Síntesis y caracterización de nanopartículas de fibroína de seda para el transporte de fármacos

Abstract

La academia y la industria han conseguido avances extraordinarios en una gran variedad de áreas debido al desarrollo de la nanotecnología y el control de estructuras a niveles nanoscópicos. Particularmente, en el campo de la medicina, la nanotecnología tiene el potencial de generar un impacto significativo en la salud humana pudiendo mejorar el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de enfermedades. En este campo, la nanotecnología busca encapsular fármacos y/o compuestos trazadores en nanopartículas con el fin de aumentar la eficacia de los mismos al permitir un suministro directo en tejidos diana; al mismo tiempo que reducen su toxicidad evitando la acumulación y los consiguientes efectos secundarios en tejidos sanos. La encapsulación de fármacos también permite su liberación controlada pudiendo así evitar máximos de concentraciones elevadamente dañinas o subterapéuticas. Sumado a esto, las nanopartículas han demostrado ser de gran valor en el transporte de fármacos con baja solubilidad en agua; el cual resulta ser el principal problema a la hora de introducir nuevos medicamentos al mercado debido a que este hecho limita su biodisponibilidad en el organismo. La fibroína de seda del gusano de seda de la especie Bombyx mori es un polímero natural, proteico, que presenta una interesante combinación de propiedades mecánicas, tales como flexibilidad y resistencia que aún son difíciles de conseguir con polímeros sintéticos. Además, la fibroína es biodegradable y biocompatible, lo que la convierte en un excelente material para la producción de nanopartículas para la administración de fármacos. Las nanopartículas de fibroína de seda son capaces de cargar una amplia variedad de compuestos terapéuticos y diversas macromoléculas, penetrar membranas biológicas y ser modificadas químicamente para ampliar su funcionalidad. Si bien la notable resistencia mecánica de la fibroína es una de las propiedades atractivas del biomaterial, el proceso de síntesis de nanopartículas se encuentra obstaculizado por su elevada estabilidad. Un método reciente, desarrollado por el Grupo de Investigación en el que se ha realizado la presente tesis doctoral, basado en la utilización de líquidos iónicos para disolver la fibroína nativa, ha permitido la producción de nanopartículas en un proceso fácil y escalable a la industria. El proceso de síntesis de nanopartículas de fibroína de seda consta de varias etapas. En primer lugar, se lleva a cabo la purificación de la fibroína, mediante la eliminación de la sericina (método conocido como desgomado). En segundo lugar, la fibroína debe ser disuelta en sus unidades monoméricas y, por último, ésta es regenerada en forma de nanopartículas. Cada uno de estos procesos puede tener efectos significativos en la estructura secundaría de la proteína y dadas las implicaciones que ésta tiene en la resistencia, degradabilidad y biocompatibilidad del producto final, su estudio resulta indispensable. Por otro lado, para la correcta administración de dosis terapéuticas, los fármacos cargados en las nanopartículas deben ser cuantificados con precisión. Hasta la fecha, dos enfoques son utilizados principalmente para esta tarea. Los cuales están basados en una medición directa o indirecta del contenido de carga de fármaco en la nanopartícula. Sin embargo, ambos adolecen de las ineficiencias de la extracción del fármaco y del proceso de separación sólido-líquido, así como de errores de dilución. Dadas las consideraciones anteriores, esta Tesis doctoral se centra en el estudio de las nanopartículas de fibroína de seda como nanotransportadores de fármacos, su proceso de síntesis utilizando líquidos iónicos, la caracterización de la estructura secundaría de la proteína durante todo el proceso de síntesis y la cuantificación de la cantidad de fármaco cargado en las nanopartículas.

The academy and industry have made extraordinary advances in a wide variety of areas due to the development of nanotechnology and the control of structures at the nanoscopic levels. Particularly in the field of medicine, nanotechnology has the potential to generate a significant impact on human health, being able to improve the diagnosis, prevention and treatment of diseases. In this field, nanotechnology seeks to encapsulate drugs and / or tracer compounds in nanoparticles to increase their efficiency by allowing direct delivery to target tissues; while they reduce their toxicity avoiding accumulation and the consequent side effects in healthy tissues. The encapsulation of drugs also allows their controlled release, thus avoiding maximum levels of highly harmful or subtherapeutic concentrations. Moreover, nanoparticles are of great value in the transport of drugs with low solubility in water; which turns out to be the major problem when introducing new drugs to the market because it limits their bioavailability in the body. The silk fibroin of the Bombyx mori species silkworm is a natural, protein polymer that presents an interesting combination of mechanical properties, such as flexibility and resistance which are still difficult to achieve with synthetic polymers. Furthermore, fibroin is biodegradable and biocompatible, which makes it an excellent material for the production of nanoparticles for drug delivery. Silk fibroin nanoparticles are capable of loading a wide variety of therapeutic compounds and various macromolecules, penetrate biological membranes, and be chemically modified to extend their functionality. Although the remarkable mechanical resistance of fibroin is one of the attractive properties of the biomaterial, the nanoparticle synthesis process is hampered by its high stability, due to the high number of hydrogen bonds in its secondary structure, mostly in the form of antiparallel β sheet. A recent method, developed by the Research Group in which this doctoral thesis has been carried out, based on the use of ionic liquids to dissolve native fibroin, has allowed the production of nanoparticles in an easy and scalable process for industry. The silk fibroin nanoparticle synthesis process comprises several stages. First, the fibroin is purified by removing the sericin (a method known as degumming). Second, fibroin must be dissolved in its monomeric units and, subsequently, regenerated into nanoparticles. Each of these steps can have significant effects on the secondary structure of the protein and given the implications it has on the resistance, degradability and biocompatibility of the final product, their study is essential. On the other hand, for the correct administration of therapeutic doses, the drugs loaded in the nanoparticles must be precisely quantified. To date, two approaches are mainly used for this task. They are based on a direct and indirect measurement of the drug loading content in the nanoparticle. However, both suffer from inefficiencies in drug extraction and solid-liquid separation process, as well as dilution errors. Given the above considerations, this Doctoral Thesis focuses on the study of silk fibroin nanoparticles as drug nanocarriers, their synthesis process using ionic liquids, the characterization of the secondary structure of the protein during the entire synthesis process and the quantification of the amount of drug in the nanoparticles.