capa plexiforme interna. Estas CGR se llaman células de Dogiel o CGR desplazadas (CGRd). Nosotros hemos estudiado a ambas poblaciones en paralelo. Mientras que las CGR ortotópicas se distribuyen principalmente por la región dorso-central de la retina, las CGR desplazadas tienen una topografía diferente, se encuentran en el ecuador de la retina, con un densidad mayor en la retina temporal y son más abundantes en la rata pigmentada. La mayoría de las CGRd expresan Brn3a, y una pequeña proporción expresa melanopsina, estas últimas se distribuyen de manera similar a las CGRo melanopsínicas: son más abundantes en la retina dorso-temporal. Existe una pequeña población de CGR que proyecta a la retina contralateral, éstas son las CGR de proyección retino-retiniana (CGR ret-ret). Hemos corroborado que esta proyección es mayor en animales jóvenes que en adultos y que se encuentran preferentemente en la retina nasal y, además hemos demostrado que éstas expresan Brn3a o melanopsina y que, las que lo hacen, son las que se mantienen en los animales adultos. En la CCG, además de las CGRo hay otras poblaciones celulares: células endoteliales, células gliales y las células amacrinas desplazadas (CAd). En esta tesis hemos descrito que el 45% de las neuronas de la CCG son CGRs y el 55% restante son CAd. Y si excluimos las células endoteliales, las células gliales representarían un 10% de la población total de la capa de células ganglionares. En esta tesis, también analizamos como el albinismo afecta a las CGR. El albinismo es una enfermedad hereditaria, en la que hay una ausencia parcial o total de pigmentación que, entre otras, provoca una serie de anomalías en el sistema visual tales como una menor proyección ipsilateral y número de CGRd y, la agudeza visual y el nistagmus optocinético están afectados. Nosotros hemos demostrado que el albinismo produce los mismos defectos en la población melanopsínica que en el resto de las CGR: disminución en el número de CGRd-m y una proporción inferior de ipsilateralidad. Las lesiones en el SNC provocan la muerte neuronal con secuelas permanentes e irrecuperables, ya que las neuronas del SNC no se reemplazan. En esta tesis hemos utilizado dos modelos de degeneración de SNC que afectan específicamente a las CGR: la lesión traumática axonal por sección (SNO) o aplastamiento (ApNO) de nervio óptico, y la hipertensión ocular (HTO) como modelo de glaucoma aumentando la presión intraocular por fotocoagulación láser de la malla trabecular y las venas perilimbares y episclerales. Usando el modelo de la elevación de la presión intraocular hemos observado que las CGR desplazadas presentan la misma respuesta que las CGR ortotópicas. Y los modelos de axotomía de nervio óptico también nos han permitido documentar que estas lesiones causan la pérdida específica de CGR (ortotópicas y desplazadas), sin afectar a otras poblaciones de la capa de células ganglionares. Sin embargo, dentro de las CGR, las CGR melanopsinicas tienen un curso temporal de pérdida diferente, son más resistentes a la lesión, pero la expresión de melanopsina se infra-regula transitoriamente como respuesta tanto la axotomía como al trazado retrógrado desde el NO. Así, este hallazgo debe ser tenido en cuenta cuando se utilice la melanopsina para estudiar la población de las CGR intrínsicamente fotosensibles. Las células de la microglía (CM) son los macrófagos residentes del SNC. En condiciones normales se encuentran en estado de vigilancia. Sin embargo, tras una lesión neurodegenerativa se activan fagocitando desechos celulares. La aproximación experimental que se utiliza para identificar las CM que han fagocitado una neurona (o CM fagocíticas, CMF) se basa en el hecho de que las CM acumulan en sus fagolisosomas productos exógenos, proceso conocido como marcaje transcelular. Así, cuando una CM fagocita una CGR en degeneración previamente trazada, acumula el trazador siendo posible distinguirla de las CM que no han fagocitado. En esta tesis hemos cuantificado y analizado la distribución de las CM en la CCG y la CPI tanto en animales intactos como después de ambos modelos de axotomia (SNO y ApNO). La aparición de las CMF después del insulto aumenta al aumentar el tiempo post-lesión y se distribuyen en la región central de la retina donde hay una mayor pérdida de las CGR, a diferencia de los animales intactos donde se distribuyen homogéneamente. Aunque éste aumento de CMF es más rápido después de la SNO, existe una correlación lineal y topográfica entre la aparición de las CMF y la pérdida de CGR. La aparición de las CMF en la CCG y el descenso de las CM no fagocíticas en la CPI a 14d de ambas lesiones, sugiere que tras la lesión de las CGR las CM migran entre ambas capas. La pérdida funcional o estructural de la actividad sensorial relacionada con la edad, es muy relevante cuando afecta al sistema visual, ya que de él dependemos más que de otros sentidos. No sólo los componentes puramente físicos implicados en la visión (córnea, cristalino, humor vítreo y humor acuoso) sufren cambios estructurales que influyen en la eficiencia de la transmisión lumínica perjudicando la calidad de la visión, sino que hay pérdida numérica y funcional en las poblaciones celulares implicadas en la transmisión de la información hasta el cerebro que aumenta con la edad. En esta tesis hemos comprobado que el envejecimiento causa principalmente un déficit funcional de la retina en ambas estirpes de rata analizadas. Pero anatómicamente, ni el número de células en la CCG, ni el transporte axonal anterógrado disminuyen con la edad, solamente en la cepa pigmentada, hay un descenso del número de fotoreceptores tipo cono. Y mediante un análisis “in vivo” (SD-OCT), también hemos observado un alargamiento y adelgazamiento progresivo de la retina. Para la realización de esta tesis ha sido necesario el desarrollo de rutinas informáticas que permitan tanto la cuantificación como la representación grafica de la distribución de las diversas poblaciones celulares estudiadas en la retina. Todas estas metodologías automáticas fueron realizadas en colaboración con D. Manuel Jiménez López. Introduction The retina is part of the central nervous system (CNS) and it is located in the posterior part of the ocular globe. The main function of the retina is to sense light. Photoreceptors, cones and rods and send the luminous information to retinal ganglion cells (RGCs) through intermediate neurons. RGCs are the only afferent retinal neurons and transmit this information from the retina to the retinorecipient areas in the brain through their axons that form the optic nerve (ON). In rodents, the majority of RGC project to the contralateral superior colliculi (SCi), being the ipsilateral projection smaller than 5%. There is a subtype of RGC that expresses a photosensitive pigment, melanopsin, that confers them the ability of phototransduction. Melanopsin+RGC (m+RGC) are responsible for the non visual functions triggered by light, such as the pupilary reflex and the circadian photoentrainment. Objetives 1st. To characterize Brn3a as a marker of rat RGCs. 2nd. To characterize the expression of Brn3 transcription factors, Brn3a, Brn3b and Brn3c, in rat RGCs. 3rd. To characterize the population of displaced RGCs in albino and pigmented rats. 4th. To characterize the population of RGCs that project retino-retinially. 5th. To investigate the efficiency of two new methods to trace rat RGCs: from the intact optic nerve and from the optic tract. 6th. To analyze the effect of tracing or axotomy on the expresión of melanopsin and detection of melanopsin+RGCs in albino and pigmented rat RGCs. 7th. To analyze in albino and pigmented rats the long term effect of optic nerve injury on RGCs and m+RGCs orthotopic and displaced, and on the rest of the ganglion cell layer cells. 8th. To analyze the microglial response in the rat retina after optic nerve axotomy. 9th. To study in albino and pigmented rats the effect of aging on the retina. Material and Methods. Results and Conclusions Retrograde tracing with tracers such as Fluorogold® (FG) is the classical approach to identify RGCs. Tracers are applied in the ON to identify the whole retinofugal projection or on the SC, where 98.4% of the RGC project to. In these thesis, we have tuned up two new methods to trace rat RGCs: from the intact optic nerve and from the optic tract by a bilateral stereotactic injection. Both techniques are affordable, reproducible and reliable. In addition we have characterized the Brn3a as a marker of rat RGCs. Brn3a is a reliable marker to identify, quantify and assess the viability of rat RGCs in health and disease. In addition, Brn3a immunodetection allows quantifying and determining the topography of RGCs after a given injury without interference of transcellularly- labelled microglial cells. We have analyzed the expression of the three members of the Brn3 family RGC, and we have shown that 70% of RGC co-express two or three Brn3 members and the remaining 30% expresses only Brn3a (25%) or Brn3b (4%). Brn3a is expressed by all RGCs except melanopsin+ ones and half of the ipsilateral projection. Most of the RGC are placed in the ganglion cell layer (GCL), these are orthotopic RGC (oRGC). However a small proportion of them is located in the inner nuclear layer or in the inner plexiform layer. These are known as Dogiel's cells or displaced RGC (dRGC). We have studied both counterpart together. While the ortothopic RGCs, are denser in the dorso-central retina, the displaced RGCs have a different topography, they are found in the retinal equator, with a higher density in the temporal retina and are more abundant in pigmented animals. Most of the dRGCs express Brn3a, and a small proportion express melanopsin, the last ones have a similar distribution than the m+-oRGCs: they are more abundant in the dorso-temporal retina. There is a small number of RGC projects to the contralateral retina, these are retino-retinal projecting RGC (ret-ret RGC). We have beared out the retino-retinal projection is minute but higher in young than in adult animals. Ret-ret RGCs are mainly nasal, and express Brn3a or melanopsin and those do it, are preserved in adult animals. In the GCL besides oRGC there are endothelial cells, glial cells and displaced amacrine cells (dAC). In this work, we have described that 45%percent of neurons in the GCL are RGCs, and 55% are displaced amacrine cells. And, if we exclude the endothelial cells, glial cells represent 10% of the total cell population of the ganglion cell layer. In this thesis, we have also analyzed how albinism affects RGCs. Albinism is a hereditary disease caused by the partial or total lack of pigmentation that causes a long list of abnormalities in the visual system such as an impaired visual acuity and optokinetic nystagmus and defects in the crossing of the retinofugal projections. Here, we added to this knowledge, that albinism produces in the melanopsin population the same defects than in the general RGC population: reduced number of displaced m+RGCs and a lower ipsilaterally. CNS lesions induce the permanent and irreversible death of the affected neurons, since CNS neurons do not proliferate and thus, are not replaced. In this thesis we have used two models of RGC degeneration: traumatic axonal injury (axotomy) transecting (ONT) or crushing (ONC) the optic nerve, and ocular hypertension (OHT), a model of glaucoma created by increasing the intraocular pressure with laser photocoagulation of the trabecular meshwork, the perilimbar and episcleral veins. Using the ocular hypertension, we have observed that the dRGCs and oRGC respond similarly to lesion. And the axotomy models also allowed us to document that after axotomy only RGCs are lost (ortothopic and displaced) without affecting other populations in the ganglion cell layer. However, within RGCs, the m+RGCs have a different course of loss, they are more resistant to injury, but the expression of melanopsin is temporarily under-regulated in response to both axotomy and retrograde tracing from the NO. Thus, this finding should be considered when melanopsin is used to study the population of the intrinsically photosensitive CGR. Microglial cells (MC) are the CNS resident macrophages. In the healthy CNS they are found in a resting (surveying) state. However, during a neurodegenerative process, they activate and among other functions, phagocytose the cellular debris. The experimental approach to identify CM that have phagocytose a neuron (phagocytic microglial cells, PMC) is based on the fact that CM accumulate in their phagolysosomes exogenous compounds, such as tracers. This process is known as transcellular tracing. Thus, when a MC engulfs a traced RGC it is possible to distinguish it from the rest of MC. In this thesis, we quantified and analyzed the distribution of MC in the GCL and the IPL in intact animal or after both axotomy models (SNO and APNO). The number of CMF after the insult increases with time post-injury. These PMC are distributed in the central region of the retina where the loss of RGCs is greater, unlike in intact animals where they are homogeneously distributed. The appearance of PMC correlates linearly and topographically with the loss of RGCs. The increase of PMC in the GCL and the decrease of MC in the IPL suggest that upon RGC injury, MC migrate between both layers. Aging is very relevant when affects the visual system, since we depend on vision more than on any other senses. Not only the physical components of the eye (cornea, lens, vitreous and aqueous humor) through which the light passes age, there is also a progressive neuronal loss and degeneration. In this thesis we found that aging causes, mainly, a functional deficit in the retina in both rat strains. Anatomically, neither the number of cells in the GCL nor the anterograde axonal transport diminishes with age, however, in the pigmented, but not in the albino rat, there is a loss of cone photoreceptors. And by “in vivo” analysis (SD-OCT), we have also observed a progressive elongation and thinning of the retina. For the consecution of this thesis it has been necessary to develop several automated routines to perform the quantification and graphic representation of the different cell populations analyzed. All these automated methodologies were created in collaboration with D. Manuel Jimenez López.