Study of Inflammasome Activation in Autoinflammatory Diseases and Tendinopathies

Abstract

Esta Tesis consta de los siguientes objetivos: 1. Determinar el efecto de mutaciones en NLRC4 asociadas a enfermedades autoinflamatorias en la estructura de NLRC4. 2. Evaluar la activación de los inflamasomas NLRC4 y NLRP3 por microscopía de fluorescencia. 3. Caracterizar el efecto de la corriente galvánica en la activación del inflamasoma NLRP3 en macrófagos. 4. Estudiar la implicación del inflamasoma NLRP3 en la respuesta inflamatoria y regenerativa tras la aplicación de electrolisis percutánea en tendón de Aquiles de ratón. 5. Elucidar el rol del inflamasoma NLRP3 en un modelo murino de daño tisular estéril. Para conseguirlos, se realizaron estudios in vitro utilizando cultivos celulares de macrófagos silvestres y deficientes en diferentes componentes del inflamasoma. Tras activarlos con LPS y corriente galvánica se determinó la liberación de diferentes citoquinas pro-inflamatorias como IL-1β o IL-18, así como la liberación de LDH y la captación de YoPro-1. Además, se utilizó microscopía de fluorescencia, así como la técnica BRET para estudiar la oligomerización y conformación, respectivamente, del inflamasoma. Por otro lado, se realizaron estudios ex vivo, utilizando sangre de pacientes con enfermedades autoinflamatorias para aislar células mononucleares de sangre periférica, activar específicamente NLRP3 con LPS+ATP y NLRC4 con LPS+FlaTox, y medir la liberación de IL-1β, IL-18, IL-6 y TNF-α por ELISA, y la formación de oligómeros de ASC por citometría. También se realizaron estudios in vivo utilizando ratones silvestres, Nlrp3-/- y Pycard-/- para medir la expresión de diferentes citoquinas pro-inflamatorias, y el tipo, orientación y fuerza de las fibras de colágeno mediante tinción con rojo picrosirio, microscopia de segundo armónico y pruebas biomecánicas, tras aplicar electrolisis percutánea o punción seca. Además, se midió la expresión y la producción de IL-1β, IL-18, TNF-α e IL-6 por qPCR y ELISA, respectivamente; y se cuantificaron células polimorfonucleares por tinción con hematoxilina-eosina, tras inducir un daño en el tendón aplicando la enzima colagenasa. Finalmente, se aplicó electrolisis percutánea o punción seca en los tendones tratados con colagenasa. Esta Tesis ha generado las siguientes conclusiones: 1. Las mutaciones que afectan al dominio WHD inducen cambios en la conformación de NLRC4. 2. Los diferentes mutantes de NLRC4 descritos en pacientes con enfermedades autoinflamatorias inducen una distribución punteada de NLRC4. 3. La mutación p.Ser171Phe de NLRC4 presenta ganancia de función en el ensamblaje del inflamasoma. 4. La mutación p.Ser171Phe de NLRC4 es una posible causa del síndrome autoinflamatorio que sufre la paciente a estudio. 5. La aplicación de corriente galvánica en células HEK293T que expresan NLRP3 induce una distribución punteada de NLRP3. 6. La aplicación de corriente galvánica en macrófagos tratados con LPS activa el inflamasoma NLRP3. 7. La aplicación de corriente galvánica en macrófagos tratados con LPS induce la liberación de las citoquinas IL-1β e IL-18. 8. La aplicación de corriente galvánica en macrófagos tratados con LPS no induce muerte celular por piroptosis. 9. Aumentar el tiempo y el número de pulsos en la corriente galvánica aplicada a macrófagos tratados con LPS está relacionado con un aumento en la liberación de IL-1β y una muerte celular dependiente de la corriente. 10. La electrolisis percutánea aplicada al tendón de Aquiles de ratón induce un incremento en el colágeno tipo I y la rigidez del tendón, mejorando su resistencia. 11. La resistencia del tendón tras aplicar electrolisis percutánea es dependiente del inflamasoma NLRP3. 12. La administración de colagenasa en el tendón de Aquiles de ratón induce daño tisular estéril y una respuesta inflamatoria parcialmente dependiente de NLRP3. 13. El daño inducido por colagenasa en tendón de Aquiles de ratón no está afectado por la electrolisis percutánea aplicada 3 veces cada 3 días con 3 impactos de 3 mA durante 3 segundos.

For the present Thesis the following specific objectives were proposed: 1. Determine the effect of autoinflammatory-associated NLRC4 mutations on the structure of NLRC4. 2. Evaluate the activation of the NLRC4 and NLRP3 inflammasome by fluorescence microscopy. 3. Characterize the effect of galvanic current application in the activation of the NLRP3 inflammasome in macrophages. 4. Study the implication of the NLRP3 inflammasome in the inflammation and regeneration responses in the Achilles tendon of mice after percutaneous electrolysis application. 5. Elucidate the role of NLRP3 inflammasome in a mouse model of sterile tissue damage. During this project, in vitro studies were performed using cell cultures of wild-type macrophages and macrophages deficient in different components of the inflammasome. After activation of these macrophages with LPS and galvanic current, the release of different pro-inflammatory cytokines such as IL-1β or IL-18 was determined, as well as the release of LDH and the uptake of YoPro-1. In addition, fluorescence microscopy was also used, as well as the BRET technique to study the oligomerization and conformation, respectively, of the inflammasome. On the other hand, ex vivo studies were carried out using blood from patients with autoinflammatory diseases to isolate peripheral blood mononuclear cells, specifically activate NLRP3 with LPS+ATP and NLRC4 with LPS+FlaTox, and measure the release of IL-1β, IL-18, IL-6 and TNF-α by ELISA, and the formation of ASC oligomers by cytometry. In vivo studies were also performed using wild-type, Nlrp3-/- and Pycard-/- mice to measure the expression of different pro-inflammatory cytokines, and the type, orientation and strength of collagen fibers by picrosirius red staining, second harmonic microscopy and biomechanical tests, after applying percutaneous electrolysis or dry needling. In addition, measurement of the expression and production of IL-1β, IL-18, TNF-α and IL-6 by qPCR and ELISA, respectively; as well as quantification of polymorphonuclear cells by hematoxylin-eosin staining, after inducing tendon damage following application of collagenase enzyme, was performed. Finally, percutaneous electrolysis or dry needling were performed in collagenase-treated tendons. After this Thesis, we obtained the following conclusions: 1. Mutations affecting the WHD domain of NLRC4 induce significant changes in the conformation of NLRC4. 2. Different NLRC4 mutants described in patients with autoinflammatory syndromes induce a puncta distribution of NLRC4 in the cells. 3. The p.Ser171Phe NLRC4 variant present a gain-of-function behavior in assembly an inflammasome. 4. The postzygotic p.Ser171Phe NLRC4 variant is a plausible cause of the autoinflammatory disease in the enrolled patient. 5. Galvanic current applicated in HEK293T cells expressing NLRP3 results in a puncta distribution of NLRP3 in the cells. 6. Galvanic current applicated in LPS-primed macrophages is able to activate the NLRP3 inflammasome. 7. Galvanic current applicated in LPS-primed macrophages induce the release of IL-1β and IL-18 cytokines. 8. Galvanic current applicated in LPS-primed macrophages do not induce pyroptotic cell death. 9. Increasing the time and the number of pulses in galvanic current applicated to in LPS-primed macrophages is related with an increase in IL-1β release and also in current-dependent cell death. 10. Percutaneous needle electrolysis applicated in the Achilles tendon of mice induces an increase in type I collagen and tendon stiffness, improving tendon resistance. 11. Tendon resistance after percutaneous needle electrolysis is dependent on the NLRP3 inflammasome. 12. Collagenase administration in the Achilles tendon of mice induces a sterile tissue damage and an inflammatory response partially dependent on NLRP3. 13. Collagenase damage of the Achilles tendon of mice is not affected by the application of percutaneous needle electrolysis by delivering 3 times every 3 days with 3 impacts of 3 mA for 3 seconds.