Reprogramación metabólica e inmunogénica para mejorar la respuesta antitumoral en melanoma y cáncer de páncreas

Abstract

El cáncer, un desafío importante en la salud pública, destaca en el melanoma y cáncer de páncreas por su alta capacidad metastásica y resistencia a tratamientos, resultando en elevada incidencia y mortalidad. El metabolismo y el sistema inmune son fundamentales en la respuesta antitumoral. El metabolismo tumoral impulsa el crecimiento canceroso y controla procesos como la autofagia y la resistencia a drogas mediante la metilación de proteínas. Terapias hipometilantes desarrolladas por nuestro grupo han mostrado actividad antitumoral, sugiriendo que regular la metilación proteica puede ser eficaz contra el cáncer. A pesar de la importancia del sistema inmune en la detección y destrucción de células cancerosas, los tumores pueden evadir la respuesta inmunológica, presentando un desafío significativo en el tratamiento del cáncer. De acuerdo con esto, el objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue estudiar los mecanismos moleculares implicados en el metabolismo, control de la metilación de proteínas y respuesta inmune antitumoral para diseñar nuevas estrategias terapéuticas efectivas frente a melanoma y cáncer de páncreas. Durante este trabajo se utilizaron diferentes modelos experimentales, incluyendo líneas celulares de melanoma y cáncer de páncreas, así como modelos animales de ratón. Se emplearon una amplia variedad de técnicas bioquímicas, como Western Blot, ensayos ELISA o inmunoprecipitación de proteínas; técnicas de biología celular, como ensayos de viabilidad, inmunohistoquímica, microscopía, citometría de flujo, aislamiento de células NK o cuantificación de parámetros metabólicos; y técnicas de biología molecular, como qPCR, clonación de ADN, inmunoprecipitación de cromatina, silenciamiento génico mediante CRISPR/Cas9 o sobreexpresión de determinados genes. Además, los datos obtenidos fueron analizados con las pruebas estadísticas adecuadas. Los principales resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral han quedado reflejados en la literatura científica: Por un lado, observamos que acriflavina, un potente inhibidor de la dimerización de HIF-1α, altera el metabolismo de las células de melanoma en normoxia. Este tratamiento reduce la disponibilidad de glucosa y suprime el efecto Warburg, mientras bloquea la fosforilación de AKT y RSK2, interrumpiendo vías protectoras frente al estrés oxidativo. Acriflavina favorece la degradación de ATF4 y reduce la expresión del factor de transcripción MITF, clave en el desarrollo de melanocitos y oncogén en el melanoma. Estos resultados indican que la inhibición de HIF-1α por acriflavina podría ser una estrategia innovadora para tratar el melanoma, independientemente de la hipoxia tumoral. Por otro lado, se estudió el papel de MITF en la respuesta inmune anti-melanoma. Demostramos que MITF regula ADAM10, una proteasa fundamental para el reconocimiento de las células de melanoma por las células NK. Además de suprimir la muerte celular por células NK al controlar ADAM10, también comprobamos que MITF activa la respuesta de linfocitos T. Estos resultados destacan cómo la actividad de MITF puede modificar la respuesta inmune al melanoma, con implicaciones importantes para las terapias inmunológicas en este tipo de cáncer. Finalmente, evaluamos cómo la metilación de proteínas regula la autofagia en células de cáncer de páncreas con mutaciones en KRAS. Usando un tratamiento hipometilante (HMT), reducimos la autofagia y activamos el estrés del retículo endoplásmico al alterar la señalización de KRAS. La combinación HMT también impidió la activación de CRAF al modificar el complejo SHOC2-MRAS-PP1. La inactivación de PP2A bloqueó la autofagia, previniendo la activación de ULK1 y restaurando la retención citoplasmática de los factores de transcripción MiT/TFE. Estos resultados revelan que el tratamiento con HMT podría ser una estrategia eficaz en el tratamiento del cáncer de páncreas. En general, estos estudios indican el papel fundamental de los procesos de metilación de proteínas, metabolismo celular y respuesta inmune antitumoral en la patología del cáncer y en el desarrollo de nuevas aproximaciones para el tratamiento de tumores de páncreas y melanoma.

Cancer, a major public health challenge, is characterised by high metastatic and treatment resistance in melanoma and pancreatic cancer, resulting in high incidence and mortality. Metabolism and the immune system are central to the anti-tumour response. Tumour metabolism drives cancer growth and controls processes such as autophagy and drug resistance through protein methylation. Hypomethylating therapies developed by our group have shown anti-tumour activity, suggesting that regulating protein methylation may be effective against cancer. Despite the importance of the immune system in detecting and destroying cancer cells, tumours can evade the immune response, presenting a significant challenge in cancer treatment. Accordingly, the main objective of this PhD Thesis was to study the molecular mechanisms involved in the metabolism, control of protein methylation and anti-tumour immune response in order to design new effective therapeutic strategies against melanoma and pancreatic cancer. Throughout this doctoral thesis, a variety of experimental models were utilised, including melanoma and pancreatic cancer cell lines, as well as mouse animal models. A variety of biochemical techniques were used, such as Western Blot, ELISA assays or protein immunoprecipitation; cell biology techniques, such as viability assays, immunohistochemistry, microscopy, flow cytometry, NK cell isolation or quantification of metabolic parameters; and molecular biology techniques, such as qPCR, DNA cloning, chromatin immunoprecipitation, gene silencing by CRISPR/Cas9 or overexpression of specific genes. In addition, the data obtained were analysed using appropriate statistical tests. The key findings of this Doctoral Thesis are documented in the scientific literatura: First, we observed that acriflavine, a potent inhibitor of HIF-1α dimerisation, alters the metabolism of melanoma cells in normoxia. This treatment reduces glucose availability and suppresses the Warburg effect, while blocking AKT and RSK2 phosphorylation, disrupting protective pathways against oxidative stress. Acriflavin promotes ATF4 degradation and reduces the expression of the transcription factor MITF, a key factor in melanocyte development and oncogene in melanoma. These results indicate that inhibition of HIF-1α by acriflavine could be a novel strategy to treat melanoma, regardless of the presence of hypoxia in the tumour. Second, we studied the role of MITF in the anti-melanoma immune response. We showed that MITF regulates ADAM10, a protease essential for the recognition of melanoma cells by NK cells. In addition to suppressing cell death by NK cells by controlling ADAM10, we also found that MITF can stimulate the T-cell-mediated response. These findings emphasize the capacity of MITF to alter the immune response to melanoma, with important implications for immunotherapy in this cancer. Finally, we evaluated how protein methylation regulates autophagy in pancreatic cancer cells with KRAS mutations. Using a hypomethylating treatment (HMT), we reduced autophagy and activated endoplasmic reticulum stress by altering KRAS signalling. The HMT combination also prevented CRAF activation by modifying the SHOC2-MRAS-PP1 complex. Inactivation of PP2A blocked autophagy, preventing ULK1 activation and restoring cytoplasmic retention of MiT/TFE transcription factors. These results reveal that HMT treatment could be an effective strategy in the treatment of pancreatic cancer. Overall, this Doctoral Thesis highlights the central role of protein methylation processes, cell metabolism, and the immune response in cancer pathology. It also explores the potential for novel therapeutic approaches in the treatment of pancreatic cancer and melanoma.