Caracterización biológica y ecología de balos en una planta de depuración simbiótica de aguas residuales

Abstract

Introducción: Bdellovibrio fue descubierto por H. Stolp y H. Petzold en los años 60. Son bacterias gramnegativas, con forma de vibrio, quimioorganótrofas, aerobias y depredadoras de otras bacterias gramnegativas. Poseen un ciclo de vida constituido por dos fases: fase de ataque, donde se fija a la presa, y fase de crecimiento y división, donde crece a expensas de ésta. Ante el problema del incremento de multirresistencias a antimicrobianos, que ha llegado a constituir un desafío en terapia antimicrobiana, las bacterias del grupo BALOs (del inglés: Bdellovibrio And Like Organisms) han suscitado interés como recurso alternativo al uso de antibióticos, tanto en el campo de la patología infecciosa como en la agricultura y acuicultura, ya que destruyen una gran variedad de bacterias patógenas. Objetivos: esta investigación tiene como objetivos constatar la diversidad genética entre este grupo bacteriano, establecer una metodología óptima para una recuperación efectiva de BALOs ultracongelados y otra que permita maximizar su detección directamente en el medio, y analizar la capacidad depredadora de BALOs y su especificidad frente a la presa bajo distintas condiciones ambientales. Metodología: los BALOs fueron aislados de la Estación Depuradora de Aguas Residuales (E.D.A.R.) del Campus de Espinardo (Murcia), mediante la llamada “técnica de la doble capa de agar”, empleando como presas, bacterias de interés sanitario, así como distintas condiciones nutritivas y de temperatura para el estudio de su perfil ecológico. Se realizaron experimentos de congelación con concentraciones variables de glicerol para la optimización de la preservación de BALOs a largo plazo y posterior reactivación. El estudio genético y taxonómico de dos cepas de BALOs (MuRa1a y MuRa6a) se realizó por secuenciación y analisis con técnicas bioinformáticas, y búsqueda bibliográfica, respectivamente. Resultados: La revisión bibliográfica nos mostró los numerosos cambios taxonómicos sufridos por BALOs hasta llegar a su clase atual: Oligoflexia. Los resultados obtenidos tras la secuenciación de las cepas de Bdellovibrio revelan distancia filogenética entre las mismas, y corrobora la variedad genética de este grupo bacteriano. La detección de BALOs directamente del medio acuático fue mayor utilizando cepas de Escherichia coli como bacteria presa tras filtración e incubación conjunta a 30ºC. Esta detección se vio incrementada utilizando un sistema favorecedor del autoenriquecimiento de la muestra, sin aporte externo de nutrientes. El experimento de congelación dio como resultado una reactivación de BALOs sólo posible a concentaciones de glicerol menores al 0,5%, mientras que, en el ámbito ecológico, los BALOs mostraron gran especificidad de depredación dependiendo de su bacteria presa de origen y se observó mayor presencia de BALOs en biotopos de la E.D.A.R donde abundaban las presas independientemente a las condiciones fisico-químicas. Por último, en BALOs aislados de la E.D.A.R. y tras días en incubación con su presa, se observó una trasformación de la forma infectiva hacia formas cocoides compactas y sin capacidad motora. Conclusiones: el grupo BALO es un grupo bacteriano que presenta una gran diversidad genética y de habitat. La disminución de la riqueza del medio de cultivo y el autoenriquecimiento de la muestra, produce una mayor detección de BALOs directamente del medio, observando además que la capacidad depredadora del BALO es mayor si encuentra en el medio la bacteria presa de origen. Además, la concentración baja de glicerol en la congelación favorece la posterior reactivación de las bacterias a estudio. Por ultimo, las nuevas formas cocoides observadas en las cepas de BALOs aisladas parecen aparecer a consecuencia de una depauperación del medio.

Introduction: Bdellovibrio was discovered by H. Stolp and H. Petzold in the 1960s. They are Gram-negative, vibrio shape, chemoorganotrophic, aerobic, and predatory of other Gram-negative bacteria. Their live cycle is composed of two phases: an attack phase for the prey fixing, and another of growth and division, in which Bdellovibrio grows at the expense of this. Faced with the problem of the increase in multi-resistance to antimicrobials, that constitutes a challenge for antimicrobial therapy, bacteria of the BALOs group (Bdellovibrio And Like Organisms) have raised interest as an alternative resource to the use of antibiotics both in the infectious pathology and agriculture and aquaculture field, due to the capacity that these bacteria present to destroy a wide variety of pathogen bacteria.

Objectives: This research aims to verify the genetic diversity among this bacterial group, to establish a methodology that allows an effective recovery of deep-frozen BALOs and another methodology that increase in their detection directly from the medium, and to analyze the BALOs predatory capacity and BALOs specificity against their prey under different Ambiental conditions.

Methodology: BALOs were isolated from the Industrial water treatment (E.D.A.R. from the Spanish acronym) located at the University of Murcia, using a procedure called “Double-layer agar technique”. For that issue medically bacteria were used as prey, performing the experiment in a variety of temperature and nutritional conditions for the study of different ecologic aspects. Besides, freezing experiments were performed with a variety of glycerol concentrations to find the optimized methodology for the long-term preservation of BALOs and their subsequent reactivation. For the genetic and taxonomic contextualization, two strains of BALOs (MuRa1a y MuRa6a) were sequenced and both bioinformatics techniques and bibliographic searches were used, respectively.

Results: Our bibliography review showed us the numerous taxonomic changes suffered by BALOs, until were placed in their current class: Oligoflexia. The results obtained after sequencing the two Bdellovibrio strains reveal a phylogenetic distance between them and corroborate the genetic variation of this bacterial group. The detection of BALOs directly from the aquatic environment was higher when using Escherichia coli strains as prey bacteria after filtration and incubation of the two bacteria types at 30ºC. This detection was increased by using a system that stimulates the self-enrichment of the sample, without the external contribution of nutrients. The freezing experiment resulted in reactivation of BALOs only possible at glycerol concentrations lower than 0.5%, while, in the ecological field, the BALOs showed great predation specificity depending on their original prey bacteria and a greater presence of BALOs was observed in biotopes of the E.D.A.R. where prey abounded regardless of the physico-chemical conditions. Finally, it was possible to observe a transformation of the infective form towards non-mobile compact coccoid forms when BALOs isolated from E.D.A.R. were incubated with their prey during days.

Conclusions: BALOs group is a bacterial group with a high genetic and habitat diversity. The decrease in the richness of the culture medium and the self-enrichment of the sample, produces a greater detection of BALOs directly from the medium, also observing that the predatory capacity of the BALO is greater if the prey bacteria of origin are found in the medium. Besides, the use of a low concentration of glycerol during the freezing procedure stimulates the subsequent reactivation of the bacteria under study. Finally, the new coccoid forms observed in the isolated BALO strains seem to appear as a consequence of the impoverishment of the environment.