Ciencias de la Salud

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https://hdl.handle.net/10201/61
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Browsing Ciencias de la Salud by browse.metadata.advisor "Águila Martínez, Sonia"

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    Mecanismos moleculares y abordaje terapéutico de la NETosis : caracterización funcional de miR-146a y potencial del reposicionamiento farmacológico
    (Universidad de Murcia, 2026-06-03) Zapata Martínez, Laura; González-Conejero Hilla, Rocío; Martínez Gómez, Constantino; Águila Martínez, Sonia; Sin departamento asociado; Escuela Internacional de Doctorado
    Los neutrófilos constituyen la primera línea de defensa del sistema inmunitario. Un mecanismo central abordado en esta Tesis es la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET), estructuras compuestas por cromatina asociada a histonas y proteínas antimicrobianas. Además de su función antimicrobiana, las NET ejercen una actividad protrombótica, pero cuando descontrola causa trombo-inflamación.Nuestro grupo demostró previamente que miR-146a, un regulador negativo de la respuesta inmune y que desempeña un papel clave en la modulación de la NETosis. En humanos, los portadores del rs2431697-T presentan una reducción del miR-146a y mayor incidencia de eventos cardiovasculares en patologías thrombo-inflamatorias. Sin embargo, los mecanismos moleculares responsables no se conocen.Un paso crítico en la NETosis es la activación de PAD4, enzima responsable de la citrulinación de histonas y la descondensación de la cromatina, siendo una diana terapéutica en enfermedades trombo-inflamatorias. En este contexto, el reposicionamiento de fármacos representa una estrategia eficiente, ya que permite aprovechar compuestos con perfiles de seguridad conocidos, reduciendo costes y tiempos de desarrollo.El primer objetivo fue identificar nuevas rutas moleculares reguladas por miR-146a en neutrófilos, implicadas en la formación de NET. El segundo objetivo consistió en evaluar una estrategia de reposicionamiento de fármacos para identificar inhibidores de PAD4 para modular la NETosis.Para el Objetivo 1, se analizaron neutrófilos de médula ósea de ratones WT y miR-146a-/-. Se evaluaron la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) por citometría, la explosión respiratoria (Seahorse) y la fosforilación de Erk y Akt. La expresión génica de enzimas por qRT-PCR. La autofagia se estudió por western blot e inmunofluorescencia. La activación del inflamasoma se determinó mediante qRT-PCR y ELISA. Se realizaron análisis metabolómicos no dirigidos y dirigidos empleando trazadores. El fenotipo de neutrófilos se caracterizó por CyTOF, y la dinámica de rolling y adhesión se evaluó mediante microscopía intravital.Para el Objetivo 2, se llevó a cabo un docking molecular entre PAD4 y fármacos aprobados. El gilteritinib fue seleccionado según criterios predefinidos y evaluado in vitro en neutrófilos humanos e in vivo en ratones WT. La formación de NET se analizó tras estimulación con PMA, ionóforo o LPS, mediante detección de citH3/DNA por inmunofluorescencia. La actividad endógena de PAD4 se midió con un ensayo fluorogénico y la generación de ROS. Se desarrolló un modelo murino de endotoxemia subletal inducida por LPS en ratones pretratados con gilteritinib, cuantificando NET plasmáticos, evaluando la presencia de microtrombos y daño pulmonar.Los neutrófilos deficientes en miR-146a mostraron mayor producción de ROS, de la explosión respiratoria y de la activación de pErk y pAkt. Se descartó la contribución de ROS mitocondriales, indicando un papel predominante de la NADPH oxidasa. Sin embargo. Además, presentaron alteración del flujo autofágico, un incremento de Lamp2a y una mayor activación del inflamasoma Nlrp3. El análisis metabolómico evidenció un mayor flujo de glucosa al TCA. Los ratones miR-146a-/- mostraron neutrofilia basal y mayor movilización de neutrófilos inmaduros durante inflamación sistémica, así como menor rolling y mayor adhesión vascular.El gilteritinib se identificó como inhibidor de PAD4 con una IC50 de 0,81uM. Así, redujo significativamente la formación de NET en neutrófilos humanos, disminuyendo la actividad de PAD4 endógeno (83,5%) y el pErk. En el modelo in vivo, redujo los NET circulantes, la inflamación pulmonar y la formación de microtrombos.En conjunto, la deficiencia de miR-146a induce un fenotipo de neutrófilos hiperactivo con reprogramación metabólica, alteraciones en la autofagia, el inflamasoma y otras rutas moleculares, que favorecen una NETosis exacerbada y un perfil protrombótico. Asimismo, el reposicionamiento farmacológico permitió identificar al gilteritinib como un inhibidor prometedor de PAD4 capaz de atenuar la NETosis y el daño trombo-inflamatorio in vitro e in vivo.