Chemical modification of proteins, applications in inmobilization, catalytic performance and fluorescent labeling = Modificación química de proteínas, aplicaciones en inmovilización, actividad catalítica y marcaje fluorescente

Abstract

Esta tesis doctoral titulada “Modificación química de proteínas, aplicaciones en inmovilización, actividad catalítica y marcaje fluorescente” tiene como objetivo desarrollar metodologías de modificación química de proteínas y aplicaciones de las mismas. La tesis se ha dividido en cuatro bloques en cada uno de los cuales se aborda una metodología de modificación de proteínas y se propone una o más aplicaciones de la metodología. En un primer bloque de contenido se plantea mejorar la tecnología de inmovilización “sin soporte”: CLEAs (cross-linked enzyme aggregates) usando reactivos diepóxido para unir entre si las proteínas. El método de fabricación de epoxy-CLEAs se estudió y optimizo con la metodología de superficie de respuesta, obteniéndose epoxy-CLEAs estables y activas. Las expoxy-CLEAs se fotografiaron mediante microscopia tomográfica. El método de fabricación también se aplicó a la fabricación de CLEAs magnéticas. Los agregados conservan igualmente la actividad catalítica y tienen la ventaja de poder ser retirados del medio de reacción usando un imán de neodimio, facilitando la purificación del producto final y el reusó del biocatalizador. En el segundo bloque la lacasa de Trametes versicolor inmovilizó sobre soportes de sílice o dentro de los poros de los soportes, tanto comerciales como sintetizados en el laboratorio. Se preparó así un biocatalizador de lacasa que se aplicó a la síntesis de dos fenoxiazonas: Curie 22 y el ácido cinabarinico. En un tercer bloque se propone la modificación directa de nanopartículas magnéticas (9-12 nm). Estas partículas son funcionalizadas directamente por sustitución nucleofílica con haluros orgánicos. Usando las nanopartículas funcionalizadas se propone un método sostenible para obtener un acetato de bencilo seminatural en un sistema libre de disolvente, usando lipasas inmovilizadas sobre las partículas. El cuarto y último bloque es la aplicación de derivados fluorescentes sintetizados en el laboratorio para aplicarlos en biología molecular y celular. Se han sintetizado compuestos incorporando moléculas fluorescentes a reactivos que tienen algún tipo de afinidad con proteínas. Los compuestos se han usado para marcar proteínas en medio líquido, teñir geles de acrilamida, cuantificar proteínas y teñir células, obteniéndose resultados alentadores. ABSTRACT This doctoral thesis entitled “Chemical modification of proteins, applications in immobilization, catalytic performance and fluorescent labeling.” aims to develop methodologies of chemical modification of proteins and applications thereof. The thesis has been divided into four sections in each of which a methodology of protein modification is addressed and one or more applications of the methodology are proposed. In a first section, is proposed to improve the "carrier-free" immobilization technology: CLEAs (cross-linked enzyme aggregates) using diepoxide reagents to bind proteins together. The epoxy-CLEAs manufacturing method was studied and optimized with the response surface methodology, obtaining stable and active epoxy-CLEAs. The expoxy-CLEAs were photographed by tomographic microscopy. The manufacturing method was also applied to the fabrication of magnetic CLEAs. The aggregates also retain the catalytic activity and have the advantage of being remove from the reaction medium using a neodymium magnet, facilitating the purification of the final product and the reuse of the biocatalyst. In the second section the laccase from Trametes versicolor was immobilized on silica supports or inside the pores of the supports, both commercial and synthesized in the laboratory. A laccase biocatalyst was thus prepared which was applied to the synthesis of two phenoxiazones: Curie 22 and cinnabarinic acid. In a third section a direct modification of magnetic nanoparticles (9-12 nm) is proposed. These particles are functionalized directly by nucleophilic substitution with organic halides. Using the functionalized nanoparticles a sustainable method to obtain a semi-natural benzyl acetate in a solvent-free system is proposed, using lipases immobilized on the particles. The fourth and final section is the application of fluorescent derivatives synthesized in the laboratory for application in molecular and cellular biology. Compounds incorporating fluorescent molecules and compounds with some kind of affinity with proteins have been synthesized. The compounds have been used to label proteins in liquid media, to stain acrylamide gels, to quantify proteins and to stain cells, obtaining encouraging results.