Simulación numérica y estudios experimentales sobre ultracentrifugación analítica de macromoléculas

Abstract

Objetivos: El tema monográfico de esta Tesis es la ultracentrifugación analítica (AUC), técnica de la que se ha realizado un estudio experimental y teórico-computacional. Los objetivos experimentales han sido la puesta a punto de dicha técnica en nuestro Grupo de Investigación, la elección del procedimiento de análisis de datos experimentales más adecuado para cada sistema en concreto, y el estudio mediante AUC de una serie de proteínas suministradas por otros laboratorios. El objetivo computacional ha sido el desarrollo de contribuciones para el tratamiento de datos de AUC. Así, se ha desarrollado una herramienta para la predicción de perfiles de sedimentación en experimentos de AUC y otra herramienta para extraer información estructural de las especies a partir de los perfiles de señal experimentales. De este modo se pretende poner a disposición de la comunidad científica una alternativa sencilla a otros programas de análisis de experimentos de AUC cubriendo limitaciones de los mismos, en particular en el análisis de sistemas polidispersos.

Metodología: La metodología empleada en esta Tesis puede dividirse en metodología experimental y teórico-computacional. En relación a la metodología experimental, se ha utilizado una ultracentrífuga Beckman XL/I. Para comprobar la corrección de los procedimientos experimentales empleados se utilizaron muestras de macromoléculas ampliamente caracterizadas en la bibliografía. Después se estudiaron proteínas aisladas recientemente por otros grupos de investigación. Para el tratamiento de los datos experimentales se han utilizado los programas SEDFIT y SEDPHAT. Para algunos de los sistemas considerados, los experimentos de AUC se complementaron con técnicas de dispersión de luz dinámica y/o cromatografía de exclusión por tamaño. Con respecto a los desarrollos computacionales para la predicción y análisis de experimentos de AUC, se ha procurado emplear la experiencia y los recursos propios del Grupo de Investigación. Los programas desarrollados se implementaron en el lenguaje de programación Fortran 90 y algunas simulaciones se evaluaron con el programa SEDFIT.

Conclusiones: - Se ha puesto a punto la técnica de AUC, estableciendo los protocolos de análisis más adecuados para cada sistema. Con ello se podido establecer el grado de oligomerización de distintas proteínas suministradas por otros grupos de investigación. - Se ha desarrollado un método computacional para la predicción teórica de los perfiles de señal tratando la difusión como un proceso regido por las leyes del movimiento browniano. Este método se ha implementado en el programa SIMUSED cuyo adecuado funcionamiento se ha comprobado tanto en el caso de muestras homogéneas como heterogéneas, concluyendo que la capacidad predictiva del algoritmo browniano desarrollado es adecuada en una variedad de casos. - En base al algoritmo de dinámica browniana se ha desarrollado un método para el análisis de perfiles de señal, esto es, para la determinación de parámetros moleculares a partir de los datos de un experimento de AUC. Este método se ha implementado en el programa ANASED. Se ha verificado el buen comportamiento de ANASED en muestras homogéneas y heterogéneas, demostrándose que es posible extraer una amplia gama de información estructural de los perfiles de señal a partir de experimentos de AUC.

SUMMARY

Aims: The topic of this Thesis is the analytical ultracentrifugation (AUC) technique, for which a joint experimental and theoretical-computational study has been carried out. The experimental objectives have included setting up AUC in our Research Group, the establishment of the most adequate procedures for data analysis of each system and the study via AUC of a number of proteins supplied by other laboratories. The computational aim has been to contribute to the data treatment of AUC experiments. Thus, a new tool has been developed for the prediction of sedimentation profiles in AUC experiments as well as another tool for the extraction of structural information from experimental signal profiles. The goal is to provide the scientific community with a simple alternative to other programs for AUC experiment analysis and to cover some limitations of those programs, particularly those related to polydisperse systems.

Methodology: The methodology employed in this Thesis can be divided into two categories: experimental and theoretical-computational methodologies. Regarding the experimental methodology, an ultracentrifuge Beckman XL/I has been used. Macromolecules well-characterized in the literature were employed to validate our experimental procedures. Subsequently, proteins recently isolated by other research groups were studied. Programs SEDFIT and SEDPHAT were used for the treatment of experimental data. For some of the systems considered, AUC experiments were complemented with dynamic light scattering and/or size-exclusion chromatography. With regard to the computational developments for prediction and analysis of AUC experiments, the experience and resources of our Research Group have been used. The new programs were written in the programming language Fortran 90 and some simulations were assessed with the program SEDFIT.

Conclusions: - The AUC technique has been set up at the Group and adequate methodologies for the analysis of different systems have been established. These have enabled us to determine the oligomerisation degree of several proteins supplied by other research groups. - A computational method has been developed for the theoretical prediction of the signal profiles by treating diffusion as a process that follows the laws of brownian motion. This method has been implemented in the program SIMUSED, which has been successfully applied to both homogeneous and heterogeneous samples. Thus, it has been concluded that the predictive ability of the brownian algorithm is adequate in a number of cases. - Based on the dynamic brownian algorithm, a new method has been developed for the analysis of signal profiles, that is, for the determination of molecular parameters from AUC experimental data. This approach has been implemented in the program ANASED and it has been validated by studying homogeneous and heterogeneous samples, which demonstrates that it is possible to obtain structural information from the signal profiles obtained from AUC experiments.