Efecto paradójico de algunas sustancias radioprotectoras en la radiosensibilización de células de melanoma metastásico B16F10

Abstract

Introducción: un radioprotector químico ideal debería tener una alta efectividad contra el daño biológico inducido por las radiaciones ionizantes con ausencia de toxicidad propia. En Radiobiología es un objetivo permanente la búsqueda de mecanismos protectores específicos para cada situación de exposición humana que permita obtener los beneficios deseados en las exposiciones a radiación ionizante. Objetivos: comparar el efecto genoprotector y radioprotector de algunas sustancias antioxidantes extraídas del romero (Rosmarinus officinalis) (ácido carnósico (CARN) y ácido rosmarínico (AR)) con el de otros compuestos antioxidantes y determinar un posible efecto paradójico de estas sustancias que producen una intensa acción radiosensibilizante cuando se administran a células de melanoma metastásico. Material y método: se estudia el efecto genoprotector de diferentes sustancias mediante dos ensayos de micronúcleos para cuantificar la actividad antimutagénica mediante la reducción de la frecuencia de micronúcleos “in vitro” en linfocitos humanos irradiados y bloqueados con citochalasina B e “in vivo” sobre eritrocitos policromátófilos de médula ósea de ratón. Para determinar su efecto radioprotector sobre la supervivencia celular se ha utilizado el ensayo de viabilidad celular (MTT) en células PNT2 (epiteliales de próstata humana), células TRAMPC1 (epiteliales tumorales de próstata murino) y en células B16F10 (melanoma metastásico murino) irradiada con diferentes dosis de rayos X (de 0G a 10Gy). El análisis estadístico en los ensayos de genoprotección ha consistido en comparaciones entre grupos realizando contrastes de igualdad de medias mediante análisis de varianza. Asimismo, se ha realizado un análisis de regresión y correlación lineales y polinómicos. Además, se ha determinado el Factor de Protección de cada sustancia. En los ensayos de radioprotección o viabilidad/supervivencia celular se ha realizado un análisis de la varianza de medidas repetidas para comparar los porcentajes de supervivencia celular en los cultivos con diferentes concentraciones de los compuestos complementando con contraste de igualdad de pares con el método de la mínima diferencia significativa. Los análisis fueron realizados transformando logarítmicamente los datos para ajustarse a las condiciones del ANOVA.

Resultados: se determina una capacidad genoprotectora de las diferentes sustancias ensayadas, destacando el AR y el CARN, que consiguen una reducción de la frecuencia de aparición de micronúcleos (p<0,001) como expresión de su capacidad antimutagénica, presentando un FP del 62%. De igual forma, se determina una capacidad radioprotectora en la supervivencia celular que alcanza con la dosis de 10 Gy un FP del 100%, eliminando el 40% de la muerte celular radioinducida en células PNT2 (p<0,001) y el 77% de la muerte celular radioinducida en las TRAMPC1 (p<0,001) en las que se cuantifica un FP del 334%. Sin embargo, en la línea celular de melanoma metastásico (B16F10) mientras que el resto de sustancias mantienen su intensa actividad radioprotectora, el CARN y el AR provocan un incremento de la muerte celular del 20-40% (p<0,01), careciendo de FP y mostrándose como sustancias intensamente radiosensibilizantes para dichas células. Conclusiones: no existe una única estructura química ni un mecanismo único relacionado con la capacidad radioprotectora. La actividad antioxidante, su disponibilidad biológica, su hidro- o liposolubilidad y su presencia en el medio biológico son características relacionadas con esta capacidad protectora. Sin embargo, algunas sustancias, como el CARN y el AR, con intensa capacidad radioprotectora, pueden producir un incremento paradójico del daño radioinducido en el melanoma expresando mecanismos específicos que permitirían potenciar agentes que protegiendo a las células sanas puedan lesionan exclusivamente las células neoplásicas, presentando una nueva estrategia para los pacientes con cáncer sometidos a radioterapia, incluso para el tratamiento de cánceres considerados radiorresistentes.

Introduction: An ideal chemical radioprotector should be highly effective against the biological damage caused by ionizing radiation while being void of toxicity. In Radiobiology, it is a permanent objective to search for specific protective mechanisms for each situation of human exposure that allows obtaining the desired benefits in exposures to ionizing radiation.

Aims: to compare the genoprotective and radioprotective effects of certain antioxidative substances extracted from rosemary (Rosmarinus officinalis) (carnosic acid (CARN) and rosmarinic acid (AR)) with those of other antioxidative compounds and determine the possibly paradoxical effect of these substances that display an intense radiosensitizing action when applied to metastatic melanoma cells

Material and method: the genoprotective effect of various substances was studied in two micronucleus assays in order to quantify the antimutagenic activity via micronucleus frequency reduction in vitro in irradiated Cytochalasin B-blocked human lymphocytes and in vivo in mouse bone marrow polychromatophilic erythrocytes. To determine the radioprotective effect on cellular survival, a cellular viability assay (MTT) was performed on PNT2 cell cultures (normal human prostate epithelial cells), TRAMP-C1 cells (transgenic murine prostate epithelial adenocarcinoma cells) and in B16F10 cells (metastatic murine melanoma), which were applied prior to exposure to a range of different X-ray doses (0Gy-10Gy). The statistical analysis of the genoprotective assays consisted of group comparisons whereby means contrasts were performed via analysis of variance. Likewise, a lineal and polynomic regression and correlation analysis was performed. Furthermore, the Magnitude of Protection or the protective capacity of the different substances has been determined A repeated measures ANOVA was performed for the radioprotection or cellular survival/viability assays in order to compare the percentages of cell survival for cultures containing different concentrations of the compounds, complemented by a paired-means contrast via Fisher’s least-significant-difference method. These analyses were performed on data transformed logarithmically in order to adjust them to ANOVA requirements.

Results: the results show that the substances tested have a genoprotective capacity with an emphasis on rosmarinic acid and carnosic acid which achieved a statistically significant reduction in micronuclei frequency (p<0.001), thus displaying their antimutagenic capabilities. The aforementioned substances presented a Protection Factor which reached a maximum of 62% in the case of pre-exposure application. Likewise, these substances, both alone and in the varying mixtures and concentrations at which they were utilized, a radioprotective capability was determined in terms of cell survival, which reached a Protection Factor of 100% at doses of 10 Gy, eliminating 40% of the radio-induced cell death in the PNT2 cells (p<0.001); as well as 77% of the radio-induced cell death in the TRAMPC1 cells (p<0.001) for which a Protection Factor of 334% was found. Conversely in the B16F10 cell line, while the remaining substances tested maintained an intense radioprotective activity, both CARN and AR completely lacked any radioprotective effect, causing aa significant decrease in cell survival was produced of 20-40% (p<0.01) and lacking of any Protective Magnitude, so they act as ow radiosensitizing substances for said cells Conclusions: one sole, unique, chemical structure or action mechanism related with radioprotective capacity does not exist among the substances tested. Antioxidant activity, biological availability, hydro- or liposolubility and its presence in the biological environment before exposure to ionizing radiation are characteristics related with the aforementioned protective activity. Nonetheless, certain substances, such as CARN and AR, which do display an intense radioprotective capacity, on occasion can produce increased radio-induced damage, and therefore, a paradoxically greater damage effect as occurs in melanoma cells, expressing specific mechanisms that would allow enhancing agents that protecting healthy cells can exclusively damage neoplastic cells, presenting a new strategy for cancer patients undergoing radiotherapy, even for the treatment of cancers considered radioresistant.