Análisis del microbioma-metiloma y estudio de asociación entre Fusobacterium nucleatum y marcadores moleculares en el cáncer colorrectal

Abstract

Objetivo: Estudio del microbioma y metiloma a partir de muestras de tejido intestinal de pacientes con CCR para establecer asociaciones entre el perfil de metilación genética a nivel de islas CpG y la abundancia relativa respecto al género Fusobacterium. A su vez, se lleva a cabo el estudio de asociación entre la cuantificación relativa de Fusobacterium nucletarum y las características clínicas y moleculares en el CCR, así como la utilidad potencial de la medición del nivel de F. nucletaum en el diagnóstico/cribado del CCR. Material y métodos: Se incluyen un total de 154 muestras emparejadas correspondientes a 77 pacientes con CCR, tanto de tejido tumoral (T) como de tejido no tumoral periférico (NT), clasificadas según tipo de CCR (CC, SAC y hmMSI), localización (proximal, distal) y estadio según criterios TNM. El estudio del microbioma bacteriano en muestras T y NT se realiza mediante tecnología NGS (IlluminaMiSeq System®). El estudio del perfil de metilación del ADN a nivel de islas CpG en muestras T se realiza mediante el array Infinium® HumanMethylation450 BeadChip y los resultados se validan por pirosecuenciación. El estado MSI se determina mediante el kit MSI Analysis System (Promega) y el estado CIMP con la técnica SALSA® MS-MLPA® Probemix ME042-C1 CIMP (MRC-Holanda). También se determinan mediante pirosecuenciación las mutaciones de los genes: KRAS, BRAF y PIK3CA. Finalmente se realiza la cuantificación bacteriana global y de F. nucletaum por qPCR. Las diferencias existentes entre muestras T y NT en cuanto a microbioma se han estudiado mediante el método PCA (Principal Component Analysis), la prueba U de Mann-Withey-Wilcoxon y el análisis LDA (“linear discrimination analysis”). El análisis de correlación de Pearson entre la abundancia relativa del género Fusobacterium y el nivel de metilación de los genes estudiados se ha realizado con la función R statscor utilizando RStudio IDE versión 1.0.143. Para el resto de análisis estadísticos, tanto del estudio de validación del porcentaje de metilación, del análisis de correlación entre la cuantificación relativa de F. nucletaum y los porcentajes de metilación, o de asociación con los distintos marcadores de interés, se ha utilizado el paquete estadístico SPSS versión 21.0. Resultados: El análisis de la diversidad de géneros bacterianos realizado entre muestras T y NT según la localización determina que existen diferencias significativas que especificamente son debidas a muestras T de localización distal, con una menor diversidad, mientras que no existen diferencias de diversidad microbiana según el tipo de CCR. El PCA de los datos de microbioma no muestra diferencias entre los casos. Entre los géneros bacterianos con diferencias significativas en su abundancia relativa entre muestras T y NT se encuentran Bacteroides, Eubacterium, Fusobacterium y Acinetobacter, que se presentan como los géneros con mayor poder discriminatorio en el modelo predictivo obtenido mediante el método LDA a favor de muestras T, mientras que únicamente el género Lachnoclostridium se presenta como género en el modelo predictivo a favor de muestras NT. El estudio de validación realizado a partir de los datos obtenidos por el análisis de correlación para el nivel de metilación genético y la abundancia relativa del género Fusobacterium ha confirmado una correlación positiva con la metilación de los genes PLCH1, mirLET7D, EGFR y COBL. En cambio el nivel de F. nucletaum ha mostrado correlación positiva únicamente con el gen ZNF788. No se encuentran diferencias en la cuantificación de F. nucletaum en cuanto a sexo y localización. Existen diferencias significativas entre CC y SAC/hmMSI que se dan a nivel proximal, y entre los tumores de mayor tamaño (T3, T4) o estadios avanzados (II, III, IV) frente a los de menor tamaño (Tis, T1, T2) o estadio (0, I). También existen diferencias significativas entre MSS y MSI-H, entre CIMP-H y CIMP-L, y para los estados mutados de los genes KRAS y BRAF, mientras que no se encuentran para PIK3CA. El análisis multivariante confirma que el estado MSI, estadio CCR y el tipo de CCR son las variables que presentan asociación significativa de forma independiente con la cuantificación relativa de F. nucletaum. La cuantificación relativa de F. nucletaum presenta una eficiencia diagnóstica para CCR del 69%. Se establece el punto de corte óptimo en una diferencia ≤ 10 ciclos en Ct de F. nucletaum y Ct de carga bacteriana total obtenidos por qPCR. El modelo predictivo establece que la cuantificación relativa de F. nucletaum es predictor independiente de CCR (OR=2,23; IC95% [1,51-3,30]) y del tipo de CCR SAC/hm-MSI frente a CC (OR=2,00; IC95% [1,22–3,28]). Conclusiones: Se han encontrado potenciales biomarcadores potenciales bacterianos para CCR (géneros Bacteroides, Eubacterium, Fusobacterium y Acinetobacter). Además los genes PLCH1, mirLET7D, EGFR y COBL han mostrado un estado hipermetilado asociado a la abundancia del género Fusobacterium spp. en muestras T, mientras que sólo el porcentaje de metilación del gen ZNF788 ha mostrado correlación positiva con la cuantificación relativa de F. nucletaum. El nivel de F. nucletaum se asocia de forma significativa al tipo de CCR SAC/hmMSI, estadios avanzados, estado MSI-H, estado CIMP-H y BRAF mutado, aunque el análisis multivariante confirma la asociación de forma independiente con el CCR tipo SAC/hmMSI, estadios avanzados y estado MSI-H. Debido a la buena especificidad obtenida para la cuantificación relativa de F. nucletaum se propone dicho parámetro como candidato a la mejora del cribado/diagnóstico del CCR mediante técnicas no invasivas, incluso llegando a poder diferenciar entre CC y SAC/hmMSI.

Objective: Study of the microbiome and methylome from intestinal tissue samples from CRC patients to establish associations between the CpG islands genetic methylation profile and the genus Fusobacterium relative abundance. Subsequently, an association study between Fusobacterium nucletarum relative quantification and the clinical and molecular characteristics in CRC, as well as the potential usefulness of F. nucletaum relative quantification in the diagnosis/screening of CRC, were carried out.

Material and methods: 154 paired samples, 77 tumor tissue (T) and 77 peripheral non-tumor tissue (NT), corresponding to 77 patients with CRC, classified according CRC type (CC, SAC and hmMSI), location. (proximal, distal) and stage according TNM criteria. The microbiome study is carried out using NGS technology (IlluminaMiSeq System®). The CpG islands DNA methylation profile is carried out using the Infinium® HumanMethylation450 BeadChip array and the results are validated by pyrosequencing. MSI status is determined using the MSI Analysis System kit (Promega) and CIMP status with the SALSA® MS-MLPA® Probemix ME042-C1 CIMP technique (MRC-Netherlands). Gene mutations: KRAS, BRAF and PIK3CA are also determined by pyrosequencing. Finally, qPCR were carried out to total bacterial and F. nucletaum quantification. PCA (Principal Component Analysis) method, U Mann-Withey-Wilcoxon test and LDA analysis (“linear discrimination analysis”) were carried out to analize microbiome differences between T and NT samples Pearson correlation analysis between Fusobacterium genus relative abundance and genes methylation level was carried out with the R statscor function using RStudio IDE version 1.0.143. Genes methylation validation study, correlation analysis between F. nucletaum relative quantification and CpG island methylation percentages and for the different markers of interest was carried out using the SPSS version program. 21.0.

Results: The diversity analysis of microbial populations between T and NT samples according the location determines specifically significant differences due to T samples of distal location, with less diversity, while there are no microbial diversity differences according to CRC type. The microbiome data PCA shows no differences between cases. Bacteroides, Eubacterium, Fusobacterium and Acinetobacter are the genera with the highest discriminatory power in the predictive model obtained by LDA method favorable to T samples. Only Lachnoclostridium appears as a genus in the predictive model in favor of NT samples. The validation study for the genes methylation level and Fusobacterium relative abundance has confirmed a positive correlation with PLCH1, mirLET7D, EGFR and COBL genes. The F. nucletaum relative cuantification has shown positive correlation only with ZNF788 gene. Were no differences for the quantification of F. nucletaum by sex or location. There are high F. nucletaum relative quantification levels with significant differences for proximal SAC/hmMSI CRC, larger tumors (T3, T4) and advanced stages (II, III, IV). There are also F. nucletaum relative quantification significant differences between MSS and MSI-H, CIMP-H and CIMP-L, KRAS and BRAF mutated states, while they are not found for PIK3CA. The multivariate analysis confirms that MSI status, CRC stage and CRC type are the variables with an significant association with F. nucletaum relative quantification. The F. nucletaum relative quantification has showed a diagnostic efficiency for CRC of 69%. The optimal cut-off point is established at a difference ≤ 10 cycles between F. nucletaum and total bacterial loads obtained by qPCR. The predictive model establishes that F. nucletaum relative quantification is an independent predictor for CRC (OR=2.23; 95% CI [1.51-3.30]) and for SAC/hm-MSI CRC versus CC (OR=2.00, 95%CI [1.22–3.28]).

Conclusions: Bacteroides, Eubacterium, Fusobacterium and Acinetobacter are potential bacterial CRC biomarkers. PLCH1, mirLET7D, EGFR and COBL genes have shown a hypermethylated state associated with the abundance of Fusobacterium spp. in T samples, while only ZNF788 CpG methylation percentage has shown positive correlation with F. nucletaum relative quantification. Higher F. nucletaum level is significantly associated with SAC/hmMSI CRC type, advanced stage, MSI-H status, CIMP-H status and BRAF mutation, although multivariate analysis confirms the independent association with SAC/hmMSI CRC, advanced stages and MSI-H status. Due to F. nucletaum relative quantification good specificity, this parameter is proposed as an improving CRC screening/diagnosis candidate as non-invasive techniques, even being able to differentiate between CC and SAC/hmMSI.