Browsing by Subject "Virología veterinaria"

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    Application of antimicrobial peptides for the control of betanodavirus in European sea bass
    (Universidad de Murcia, 2024-11-22) Cervera Martínez, Laura; Cuesta Peñafiel, Alberto; Chaves Pozo, Elena; Esteban Abad, María Ángeles; Escuela Internacional de Doctorado
    Esta Tesis Doctoral se centra en la caracterización de péptidos antimicrobianos (AMPs) de peces teleósteos y su implicación en la respuesta inmunitaria. Concretamente, nos planteamos evaluar la capacidad inmunomoduladora de los AMPs NK-lisina (Nkl), hepcidina (Hamp) y dicentracina (Dic) de lubina y su aplicación como agentes antivirales frente a nodavirus (NNV) en lubina. La primera fase de la experimentación fue comprobar la capacidad inmunomoduladora in vitro de dichos AMPs sintéticos, derivados de lubina, en leucocitos de riñón cefálico de dorada y lubina. Se estudió la capacidad fagocítica por citometría de flujo y el estallido respiratorio por quimioluminiscencia, sin detectar regulación por dichos AMPs. En cambio, se observó, mediante qPCR, el aumento significativo de la expresión de genes relacionados con la respuesta inmune antiviral en lubina y su descenso generalizado en dorada. Estos datos apuntaron a la idoneidad de los AMPs sintéticos derivados de lubina para su uso en lubina, pero no en dorada, indicando una especificidad de especie. Tras esto, se estudió la posible función y aplicación de estos AMPs en lubina mediante estudios in vivo. Al administrarlos en forma de plásmidos de expresión, estos se transcribieron en el músculo y aumentaron los niveles de dichasproteínas y la capacidad microbicida. Además, indujeron la expresión de marcadores proinflamatorios, aunque no consiguieron mejorar la supervivencia frente a infecciones con NNV. El siguiente paso fue testar los AMPs sintéticos Hamp y Dic in vivo en lubina ya que Nkl había sido previamente evaluada con resultados excelentes. Se comenzó analizando su potencial como inmunomoduladores, demostrándose una reducción en la expresión de marcadores proinflamatorios y un aumento de marcadores leucocitarios como neutrófilos, macrófagos y linfocitos B. Estas alteraciones se relacionan con una ventaja para el hospedador al luchar contra infecciones virales, por lo que se valoró su potencial como agente preventivo frente a NNV. Los resultados fueron muy satisfactorios mejorando en ambos casos la supervivencia frente al virus en un 30%. Este aumento de la supervivencia podría ser debido a la inducción de un estado antiinflamatorio en el tejido diana del virus, el cerebro, y la sobreexpresión del complejo Cxcr3/Cxcl9, que facilita la infiltración de células clave para la resolución viral como linfocitos T, neutrófilos o macrófagos. Curiosamente, la administración terapéutica de estos AMPs sintéticos tras la infección con NNV mostraron también una mejoría en la supervivencia de las lubinas tratadas con Hamp y Dic, y una inmunomodulación similar al tratamiento previo. Sin embargo, los niveles de virus no se vieron afectados, por lo que el efecto lítico directo de los AMPs sobre las partículas virales parece no ser relevante. Por el contrario, la administración de Nkl sintética solo logró retrasar la aparición de las mortalidades, pero no evitarlas, y únicamente estimuló la respuesta citotóxica, siendo esta claramente insuficiente para evitar la mortalidad por NNV. En conclusión, los péptidos sintéticos Hamp y Dic pueden ser considerados como excelentes herramientas para el control de NNV en granjas de lubina gracias a sus funciones inmunomoduladoras, tanto administrado de forma profiláctica como terapéutica.
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    Cell-mediated citotoxicity of fish leucocytes against betanodavirus
    (Universidad de Murcia, 2024-10-21) García Álvarez, Miguel Ángel; Cuesta Peñafiel, Alberto; Esteban Abad, María Ángeles; Elena Chaves Pozo, Elena; Escuela Internacional de Doctorado
    Los peces criados en piscifactorías están sometidos a gran estrés, afectando a su sistema inmune y haciéndolos vulnerables a enfermedades. Entre los patógenos más letales se encuentran los virus, destacando el virus de la Necrosis Nerviosa Viral (NNV), causante de la enfermedad de la encefalopatía y retinopatía viral (VER). En el Mar Mediterráneo tiene prevalencia principalmente el genotipo RGNNV, siendo capaz de infectar a la lubina y a la dorada, siendo esta última resistente a VER. Sin embargo, la aparición de genotipos recombinantes (RGNNV/SJNNV y SJNNV/RGNNV) demostró que la dorada era capaz de desarrollar la enfermedad. Entre los mecanismos que presentan los peces teleósteos contra infecciones virales, destaca la citotoxicidad mediada por células (CMC), llevadas a cabos por diferentes tipos celulares, destacando las células citotóxicas no específicas (NCCs) y células semejantes a natural killer (NK-like) en el sistema innato mientras que en sistema adaptativo es llevado a cabo por linfocitos T citotóxicos (CTLs). La dorada es capaz de montar una respuesta innata efectiva contra NNV, destacado por su CMC innata, capaz de eliminar las células infectadas, mientras que en lubinas no. Por ello, el objetivo de esta Tesis Doctoral es profundizar en la dinámica de la respuesta citotóxica mediada por leucocitos de lubina y dorada frente a NNV. Para ello, en el Capítulo I se estudió se estudió la interacción de los genotipos recombinantes de NNV en larvas de dorada de diferentes edades, evaluando la mortalidad y genes implicados en las infecciones. Los resultados mostraron que ambos genotipos podían infectar larvas de diferentes edades, con mayor patogenicidad en larvas más jóvenes. El genotipo RGNNV/SJNNV produjo mayor mortalidad debido a la alta prevalencia viral y menor activación del sistema inmune. En el Capítulo II Se caracterizó el receptor CRTAM (presente en linfocitos T de mamíferos) y su ligando CADM1 en ambas especies mediante análisis bioinformático y se evaluaron sus expresiones génicas en diferentes condiciones, incluyendo una infección por NNV. El análisis identificó un gen de crtam y dos genes de cadm1 (cadm1a y cadm1b) en ambas especies. El gen crtam se expresó principalmente en tejidos inmunes, mientras que cadm1a y cadm1b se expresaron mayormente en cerebro y piel. En lubina, crtam parece expresarse en linfocitos T y participar en la infección por NNV, mientras que en dorada se expresa en NCCs o NK-like. El Capítulo III se centra en la identificación de la perforina en lubina mediante análisis bioinformático y en el estudio de su expresión génica en diferentes condiciones, así como en una infección por NNV, además de evaluar la presencia de células productoras de perforina mediante inmunohistoquímica en una infección por NNV. Se encontraron cuatro genes diferentes de perforina, prf1.2, prf1.3, prf1.5 y prf1.9, presentando todos ellos una expresión basal en diferentes tejidos y sintetizados principalmente por linfocitos T, excepto prf1.3. Además, todos los genes, excepto prf1.3, participaron en la infección contra NNV, apoyado por la generación de células productoras de PRF1.9 en cerebro, riñón cefálico y gónada. Por último, en el Capítulo IV se evaluó la CMC adaptativa usando como células efectoras leucocitos de lubinas infectadas por NNV y como línea diana células DLB-1 (provenientes de cerebro de lubina). La citotoxicidad innata no aumentó durante la infección, pero la citotoxicidad de leucocitos de peces infectados sí aumentó en fases tardías de la infección, indicando la activación del sistema inmune adaptativo. Este aumento fue específico contra los genotipos que compartían la misma cápside viral, apoyado por una posible restricción por MHC-I. En esta citotoxicidad adaptativa, se observó un aumento en las rutas de perforina/granzima y Fas/FasL, características de los CTLs, así como un aumento de la apoptosis.