Effects of environmental cycles (light and temperature) on daily rhythms and its application to fish aquaculture

Abstract

Objetivos, Metodología y Resultados: 1. Diseñar y testar una solución de registro automatizado, bajo coste y fácil manejo para estudiar las preferencias térmicas y la actividad locomotora en peces de interés comercial, tanto diurnos como nocturnos, e investigar si esta preferencia térmica diaria está impulsada o no por relojes circadianos endógenos (Capítulos Exp 1.1 y 1.2). Para ello, se mantuvo a los peces durante un periodo de 28 días en un tanque multicámara personalizado en el que se creó un gradiente térmico. Durante estos 28 días, se sometió a los peces a tres condiciones fóticas diferentes (LD, DL y DD) y se grabó en vídeo su comportamiento. El análisis de vídeo mostró que todas las especies investigadas (diurnas y nocturnas) exhibían un ritmo diario de preferencia térmica que persiste incluso en condiciones DD constante y que, por tanto, está regulado endógenamente por el reloj circadiano. 2. Evaluar la posible preferencia térmica diaria en especies de peces cueva ciegos señalando las variaciones de temperatura como un Zeitgeber factible para estos animales que han evolucionado en ambientes de condiciones constantes y si estos ritmos son endógenos o no (Capítulo Exp 1.2). La metodología aplicada ya se describió en la sección 1. Las dos especies cavernícolas analizadas mostraron un ritmo diario de preferencia térmica, pero éste no persistió en condiciones DD. 3. Delinear si los peces pueden exhibir ritmos diarios de selección de luz y determinar si estos ritmos son endógenos, se probaron diferentes longitudes de onda (blanca y roja) en el modelo experimental de pez cebra (Capítulo Exp 2.1). Para ello, los peces fueron libres de elegir un compartimento (iluminado u oscuro) durante un periodo de 7 días, tras la aclimatación, probando tanto la luz blanca como la roja. Bajo la condición de luz blanca, los peces exhibieron un ritmo endógeno circadiano significativo, eligiendo el compartimento iluminado durante las horas subjetivas del día y el compartimento oscuro durante las horas subjetivas de la noche. 4. Determinar y caracterizar la sincronización fótica a largo plazo de la actividad locomotora y la ritmicidad circadiana endógena en el tetra ciego Mexicano e investigar una posible expresión relativa diaria de genes seleccionados de opsinas no visuales en el cerebro de esta especie (Capítulo Exp 2.2). Se registró la actividad locomotora de los peces a largo plazo y se les mantuvo en diferentes condiciones fóticas (LD, cambio de 6 horas de LD, DD y LLdim). Se tomaron muestras del cerebro de los peces durante 24 horas (cada 4 horas) y posteriormente se procesaron (extracción de ARN y retrotranscripción de ADNc) para estudiar la expresión génica de las opsinas no visuales mediante qPCR en tiempo real. Astyanax mexicanus mostró una significativa sincronización fótica diaria de la actividad locomotora. La persistencia de este ritmo en DD y LLdim confirma su naturaleza endógena y que está controlado por el reloj circadiano. 3 de 6 genes de opsinas no visuales mostraron un ritmo diario de expresión. 5. Describir los posibles efectos en la fisiología de los peces de las dietas con ingredientes emergentes, centrándose en los mecanismos centrales que regulan la ingesta de alimentos en la tilapia del Nilo y la dorada (Capítulo Exp 3). Se alimentó a los peces con tres dietas diferentes (una de control y dos experimentales que contenían ingredientes alternativos al aceite y la harina de pescado) durante 60 días. Al final del ensayo, se tomaron muestras de los cerebros y se procesaron posteriormente para estudiar la expresión de los genes cerebrales de control de la ingesta de alimentos. La tilapia del Nilo aceptó negativamente una dieta experimental (con altos niveles de inclusión de espirulina y quinoa) mientras que la dorada aceptó positivamente las tres dietas probadas. 6. Determinar una posible aplicación de los tratamientos con extractos de microalgas en la cría de peces en cautividad, investigando in vitro la proliferación celular y la actividad migratoria del pez cebra, implicadas en el proceso de cicatrización, y ensayar si estos tratamientos pueden ser dependientes del tiempo (día o noche) en el proceso de cicatrización (Capítulo Exp 4). Para ello, se realizó la técnica de cicatrización de heridas en una línea celular de fibroblastos de aleta caudal de pez cebra y se ensayó un extracto de microalgas (diferentes diluciones y durante diferentes tiempos). La herida tratada durante 30 minutos con una dosis de 1:32 se cerró significativamente antes.

Objectives, Methodology and Results: 1. To design and prove an automated-recording, low-cost and user- friendly-interface solution for studying thermal preferences and locomotor activity in fish of commercial interest both diurnal and nocturnal and to investigate if this daily thermal preference is driven by endogenous circadian clocks or not (Exp Chapters 1.1 and 1.2). To do so, fish were kept for a period of 28 days in a custom multi-chamber tank in which a thermal gradient was created. During these 28 days, the fish were subjected to three different photic conditions (LD, DL and DD) and their behaviour video recorded. Video analysis showed that all species tested (diurnal and nocturnal) exhibited a daily rhythm of thermal preference that persists even under constant DD condition and is therefore endogenously regulated by the circadian clock. 2. To evaluate the possible daily thermal preference in blind cavefish species pointing out temperature variations as a feasible Zeitgeber for these animals that have evolved in constant conditions environments and if these rhythms are endogenous or not (Exp Chapter 1.2). The methodology applied was already described in section 1. Both cave species tested showed a daily rhythm of thermal preference, but this did not persist in DD condition. 3. To delineate whether fish can exhibit daily rhythms of light selection and determine whether these rhythms are endogenous, testing different wavelengths (white and red) on the experimental zebrafish model (Exp Chapter 2.1). To do this, fish were free to choose a compartment (lit or dark) for a period of 7 days, after acclimation, testing both white and red light. Under white light condition, the fish exhibited a significant circadian endogenous rhythm, choosing the illuminated compartment during subjective day hours and the dark compartment during subjective night hours. 4. To ascertain and characterise the long-term photic entrainment of locomotor activity and circadian endogenous rhythmicity in the blind Mexican tetra and to investigate a possible daily relative expression of selected non- visual opsin genes in the brain of this species (Exp Chapter 2.2). The locomotor activity of the fish was long-term recorded and fish were kept in different photic conditions (LD, 6-hour shift of LD, DD and LLdim). Fish brains were sampled for 24 hours (every 4 hours) and subsequently processed (RNA extraction and cDNA retrotranscription) to study gene expression of non-visual opsins by Real-Time qPCR. Astyanax mexicanus showed a significant daily photic entrainment of locomotor activity. The persistence of this rhythm in DD and LLdim confirms its endogenous nature and that it is controlled by the circadian clock. 3 out of 6 non-visual opsin genes showed a daily rhythm of expression. 5. To describe the possible effects on fish physiology of emergent ingredient diets focusing on the central mechanisms that regulate food intake in Nile tilapia and Gilthead seabream (Exp Chapter 3). Fish were fed three different diets (one control and two experimental containing alternative ingredients to fish oil and meal) for 60 days. At the end of the trial, the brains were sampled and subsequently processed to study brain food intake control genes expression. Nile tilapia negatively accepted an experimental diet (with high inclusion levels of spirulina and quinoa) while sea bream positively accepted all three diets tested. 6. To determine a potential application of microalgal extract treatments in captive fish breeding, by investigating in vitro zebrafish cell proliferation and migration activity, involved in the healing process and to essay if these treatments can be time-dependent (day or night) in the healing process (Exp Chapter 4). To do so, the wound healing technique was performed on a zebrafish caudal fin fibroblast cell line and a microalgae extract was tested (different dilutions and for different times). The wound treated for 30 minutes with a 1:32 dose closed significantly before.