Técnicas instrumentales y computacionales para la caracterización de sistemas de macromoléculas y nanopartículas : implementación y aplicaciones

Abstract

OBJETIVOS

Las nanopartículas metálicas han despertado gran interés en la comunidad científica, debido a las propiedades que presentan, dotándolas de gran utilidad en industria y biomedicina. Por todo ello, gran parte de esta Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio y caracterización de estos sistemas utilizando distintos procedimientos para sintetizar y caracterizar las propiedades de estructuras de nanopartículas recubiertas con polímero. Así mismo, se han estudiado el comportamiento y la estructura de diversas macromoléculas (proteínas, polímeros y fluidos biológicos y sintéticos) mediante las técnicas instrumentales presentes en nuestro laboratorio, las cuales se han puesto a punto previamente. Alguno de los estudios experimentales que se han llevado a cabo han sido complementados, con estudios computacionales mediante la utilización de programas desarrollados por nuestro grupo de investigación. Así, mediante las técnicas experimentales de dispersión de luz dinámica, ultracentrifugación analítica o reometría y programas computacionales como HYDRO, hemos sido capaces de caracterizar macromoléculas y conocer sus propiedades hidrodinámicas. Por lo tanto, los objetivos que se fijaron antes de comenzar esta Tesis Doctoral fueron los siguientes:

1. Síntesis de nanopartículas de oro mediante procedimientos habituales de obtención y recubrimiento de éstas con polímeros biológicos y sintéticos. 2. Estudio y caracterización de macromoléculas, mediante técnicas de ultracentrifugación analítica, reometría y viscosimetría. 3. Estudio teórico de las diferentes macromoléculas sintéticas y biológicas estudiadas experimentalmente, mediante el uso de programas computacionales desarrollados por nuestro grupo de investigación.

METODOLOGÍA

La metodología que se ha empleado durante esta Tesis Doctoral tiene dos aspectos totalmente diferenciados; por un lado, se han desarrollado métodos experimentales mediante las técnicas disponibles en nuestro laboratorio y en los servicios de apoyo a la investigación de la Universidad de Murcia: Dispersión de luz dinámica, espectroscopía visible-ultravioleta y microscopía de transmisión electrónica para la caracterización de las nanopartículas sintetizadas; ultracentrifugación para el estudio de diversas proteínas y polímeros y reometría para el estudio del comportamiento de diferentes fluidos tanto biológicos como sintéticos. Y por otro lado, se han utilizado métodos teóricos y computacionales mediante programas complejos de cálculo y simulación, tales como Hydropro, Visfit, Polycarlo y Simuflex para el estudio de propiedades hidrodinámicas de macromoléculas. También se ha desarrollado un programa durante esta Tesis Doctoral, Rheofit, que nos ha servido para el análisis de resultados experimentales obtenidos en nuestra investigación.

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral han sido satisfactorios debido a que se han cumplido los objetivos fijados. Además, gran parte de estos resultados, han formado parte de publicaciones. A continuación, se describen las conclusiones más importantes de esta Tesis Doctoral:

1. Las técnicas instrumentales aplicadas en la elaboración de esta Tesis Doctoral han resultado ser de gran utilidad para el análisis y caracterización de los diferentes sistemas macromoleculares y nanopartículas que se han estudiado. Entre ellas, la reometría nos permitió conocer el valor de la viscosidad de fluidos biológicos y de fluidos artificiales con gran interés para la reproducción, la viscosimetría nos permitió conocer el poder intercalante de complejos organometálicos de platino sintetizados, debido a la variación de la viscosidad en función del mecanismo de unión de estos complejos con el ADN, con la técnica de ultracentrifugación analítica, pudimos conocer el estado de oligomerización de una enzima procariota y la dispersión de luz dinámica nos permitió demostrar que los picos de corriente obtenidos en un proceso electroquímico corresponden a colisiones individuales de gotas de la emulsión con la interfase.

2. En el estudio de nanopartículas de oro, se pudo comprobar que la estabilidad de las nanopartículas disminuye dependiendo de las condiciones del medio en el que se encuentren, dando lugar a la agregación de éstas. Sin embargo, en presencia de quitosano, dichas nanopartículas se aproximan por atracción electroestática a los agregados formados por éste, evitando así la agregación de nanopartículas.

3. Se caracterizó el PNIPAAM-b-PAMPTMA(+), un polímero termosensible modificado, ya que su carga positiva lo hace de gran interés para el recubrimiento de nanopartículas de oro. Se realizaron unas primeras medidas del polímero con nanopartículas de oro, observándose buenos resultados que nos lleva a continuar con esta investigación.

4. En el estudio de la unión entre nanopartículas de oro y ADN, se concluyó que la ultracentrifugación analítica es un método adecuado para la caracterización de mezclas complejas de productos de reacción. Esta técnica unida a los programas de modelado creados por nuestro grupo de investigación, nos permitió conocer de una manera más exacta la conformación de estos compuestos. OBJECTIVES

Metal nanoparticles have aroused great interest in the scientific community, due to their properties, making them very useful in industry and biomedicine. Therefore, much of this Thesis has focused on the study and characterization of these systems using different procedures to synthesize and characterize the properties of nanoparticle structures coated with polymer. Likewise, the behavior and structure of various macromolecules (proteins, polymers and biological and synthetic fluids) have been studied through the instrumental techniques present in our laboratory, which have been previously developed. Some of these experimental studies have been complemented with computational studies through the use of programs developed by our research group. Thus, through the experimental techniques of dynamic light scattering, analytical ultracentrifugation or rheometry and computational programs like HYDRO, we have been able to characterize macromolecules and to know their hydrodynamic properties. Therefore, the objectives that were set before starting this Doctoral Thesis were the following:

1. Synthesis of gold nanoparticles by usual methods of obtaining and coating these with biological and synthetic polymers. 2. Study and characterization of macromolecules by means of analytical ultracentrifugation, rheometry and viscosimetry techniques. 3. Theoretical study of the different synthetic and biological macromolecules studied experimentally, through the use of computer programs developed by our research group.

METHODOLOGY

The methodology that has been used during this Doctoral Thesis has two totally different aspects; on the one hand, experimental methods have been developed using the techniques available in our laboratory and the research support services of the University of Murcia: Dynamic light scattering, visible-ultraviolet spectroscopy and electron transmission microscopy for the characterization of synthesized nanoparticles; ultracentrifugation for the study of various proteins and polymers and rheometry for the study of the behavior of different biological and synthetic fluids. On the other hand, theoretical and computational methods have been used through complex calculation and simulation programs such as Hydropro, Visfit, Polycarlo and Simuflex for the study of hydrodynamic properties of macromolecules. We have also developed a program during this Doctoral Thesis, Rheofit, which has served us for the analysis of experimental results obtained in our research.

CONCLUSIONS

The results obtained in this Doctoral Thesis have been satisfactory due to the fulfillment of the objectives set. In addition, much of these results have been part of publications. The following are the most important conclusions of this Doctoral Thesis:

1. The techniques applied in the elaboration of this Doctoral Thesis have proved to be very useful for the analysis and characterization of the different macromolecular systems and nanoparticles that have been studied. Among them, the rheometry allowed us to know the value of the viscosity of biological fluids and artificial fluids with great interest for the reproduction, the viscosimetry allowed us to know the intercalating power of synthesized platinum organometallic complexes, due to the variation of the viscosity in the function of the binding mechanism of these complexes with DNA, with the technique of analytical ultracentrifugation, we were able to know the state of oligomerization of a prokaryotic enzyme and the dynamic light scattering allowed us to demonstrate that the current peaks obtained in an electrochemical process correspond to individual collisions of droplets of the emulsion with the interface.

2. In the study of gold nanoparticles, it was possible to verify that the stability of the nanoparticles decreases depending on the conditions of the medium in which they are found, giving rise to the aggregation of these. However, in the presence of chitosan, said nanoparticles are approximated by electrostatic attraction to the aggregates formed by it, thus avoiding the aggregation of nanoparticles.

3. We characterized PNIPAAM-b-PAMPTMA (+), a modified thermosensitive polymer, since its positive charge makes it of great interest for the coating of gold nanoparticles. First measurements of the polymer were made with gold nanoparticles, observing good results that leads us to continue this research.

4. In the study of the connection between gold nanoparticles and DNA, it was concluded that analytical ultracentrifugation is a suitable method for the characterization of complex mixtures of reaction products. This technique, together with the modeling programs created by our research group, allowed us to know more precisely the conformation of these compounds