Estudio de la distribución y control de flebotomos vectores de Leishmania infantum y prevalencia de infección en mamíferos silvestres en la Región de Murcia

Abstract

La leishmaniosis es una enfermedad crónica de las zonas cálidas del planeta, causada por protozoos difásicos del género Leishmania (clase Kinetoplasta, familia Trypanosomatidae) transmitidos artrópodos flebotominos, que afecta sobre todo a perros y personas. La especie endémica en el sur de Europa es Leishmania infantum, responsable de la leishmaniosis canina y humana, enfermedades de gran impacto veterinario y de salud pública. Las medidas actuales de prevención de la Leishmaniosis son insuficientes y se centran en el uso de insecticidas con acción repelente en el perro, reservorio primario del parásito. Si bien la eficacia de los insecticidas en condiciones experimentales es cercana al 90%, un estudio epidemiológico en la Región de Murcia (RM) señala que su eficacia es mucho menor en condiciones naturales. Esto se debe en parte a un mal uso de los insecticidas por parte de los propietarios de perros, probablemente porque desconocen el riesgo de picadura de los flebotomos, ya que no existe información actual sobre la abundancia del vector en la Región. Otro aspecto importante que dificulta el control sería la existencia otros posibles reservorios. Estudios recientes con técnicas de diagnóstico moleculares altamente sensibles demuestran que una amplia variedad de especies domésticas y silvestres están infectadas con L. infantum de forma subclínica, lo que hace probable la existencia de un ciclo de transmisión selvático que interaccionaría con el doméstico mantenido por el perro. En la RM no existe información sobre la infección de L. infantum en fauna silvestre. El objetivo general de esta tesis es proporcionar información nueva y útil sobre algunos de los aspectos anteriores con el fin de mejorar el diseño de los programas de control de la leishmaniosis en la RM y otras zonas endémicas. Se realizaron estudios con el fin de: (i) describir la abundancia y distribución de flebotomos en las principales áreas geoclimáticas de la RM, (ii) estimar la prevalencia y distribución de Leishmaniosis en fauna silvestre del sureste español y (iii) detectar anticuerpos frente a proteínas salivares de los flebotomos en perros para comprobar la eficacia repelente de uno de los tratamientos insecticidas frente a flebotomos más populares en Europa. Para el estudio entomológico se empleó un método novedoso de muestreo que permitió comparar la abundancia del vector en las cinco áreas más representativas de la diversidad climática y geográfica de la RM. Se colocaron trampas adhesivas de intercepción y luminosas de atracción en la época de mayor abundancia de flebotomos entre mayo y julio, en 2015 en 25 granjas de ovino y perreras de zonas rurales. Se registró la temperatura, la humedad relativa (HR) y datos de otras variables ambientales y del modo de cría y las características de las instalaciones de los animales, con el fin de investigar su relación con la abundancia del vector, utilizando un sistema de información geográfica (SIG) y modelos multivariables de regresión binomial negativa. Se capturaron 3644 flebotomos, principalmente con trampas de luz, de los cuales un 80% fueron Phlebotomus perniciosus, el principal vector de L. infantum en España. La abundancia varió entre zonas y se asoció positivamente a la altitud, excepto en el rango de 500-700 m donde se registran las medias de velocidades de viento máximas, más elevadas de entre las zonas estudiadas, y fue más alta en julio, especialmente durante una ola de calor de 3 días cuando la HR y la velocidad del viento cayeron en picado. El análisis de regresión indicó que el clima, y no el uso de la tierra o las características del suelo, es el principal modulador de la densidad del vector a escala geográfica grande. Por el contrario, los factores microambientales como las características instalaciones de los animales y las prácticas de cría, afectan al tamaño poblacional del flebotomo a menor escala. Esta información es útil para desarrollar mapas predictivos de abundancia de flebotomos que facilitarían el diseño de programas de control del vector. En el estudio de Leishmaniosis en la fauna silvestre se investigó la infección de L. infantum en muestras de piel y órganos de 202 carnívoros, roedores y lagomorfos del sureste de España, principalmente la RM, empleando una PCR a tiempo real frente a secuencias del kinetoplasto. No se observaron lesiones típicas de Leishmania en ninguno de los animales del estudio, sin embargo, el porcentaje de animales PCR-positivos a L. infantum (prevalencia) fue 32%, concretamente 45% en zorros, 30% en conejos y garduñas, 19% en ratones de campo y 0-100% en otras especies minoritarias incluyendo ratas negras, tejones, gatos monteses, lobos ibéricos, mapaches, ginetas y liebres. La mayoría de conejos fueron PCR-positivos en la piel y no en los órganos, por el contrario la mayoría de los zorros lo fueron en muestras de órganos y no en la piel. La prevalencia de L. infantum fue menor en primavera después de varios meses de ausencia de exposición a los flebotomos, y se correlacionó espacial y temporalmente con la distribución de P. perniciosus y la prevalencia de leishmaniosis en perros y personas, estimada en estudios previos. El análisis genético de L. infantum de zorros llevado a cabo en un estudio paralelo, confirma que el genotipo en ésta especie es frecuente en personas y perros de la Península Ibérica y Marruecos. Los resultados demuestran la presencia de L. infantum en fauna silvestre de la RM y sugieren que los ciclos de transmisión selváticos y domésticos están estrechamente interconectados, lo que debe tenerse en cuenta para mejorar el control de la Leishmaniosis. Se emplearon homogeneizados de glándulas salivales y proteínas recombinantes de P. perniciosus y P. papatasi para investigar la dinámica de anticuerpos anti-saliva en 32 perros tratados con el insecticida tópico Advantix (Bayer®) y expuestos naturalmente a estas especies durante dos años. Ninguno de los perros desarrolló leishmaniosis, pero la mayoría presentó bajos niveles de anticuerpos con un patrón estacional similar a la abundancia de éstos flebotomos. El estudio demuestra que los anticuerpos anti-saliva son un buen marcador de la exposición a los flebotomos que permite estimar la eficacia de los tratamientos con insecticidas en perros. Además, confirma que la eficacia del producto es inferior a 100% aún tras su correcta administración. A pesar de ello, la ausencia de infección en los perros y los bajos niveles de anticuerpos sugieren que el producto es útil en el control de la Leishmaniosis. Leishmaniosis is a disease of dogs and humans caused by Leishmania spp. protozoans, transmitted by hematophagous, Phlebotomine sand flies. Infection is endemic in the warm latitudes of the planet including southern Europe, where the endemic species, Leishmania infantum is responsible for Canine Leishmaniosis, one of the most important diseases of dogs, and human Leishmaniosis that affects hundreds of people in Spain alone. Present measures to prevent Leishmaniosis are insufficient and they primarily focus on the use of insecticides with repellent activity on the dog, which is the primary reservoir of the parasite. Although the efficacy of insecticides in experimental conditions is close to 90%, an epidemiological study in Murcia Region (MR) in Spain indicates that it is much lower, because they are not used correctly. This may indicate that dog owners are not fully aware of the risk of sand fly bites, partly because there is no up to date information on sand fly abundance in the region. Another important aspect hampering control is the existence of reservoirs of infection other than the dog. Recent studies using highly sensitive molecular diagnostic techniques have shown that L. infantum is able to infect a variety of domestic and sylvatic mammals and that it is quite probable that a sylvatic transmission cycle is in operation and interacts with the domestic cycle maintained by the dog. There is no information about L. infantum infection in wildlife in MR. The overall objective of this thesis is to provide new, useful information about some the later aspects in order to improve the design of Leishmaniosis control programs in MR and other endemic areas. To this effect, studies were carried out to: (i) describe Phlebotomine sand fly abundance and distribution in the main geoclimatic areas of the region, (ii) estimate the prevalence and distribution of Leishmaniosis in wildlife in southeast Spain and (iii) evaluate the possibility of monitoring antibodies in dogs against sand fly salivary proteins as a marker of the repellent efficacy of one of the most popular insecticides in Europe. The entomological study of sand flies used a novel sampling method that allowed comparing vector abundance in the five most representative areas of Murcia’s climatic and geographical diversity. Sand fly traps, including sticky interception and light attraction traps were placed in 25 sheep farms in the main five areas, between May and July 2015. Temperature, relative humidity (RH) and data from other environmental and animal husbandry variables were recorded to investigate their relationship with vector abundance, using a Geographical Information system (GIS) and negative binomial regression models. A total of 3644 sand flies were captured mostly with light traps and 80% were Phlebotomus perniciosus, the main L. infantum vector in Spain. Abundance varied between zones and was positively associated to altitude, except in the 500-700 m range where strong winds prevailed, and was highest in July, especially during a 3 day heat wave when RH and wind speed plummeted. Regression models indicated that climate and not land use or soil characteristics have the greatest impact on this species density on a large geographical scale. In contrast, micro-environmental factors such as animal building characteristics and husbandry practices affect sand fly population size on a smaller scale. This information will allow developing sand fly abundance prediction maps, useful to improve the design of sand fly control programs. The Leishmaniosis study in wildlife investigated L. infantum DNA in skin and organs from 202 carnivores, rodents and lagomorphs in southeast Spain, mostly from MR, using a real time PCR test. None of the animals had lesions compatible with Leishmaniosis and the percentage of L. infantum PCR-positives (prevalence) was 32%, specifically 45% in foxes, 30% in rabbits and stone martens, 19% in wood mice and 0-100% in other minoritarian species including black rats, badgers, wild cats, wolves, raccoons, genets and hares. Most rabbits were PCR-positive in skin and not in organs and it was the opposite for foxes. Prevalence was lowest in spring following several months of non-exposure to sand flies and was correlated spatially with P. perniciosus distribution and temporally with prevalence in dogs, estimated in previous studies. Genetic analysis of L. infantum from foxes, carried out as a parallel study, confirm that the genotype is frequent in the Iberian Peninsula and Morocco. These results confirm the presence of infection in wildlife in MR and suggest that sylvatic and domestic transmission cycles are closely interconnected, and this should be taken into account towards improving Leishmaniosis control. Phlebotomus perniciosus and P. papatasi salivary gland homogenates and recombinant proteins were used to investigate anti-saliva antibody dynamics in a cohort of 32 experimental dogs treated with the topical insecticide Advantix (Bayer®), following natural exposure to these sand fly species during two years. None of the dogs developed natural L. infantum but most had low antibody levels against salivary proteins and the mean antibody optical density (OD) was seasonal, similar to P. perniciosus and P. papatasi abundance in the area. The study shows for the first time that anti-saliva antibodies are a good marker of exposure to sand flies and that monitoring them allows estimating the efficacy of insecticide treatments in dogs. Furthermore, it confirms that the efficacy of the product tested is below 100% even when administered correctly. Notwithstanding this, the absence of infection and low ODs suggest that the product is useful to prevent infection and controlling Leishmaniosis in the population