Clove essential oil nanoencapsulated in β-cyclodextrins improves the welfare at slaughter in different farm fish species : parameters of stress and innate immune response

Abstract

El objetivo principal de esta tesis fue mejorar el bienestar de cinco especies de peces de cultivo (dorada, salmón Atlántico, tilapia del Nilo, lubina europea y trucha arcoiris) en el momento del sacrificio mediante el uso de aceite esencial de clavo nanoencapsulado en β-ciclodextrinas (CEO+β-CD). El complejo anestésico se comparó con el método de aturdimiento más utilizado en acuicultura (enfriamiento con hielo picado y agua de mar). Se estudió un rango de concentraciones de CEO+β-CD (de 5 a 60 mg/kg), temperaturas (de -8.0 a 29.0 °C), tipos de hielo (líquido y triturado) y condiciones de cultivo (experimental e industrial). Además, se estudió un manejo innovador bajo condiciones de cultivo industrial, utilizando una dosis baja de CEO+β-CD en peces que nunca habían sido anestesiados durante su ciclo productivo. Además, se comparó una dosis baja de eugenol nanoencapsulado en β-CD en agua de mar con eugenol o aceite de clavo solo. El primer objetivo fue reducir los tiempos de inducción de la anestesia durante la pérdida total de equilibrio y la pérdida de actividad refleja. En todos los peces de cultivo estudiados, el CEO+β-CD disminuyó los tiempos de inducción de anestesia, permitiendo el uso de dosis bajas de CEO en condiciones de cultivo experimental e industrial a diferentes temperaturas en mar y agua dulce. La nanoencapsulación de eugenol en β-CD también redujo los tiempos de inducción de la anestesia, en comparación con eugenol o CEO. El segundo objetivo fue determinar el nivel de estrés inducido por el complejo anestésico durante el proceso de aturdido. Para ello, se analizaron los niveles de glucosa, lactato, cortisol, pO2, pCO2, HCO3, TCO2, SO2, exceso de base y pH, tanto en plasma como en moco de la piel. También se estudió el nivel de expresión del gen RyR3 en el músculo de dorada. Se llegó a la conclusión de que el método de aturdido menos estresante para la dorada es usando 15 mg de CEO+β-CD/kg inducido en hielo picado (-0.2 °C), en agua de mar. Curiosamente, se obtuvo una conclusión similar para las muestras de dorada que nunca habían sido anestesiadas durante su ciclo productivo. Además, en todas las especies estudiadas se encontró que una dosis baja de CEO+β-CD utilizada para mantener el control o reducir la alteración metabólica inducida por la respuesta al estrés, fue suficiente para suponer que los peces no sufrirían lesiones irreversibles. Por lo tanto, 40 mg CEO+β-CD/L agua, 60 mg CEO+β-CD/L agua, 5 mg CEO+β-CD/kg hielo, 5 mg CEO+β-CD/kg hielo son las dosis óptimas que desencadenaron la respuesta al estrés más baja en el salmón Atlántico, tilapia del Nilo, lubina europea y la trucha arcoiris, respectivamente. Cuando EU+β-CD se probó en dorada, los datos sugirieron una fuerte respuesta al estrés, conduciendo a posibles alteraciones fisiológicas. El tercer objetivo fue estudiar la respuesta inmune innata inducida por el complejo anestésico durante el proceso de aturdido. Se analizó el nivel de expresión de il-1β, tfg-β y Hsp70 en el riñón cefálico de dorada. Además, varias actividades inmunes innatas (peroxidasa, bactericida, anti-proteasa y proteasa) fueron analizadas en el plasma y en el moco. Las dosis de CEO+β-CD mencionadas anteriormente para cada especie alteraron algunos parámetros inmunes innatos en el plasma y en el moco. Sin embargo, el deterioro de la respuesta inmune puede descartarse ya que la actividad bactericida no se vio afectada en la mayoría de las especies. La excepción fue la tilapia del Nilo, en la que observamos un efecto de inmunodepresión a la dosis óptima de CEO+β-CD. Las muestras de dorada tratadas con EU solo o EU+β-CD mostraron inmunosupresión, lo que no se observó en muestras tratadas con CEO solo o CEO+β-CD.

The main objective of this thesis was to improve the welfare of five farmed fish species (gilthead seabream, Atlantic salmon, Nile tilapia, European seabass and rainbow trout) at slaughtering time through the use of clove essential oil nanoencapsulated in β-cyclodextrins (CEO+β-CD). The anaesthetic complex was compared with the stunning method most used in aquaculture (cooling in crushed ice and seawater). A range of CEO+β-CD concentrations (from 5 to 60 mg/kg), temperatures (from -8.0 to 29.0 °C), types of ice (liquid and crushed) and farm conditions (experimental and industrial) were tested. Also, an innovative management of gilthead under industrial farm condition, using a low dose of CEO+β-CD in farmed fish that had never been anesthetized in their productive cycle as their size had always been calculated with underwater cameras, was studied. In addition, a low dose of eugenol nanoencapsulated in β-CD in seawater was compared with eugenol or clove oil alone. The first aim was to reduce the induction times of anaesthesia during the total loss of equilibrium and the loss of reflex activity. In all farmed fish studied, the CEO+β-CD allowed a shorter induction time of anaesthesia, using low doses of CEO under experimental and industrial farm conditions at different temperatures in sea and freshwater. The nanoencapsulation of eugenol in β-CD also reduced the induction times of anaesthesia, compared to eugenol or CEO alone. The second aim was to determine the stress level induced by the anaesthetic complex during the stunning process. For that, the levels of glucose, lactate, cortisol, pO2, pCO2, HCO3, TCO2, SO2, base excess and pH in plasma and skin mucus were tested in all the species studied. The level of expression of RyR3 gene in the skeletal muscle of gilthead seabream, were also studied. We concluded that the less stressful stunning method for gilthead seabream is with crushed ice (-0.2 °C) containing 15 mg CEO+β-CD/kg in sea water. Interestingly, similar conclusion for gilthead seabream specimens that had never been anesthetised during their productive cycle was obtained. In addition, in all the species studied we found that a low dose of CEO+β-CD used to keep under control or reduce the metabolic alteration induced by the stress response was enough to assume that fish would not suffer irreversible lesions. Thus, 40 mg CEO+β-CD/L water, 60 mg CEO+β-CD/L water, 5 mg CEO+β-CD/kg ice, 5 mg CEO+β-CD/kg ice are the optimal doses that triggered the lowest stress response in Atlantic salmon, Nile tilapia, European seabass and rainbow trout, respectively. When EU+β-CD was tested in gilthead seabream, the data suggest a strong stress response that leads to physiological alterations. The third aim was to study the innate immune response induced by the anaesthetic complex during the stunning process. For this, the expression level of the genes coding for two cytokines (il-1β and tfg-β) and a heat sock protein (Hsp70) in the head-kidney (the main haematopoietic tissue in fish) of gilthead seabream, were previously analysed. Then, we analysed several innate immune activities (peroxidase, bactericidal, anti-protease and protease activity) in the plasma and skin mucus of all the species. Our data revealed that the doses of CEO+β-CD mentioned above for each species altered some innate immune parameters in plasma and skin mucus. However, impairment of the immune response can be discounted as the bactericidal activity was not affected in most of the species. The exception was Nile tilapia in which we observed a level of innate activities that pointed to an immune-suppression effect at the optimal dose of CEO+β-CD. Similarly, gilthead seabream specimens treated with EU alone or EU+β-CD showed immune-suppression, which was not observed in specimens treated with CEO alone or CEO+β-CD.