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    Análisis del sistema hemostático en neoplasias avanzadas
    (2017-01-11) Morena Barrio, Pilar de la; Corral de la Calle, Javier; Escuela Internacional de Doctorado
    Introducción La relación entre sistema hemostático y cáncer es bidireccional. Los pacientes con cáncer tienen 4-7 veces más riesgo de desarrollar trombosis, especialmente en estadios avanzados de la enfermedad porque los tratamientos, las comorbilidades y las propias células tumorales, especialmente ciertos tipos, provocan diferentes alteraciones en el sistema hemostático que generan un estado de hipercoagulabilidad. Por otra parte, diferentes elementos del sistema hemostático juegan un papel importante en el crecimiento tumoral, progresión y metastatización. Hipótesis y objetivos La hipótesis que generó este trabajo fue que las distintas neoplasias, por el tipo de tumor o por los tratamientos recibidos, podrían provocar una alteración diferencial del sistema hemostático que podría tener relación con el desarrollo de trombosis y con la progresión tumoral. Por ello, el objetivo de nuestro estudio fue evaluar diferentes elementos del sistema hemostático en pacientes con 3 de las 4 neoplasias más frecuentes (cáncer de próstata, colorrectal y de pulmón). Los objetivos específicos fueron: 1. Estudiar si existe una activación diferente del sistema hemostático en distintas neoplasias avanzadas. 2. Analizar la relación entre alteraciones del sistema hemostático y el desarrollo de eventos trombóticos en pacientes con cáncer. 3. Estudiar el efecto de la quimioterapia basada en fluoropirimidinas sobre el sistema hemostático en pacientes con cáncer colorrectal. 4. Estudiar el valor pronóstico de las principales alteraciones del sistema hemostático en pacientes con cáncer. Material y métodos Se incluyeron muestras basales de 157 pacientes consecutivos; 32 con cáncer de próstata resistente a castración; 43 con cáncer colorrectal y 82 con carcinoma de pulmón. Se estudiaron: plaquetas y leucocitos; marcadores de muerte celular (lactato deshidrogenasa –LDH-); hipercoagulabilidad (Dímero D) y de daño endotelial (Factor von Willebrand –FvW-) y tiempos de coagulación (Tiempo de protrombina). Se analizaron la antitrombina y los dos elementos de la ruta de contacto (FXI y FXII) mediante métodos funcionales cromogénicos y/o western blot. Finalmente se estudiaron dos elementos recientemente implicados en trombosis: trastornos de glicosilación y ADN circulante (estudiados mediante electroforesis y HPLC; y por un método de cuantificación fluorescente, respectivamente). En casos excepcionales se realizaron estudios genéticos: secuenciación de genes (SERPINC1 y PMM2) o detección de grandes deleciones mediante MLPA. Resultados y Conclusiones 1. El sistema hemostático se encuentra afectado en pacientes con cáncer. Aunque hay elementos alterados comunes en las distintas neoplasias estudiadas, como son la elevación basal de LDH, DD y FvW, hay otros que varían entre ellas. En cáncer de próstata observamos una tendencia a una mayor activación de FXII que no se acompaña de activación de FXI. En cáncer colorrectal, se observó elevación de FvW y DD, sin activación de la ruta de contacto. En pacientes con CNMP, observamos una mayor incidencia de deficiencia de antitrombina que probablemente sea por consumo como lo sugiere la detección de complejos trombina-antitrombina. 2. La presencia de elevación del FvW en pacientes con cáncer de próstata se asocia con el desarrollo de eventos trombóticos en nuestra serie. No se ha encontrado relación entre el desarrollo de fenómenos trombóticos y otras alteraciones del sistema hemostático. 3. La quimioterapia basada en fluoropirimidinas no provoca alteraciones relevantes del sistema hemostático en pacientes con cáncer colorrectal. 4. Determinadas alteraciones del sistema hemostático, como el aumento de FvW, DD y ADN circulante, se asocian con peor pronóstico en las neoplasias estudiadas. La elevación de FvW se asocia a peor pronóstico en tres de los cuatro tumores estudiados: cáncer de próstata, cáncer colorrectal y CNMP. La elevación de DD se asocia con peor pronóstico en cáncer de próstata. Finalmente, la presencia de concentraciones elevadas de ADN circulante se asocia con peor supervivencia en pacientes con cáncer de próstata y CNMP avanzado. ABSTRACT Introduction There is a strong relationship between the hemostatic system and cancer. Patients with cancer have increased risk (4-7-fold) to develop thrombosis, particularly in advanced stages of the disease, because the treatments, the associated co-morbidities and the features of cancer cells can modify the hemostatic balance, triggering a prothrombotic state. But also the different hemostatic elements play a key role in tumor growth, tumor progression and metastasis. Hypothesis and objectives We propose that the disturbance of the hemostatic system may be different depending of the type of cancer. The type of tumor cell or the treatment used in each tumor may have distinct consequences on the hemostatic balance with potential and different consequences on the risk of thrombosis and the progression of the tumor. Accordingly, the main objective of our study was to evaluate different elements of the haemostatic system in patients with three out of four more prevalent cancer (prostate, colorectal, and lung cancer). The specific objectives were: 1. To study a potential activation of the hemostatic system in different advanced tumors. 2. To analyse the relationship between changes in the hemostatic system and the development of thrombotic events in patients with cancer. 3. To evaluate the effect of chemotherapy based on fluoropirimidines on the hemostatic system in patients with colorectal cancer. 4. To study the prognostic value of the main variations of the hemostatic system identified in patients with cancer. Material and methods Our study included basal samples of 157 consecutive patients with cancer: 32 with prostate cancer resistant to castration; 43 with colorectal cancer; and 82 with lung cancer. These were the parameters analyzed: platelets and leukocites; markers of cell death (Lactato de-hidrogenase –LDH-); hypercoagulability (D Dimer) and vascular damage (von Willebrand Factor –vWF-). Clotting times (prothrombin time and activated partial thromboplastin time) were also evaluated. Additionally, antithrombin and two elements of the contact pathway of coagulation (FXI and FXII) were also evaluated by functional chromogenic methods and/or Western blot. Finally, two elements recently associated with thrombosis: disorders of glycosylation and circulating DNA, were also analyzed in this study by electrophoresis and HPLC and by a fluorogenic method, respectively. Exceptional cases required genetic analysis that included senquencing of genes (SERPINC1 or PMM2) or detection of gross gene defects by MLPA. Results and conclusions 1. The haemostatic system is altered in cancer patients. Several common alterations are observed, including high levels of LDH, D-dimers and von Willebrand Factor (vWF). However, several distinct alterations are observed: in prostate cancer we observe activation of Factor XII; in colo-rectal cancer no activation of the contact route is observed and n non-small cell lung cáncer we observed lower levels of antitrombin factor probably caused by consumption, as these patients also had remarkable levels of thrombin-antithrombin complexes. 2. The presence of higher levels of vWF is associated with the development of thromboembolic events in prostate cancer. We did not observe other associations between thrombosis and alteration of the haemostatic system. 3. Fluoropirimidine-based chemotherapy did not cause relevant disturbances on the hemostatic system in patients with colorectal cancer. 4. Some variations of the hemostatic system such as the increase of vWF, D dimer or circulating DNA, associated with a poor prognosis in cancer. Thus, increased levels of vWF associated with a poor prognosis in three out of four tumors evaluated in this study: prostate, colorectal and non microcytic lung cancer. Rise level of D dimer was also a marker of bad prognosis in prostate cancer. Finally, high values of circulating DNA associated with low survival in patients with prostate and non microcytic lung cancer.
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    Calidad de vida, doppler lineal y presión trascutánea de oxígeno en pacientes tratados mediante revascularización percutánea en miembros inferiores
    (2014-11-24) Bernal Páez, Fernando Luis; Alcaraz Baños, Miguel; Facultad de Medicina
    Introducción: la valoración de la eficacia de la revascularización conseguida tras la Angioplastia Transluminal Percutánea (ATP) se realiza mediante el estudio con ultrasonidos (Doppler). Sin embargo, el éxito de la ATP evaluada a través del Doppler, no siempre conlleva el incremento de oxígeno en las porciones más distales de la extremidad tratada, ni la mejoría clínica de los pacientes tratados. Objetivos: se pretende evaluar la eficacia de la revascularización conseguida con la ATP en pacientes diabéticos con isquemia crónica de miembro inferior mediante el cuestionario de calidad de vida SF-36, y determinar su correlación con la determinación de la presión transcutánea de oxigeno (TcpO2), el índice tobillo-brazo (ITB) y el grado de estenosis arterial. Materiales y Métodos: se ha realizado un estudio prospectivo que incluye a 350 pacientes consecutivos remitidos a la unidad de Radiología Vascular Intervencionista del Hospital Universitario “Virgen de la Arrixaca” de Murcia (desde el 01/07/2008 al 01/01/2014) para estudio por isquemia crónica crítica de miembro inferior. Los pacientes se han evaluado mediante el cuestionario de calidad de vida SF-36, Doppler lineal de las arterias tibial posterior y dorsal pedia, el ITB, la TcpO2 y el grado de estenosis arterial mediante estudios radiológicos y, en su caso ATP posteriormente. Un total de 172 pacientes se consideraron candidatos para la realización de ATP, y suponen 179 extremidades inferiores tratadas que conforman este estudio, ya que en 7 pacientes el tratamiento bilateral. Resultados: el tratamiento mediante angioplastia transluminal muestra el incremento significativo de la calidad de vida de los pacientes tratados (p<0,001) determinado mediante el cuestionario de calidad de vida SF-36; además, mientras que la mejoría de la categoría Función Física se ha correlacionado con el incremento de la TcpO2 (p<0,001), la mejoría de la categoría Función Social se ha correlacionado con el incremento del ITB (p<0,001). El análisis estadístico muestra una escasa correlación entre las dos técnicas empleadas (TcpO2 e ITB), mostrando que ambas técnicas valoran parámetros diferentes que sólo se correlacionan en los casos en los que aumentan conjuntamente debido a la mejoría del paciente. Por ello, la posibilidad de determinación de la TcpO2 en todos los pacientes, la ausencia de falsos positivos, negativos como sucede en la determinación del ITB y su correlación estadística con la mejoría de la Función Física en la calidad de vida de los pacientes tratados refleja la importancia de la determinación de la TcpO2 como el mejor parámetro en la valoración de estos pacientes. Conclusión: este estudio confirma la mejoría clínica obtenida tras la ATP en la isquemia crónica de miembro inferior, señalando que el aumento de la TcpO2 tiene un significado fisiológico de revascularización microvascular en el miembro tratado que puede considerarse como un factor pronóstico en la evolución de los pacientes tratados. Abstract. Introduction: the efficacy of Percutaneous Transluminal Angioplasty (PTA) in achieving revascularization is assessed via ultrasound (Doppler). However, the success of PTA assessed via Doppler does not always display an increase in oxygen in the more distal portions of extremities treated, nor clinical improvements in patients undergoing treatment. Aims: to assess the efficacy of PTA in achieving revascularization in diabetic patients with chronic lower limb ischemia via the SF-36 Quality of Life questionnaire and determine its correlation with the measurement of Transcutaneous Oxygen Pressure (TcpO2), the Ankle-Brachial pressure Index (ABPI) and the degree of arterial stenosis. Material & Method: a prospective study was performed involving 350 patients consecutively admitted to the Vascular Radiology intervention Unit of the “Virgen de la Arrixaca” University Hospital in Murcia, southern Spain (from 01/07/2008 to 01/01/2014) due to chronic critical lower limb ischemia. These patients were assessed using the SF-36 Quality of Life questionnaire, lineal Doppler of the posterior tibial and dorsal pedis arteries, ABPI, TcpO2 and the degree of arterial stenosis via radiological methods and, when appropriate, followed up by PTA. A total of 172 patients were considered apt as candidates for PTA, from which 179 lower limbs were treated and thus included in the study, since 7 patients were admitted for bilateral treatment. Results: treatment via PTA provides a significant increase in quality of life in treated patients (p<0.001) as determined via the SF-36 Quality of Life questionnaire; furthermore, while the improvements registered under the category Physical Functionality proves to be correlated with TcpO2 (p<0.001), the improvements in Social Functionality are correlated with the increase in APBI (p<0.001). The statistical analysis shows a low level of correlation between two of the techniques utilized (TcpO2 and APBI), proving that both methods assess different parameters which are only correlated in those cases in which values increase jointly due to overall improvements in patients. As a result, the chances of determining TcpO2 in all patients, the absence of false positives/negatives, as commonly occurs with APBI, and the statistical correlation with improvements in Physical Functionality as part of the quality of life of treated patients reflects the importance of determining TcpO2 as the ultimate parameter in the assessment of such patients. Conclusion: the present study confirms the clinical improvements achieved following PTA treatment of chronic lower limb ischemia, highlighting the fact that increases in TcpO2 provide a physiological indication of microvascular revascularization in treated limbs and may prove to be a determining factor in the prognosis of treated patients.
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    Caracterización funcional y molecular de trombopatías congénitas= Functional and molecular characterization of inherited platelet disorders
    (2014-12-09) Sánchez Guiu, Mª Isabel; Lozano Almela, María Luisa; Rivera Pozo, José; Facultad de Medicina
    Introducción Los trastornos plaquetarios congénitos son un grupo heterogéneo de enfermedades raras que se caracterizan por alterar la producción/función plaquetaria, dando lugar a diátesis hemorrágica. A pesar de que estas enfermedades son muy conocidas, la identificación temprana y la caracterización de los pacientes sigue siendo difícil debido a la heterogeneidad clínica y de laboratorio; la falta de especificidad y la complejidad de los ensayos de la función plaquetaria; el gran número de genes causales; y la ausencia de correlación genotipo-fenotipo. Los proyectos multicéntricos sobre estos trastornos, guías consenso para el diagnóstico y redes de centros de referencia, podrían ayudar a abordar este problema. Objetivos 1. Facilitar el acceso al diagnóstico funcional y molecular de trastornos plaquetarios congénitos, para la comunidad médica de la Península Ibérica, promoviendo y apoyando la formación de un proyecto de colaboración para el reclutamiento y estudio de pacientes con un diagnóstico previo o con sospecha clínica de estos trastornos. 2. Realizar una evaluación cuantitativa de diátesis hemorrágica en los pacientes por medio de una escala común de sangrado. 3. Completar un análisis detallado y estandarizado de la función plaquetaria en los pacientes reclutados, con el objetivo de confirmar o descartar el diagnóstico funcional. 4. Lograr un diagnóstico molecular en los individuos con un diagnóstico funcional confirmado. 5. Establecer las posibles relaciones entre fenotipo clínico y/o de laboratorio y genotipo. Métodos En cinco años, 70 pacientes (no emparentados) con sospecha de trastorno plaquetario congénito, se remitidos desde hospitales de España y Portugal. Las características clínicas y manifestaciones hematológicas fueron evaluadas mediante una escala de sangrado. Se caracterizó el fenotipo plaquetario mediante un hemograma y un frotis; test PFA-100; ensayos de agregación plaquetaria; evaluación de los receptores de superficie plaquetarios y el estado de activación y secreción de gránulos por citometría de flujo; en algunos casos se realizó el ensayo de retracción del coágulo, la absorción/liberación de serotonina-14C, y microscopía electrónica. Se estudió en paralelo un control extraído a la vez que el paciente y un voluntario sano extraído en el momento del estudio. El análisis genético consistió, principalmente, en la secuenciación de regiones codificantes de los genes de interés. Resultados y Conclusiones 1. Hemos promovido un proyecto de colaboración para promocionar el diagnóstico funcional y molecular de pacientes con sospecha clínica de trastornos plaquetarios congénitos. Esto ha permitido el diagnóstico de un elevado número de pacientes. 2. Esta tesis comprende el estudio de 70 pacientes, siendo la cohorte de pacientes con sospecha clínica de trastornos plaquetarios congénitos más extensa de la Península Ibérica. 3. Nuestro estudio demuestra que mientras que una estrategia para el envío de muestras de sangre a una instalación distante puede no ser ideal y supone limitaciones técnicas, es válido para la identificación funcional de los pacientes con fenotipos severos. 4. En el 67% de los casos remitidos, se confirmó el diagnóstico, mientras que en el 33% restante no se ratificó la sospecha clínica. 5. El 40% de los pacientes obtuvo un diagnóstico a nivel molecular, el 28,8% con TG, y el 17,7% con SBS. La caracterización molecular de estos pacientes reveló 22 mutaciones, 11 fueron descritas aquí por primera vez. 6. Se identificaron dos nuevas variantes de SCH. Describimos por primera vez un caso de la forma severa de la enfermedad debido a una mutación missense en homocigosis. 7. Se describe el segundo caso de la caracterización molecular de un paciente con SHP en España, mediante secuenciación directa de gen HPS1. También se describió una mutación en el gen HPS7 en otro paciente, empleando el mapeo de marcadores microsatélites para detectar el gen candidato para secuenciación. 8. El análisis de otros casos con sospecha de trastornos plaquetarios congénitos, confirmó el diagnóstico molecular de CAMT, THC2 y MYH9-RD en 5 pacientes 9. El estudio del paciente con trombocitopenia crónica y tendencia hemorrágica leve, puso de manifiesto la primera evidencia de un autoanticuerpo IgM que causa la activación y agregación de plaquetas autólogas y alogénicas dependiente de temperatura, vía GPVI. En resumen, esta Tesis destaca la necesidad de mejorar el diagnóstico de los trastornos plaquetarios congénitos a nivel funcional y molecular. Se debe considerar el establecimiento de criterios estandarizados para evitar la heterogeneidad entre las distintas instalaciones, y la creación de centros de referencia para colaborar y favorecer el diagnóstico correcto de estas enfermedades. Introduction Inherited platelet disorders (IPDs) comprise a heterogeneous group of rare diseases characterized by abnormalities of platelet production or function giving rise to lifelong bleeding diathesis. Despite a century of research on IPDs, early identification and characterization of affected patients remain a challenge due to: heterogeneity of clinical and laboratory presentation; lack of specificity and complexity of platelet function assays; large number of causative genes; and absence of genotype-phenotype correlations. Multicenter projects on IPDs, consensus guides for diagnosis, and reference centers networks, could help to overcome this challenge. Objectives 1. To facilitate access to the specialized functional and molecular diagnosis of IPDs, for the medical community of the Iberian Peninsula, by promoting and initiating a collaborative project for the recruitment and study of patients with a previous diagnosis or clinical suspicion of either inherited thrombocytopenias or congenital disorders of platelet function. 2. To perform a quantitative re-evaluation of bleeding diathesis in the recruited patients by means of a common bleeding scale. 3. To complete a detailed and standardized analysis of platelet function in the samples from recruited patients, aiming to confirm or discard a functional diagnosis. 4. To achieve a molecular diagnosis in the individuals with a confirmed laboratory diagnosis. 5. To establish potential relationships between clinical and/or laboratory phenotype and genotype, in different types of IPDs. Methods In five years, seventy unrelated patients with suspected IPD were referred from hospitals of Spain and Portugal. Clinical features were assessed by their hematological and bleeding manifestations graded by a unique simple scale. We received blood samples and performed a platelet phenotype characterization including: full blood count and film examination; PFA-100 tests; light transmission aggregation (LTA); flow cytometry assessment of surface receptors, activation status and granule secretion; and in some cases clot retraction assay, 14C-serotonin uptake/release, and electron microscopy. A patient´s parallel control and a healthy volunteer freshly extracted were studied in parallel. Genetic analysis was mainly performed by sequencing of coding regions of the genes of interest. Results and Conclusions 1. The collaborative project promoted through this Thesis has permitted the accurate diagnosis of a high number of patients that will benefit from more specific medical management. 2. This Thesis comprises the largest cohort of patients with IPDs ever investigated in the Iberian Peninsula. 3. Our study demonstrates that despite a strategy for sending blood samples to a distant facility may not be ideal and not free of technical limitations, it is valid for functional identification of patients with severe phenotypes. 4. The clinical diagnosis of an IPD was confirmed in 67% of the 70 cases referred, while in the remaining 33% was not. Thus, our study demonstrates that correct diagnosis of IPDs may not be straightforward even for severe disorders and supports the benefit of specialized platelet laboratories for the diagnostic confirmation in these patients. 5. A high percentage of patients (40%) achieved a diagnosis at a molecular level, 28.8% with GT, and 17.7% with BSS. The molecular characterization of patients with GT revealed sixteen mutations along both genes encoding for the IIb3 receptor, 8 not reported previously. In the case of BSS, six mutations were identified, 3of them firstly described in this study. 6. We identified two new variants of CHS in this study. Noteworthy, we describe for the first time a case of a severe infant-onset CHS due to a homozygous missense mutation. 7. We characterized at the molecular level the second case of HPS-1 in Spain. A novel mutation in the HPS7 gene was identified in another HPS patient following autozygosity mapping using microsatellite markers to identify the candidate gene for Sanger sequencing. 8. Other cases with IPDs attained a molecular diagnosis of CAMT, THC2, and MYH9-RD. 9. The study of a patient with lifelong chronic thrombocytopenia and mild bleeding tendency, provided the first evidence of an IgM autoantibody causing temperature-dependent activation and aggregation of autologous and allogeneic platelets, through interaction with the platelet collagen receptor GPVI. In summary, this Thesis highlights the need to improve the diagnosis of IPDs at the level of the functional and by molecular analysis. Standardized criteria for diagnosis of IPDs would overcome the present heterogeneity between facilities, and the creation of reference centers should be considered to help healthcare providers in the diagnosis of these disorders.
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    Concentraciones de plomo en sangre como niveles umbrales en la toma de decisiones para minimizar los efectos de la exposición a plomo en rapaces
    (2017-09-13) García-Fernández, Antonio Juan; Ciencias Sociosanitarias
    Propuesta de niveles umbrales de concentración de plomo en sangre de rapaces para la toma de decisiones a la hora de establecer programas de seguimiento o implementar actuaciones de diagnóstico, prevención, tratamiento y control de exposiciones a plomo, con el fin de minimizar sus efectos.
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    Determinación espectrofotométrica de colinesterasa en sangre entera de animales domésticos: factores pre y analíticos
    (Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones., 2003) Tecles Vicente, Fernando; Cerón Madrigal, José Joaquín; Facultad de Veterinaria
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    “Entraremos en tu tumba con este aspecto”. La visión roja del ángel: Rūzbihān Baqlī, Rilke, Paradžanov.
    (Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 2020) Gonzalo Carbó, Antoni
    El presente artículo es un análisis comparado de la experiencia visionaria del rojo de la sangre y las rosas vinculada a la presencia del ángel en la mística (Rūzbihān Baqlī), la poesía (Rilke) y el cine (Paradžanov) como expresión de la aniquilación de sí. Tanto el diarium spirituale de Rūzbihān, relato biográfico y hagiográfico extraordinario, como la filmografía de Paradžanov, llena de referencias simbólicas, entre otras, a la tradición persa y al Islam, y surcada, como el diario espiritual del místico persa, de experiencias visionarias extraordinarias, se muestran como elevadas obras de auto-revelación. Asimismo, en la escritura de Rilke, que al igual que Dante, era un vidente y aspiraba a ser un iniciado, el ángel constituye, como es sabido, una figura simbólica capital. En sus estancias en Madrid y Toledo pudo admirar la obra de El Greco fijando su mirada en la epifanía de la sangre y las rosas. Concluimos que Rūzbihān, El Greco, Rilke y Paradžanov comparten una visión similar del color rojo de la sangre y de las rosas como experiencia mística sacrificial en la que los ángeles son testigos activos. Como en las visiones de Juliana de Norwich, la sangre extendida constituye en todos estos casos una forma de desfiguración del cuerpo místico.
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    Escrituras subversivas: Un análisis comparativo de “La fase del rubí” de Pilar Pedraza y “La condesa sangrienta” de Alejandra Pizarnik
    (2018-07-27) Úbeda Sánchez, Patricia
    El siguiente trabajo consiste en un aná lisis comparativo de dos obras literarias: La condesa sangrienta de Alejandra Pizarnik y La fase del rubí de Pilar Pedraza. Par a esto se va a establecer una línea metodológica, en la que solo se van a analizar los elementos que convergen en ambas obras. El objetivo de este estudio es mostrar que los elementos que más énfasis dan las autoras, como la melancolía, la sangre y la bell eza, construyen una imagen subversiva y abyecta de lo femenino
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    Estudio del proceso de sensibilidad colateral en células leucémicas murinas y humanas con fenotipo de resistencia a múltiples fármacos (MDR).
    (2013-09-25) Cerezo Fernández, David; Martín-Orozco Santiago, Elena; Departamento de Bioquímica y Biología Molecular e Inmunología
    INTRODUCCIÓN: La adquisición del fenotipo de resistencia a múltiples fármacos (MDR) en células tumorales las convierte en resistentes a fármacos antineoplásicos y es una de las principales causas del fracaso de la quimioterapia en algunos tumores. La expresión de glicoproteína P (MDR-1, P-gp, ABCB1) contribuye a esta resistencia expulsando los fármacos o regulando la muerte celular programada. Por otro lado, la sobreexpresión de miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 observada en tumores sanguíneos se ha asociado a la resistencia a quimioterapia en varios cánceres humanos. También es importante estudiar alteraciones en las rutas de señalización de MAPKs y la secreción de citocinas en las células con fenotipo MDR. OBJETIVOS: El propósito de este trabajo fue encontrar un estímulo capaz de inducir sensibilidad colateral en células leucémicas murinas y humanas con fenotipo MDR, y caracterizar el tipo de muerte celular inducida. El segundo propósito fue estudiar la contribución de MDR-1, caspasas, proteínas de la familia Bcl-2, MAPKs y citocinas al proceso de sensibilidad colateral. MATERIALES Y MÉTODOS: Para alcanzar nuestros objetivos, usamos células leucémicas murinas L1210 y su sublínea celular resistente L1210R, así como una línea celular procedente de la línea L1210 transfectada con un plásmido que contenía el gen MDR-1 (CBMC-6). Se realizó western-blot para estudiar la expresión de proteínas, inhibición de MAPKs y caspasas y silenciamiento de ARN de MDR-1, Bcl-xL, Bcl-2 y Bax para estudiar el papel de estas proteínas. RESULTADOS: Se encontró que las células leucémicas resistentes con sobreexpresión de P-gp, pero no sus parentales sensibles, son hipersensibles a estrés hipotérmico produciéndose apoptosis a temperaturas por debajo de 4ºC. La transfección de la línea celular parental con un plásmido que contiene P-gp las convierte en sensibles a estrés hipotérmico, demostrando la asociación entre la expresión de P-gp y la muerte celular provocada por el frío. También observamos un incremento de la expresión basal y actividad del fragmento activo de caspasa 3 a temperatura fisiológica (37ºC) en las células MDR. La inhibición de caspasa 3 rescató parcialmente a las células leucémicas MDR de la apoptosis inducida por el frío, lo que sugiere que el mecanismo de muerte celular depende de caspasa 3. Esto demuestra que la expresión de P-gp juega un papel importante en la supervivencia de las células MDR y es acompañada por un proceso de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico. Se observó que la línea parental leucémica (L1210) y la línea celular CBMC-6 presentan una alta expresión de la proteína anti-apoptótica Bcl-xL, mientras que la expresión de Bcl-2 es baja. Por el contrario, en las células L1210R se observó una disminución de la expresión de Bcl-xL y un aumento de Bcl-2. La inhibición de dirigida de proteínas anti-apoptóticas confirma que la expresión de Bcl-xL es un regulador clave de la supervivencia de las células leucémicas. En contraste, el silenciamiento de Bcl-2 muestra que la supervivencia de las células L1210R no depende del nivel de expresión de Bcl-2. Así, nuestros datos demuestran que la supervivencia de la línea celular parental depende de la expresión de Bcl-xL, pero la adquisición del fenotipo MDR elimina esta dependencia y podría depender de varios miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2. Además, los resultados obtenidos en las células CBMC-6 demuestran que P-gp tiene poca influencia sobre las proteínas de la familia Bcl-2. Resultados similares se obtuvieron bajo condiciones de estrés hipotérmico y exposición al fármaco daunomicina. En relación a la ruta de señalización de MAPKs, demostramos su importancia en el desarrollo del fenotipo MDR, así como en el desarrollo de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico, demostrando que la inhibición de ERK y JNK puede proteger, parcialmente, de la muerte celular inducida por el frío en las células L1210R y CBMC-6. CONCLUSIONES: El proceso de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico está asociado al fenotipo MDR en células murinas, y ocurre a través de un proceso de apoptosis dependiente de caspasas. La expresión y funcionalidad de MDR-1 está asociada a la sensibilidad a hipotermia en células murinas. El desarrollo del fenotipo MDR está acompañado de cambios en la expresión de proteínas Bcl-2, pero éstas no influyen en la sensibilidad colateral. La señalización a través de ERK y JNK está implicada en la sensibilidad colateral observada en las células MDR. La señalización a través de citocinas podría tener un papel importante en la respuesta a estrés de las células MDR. TITLE: STUDY ABOUT COLLATERAL SENSITIVITY PROCESS IN MURINE AND HUMAN LEUKEMIC CELLS WITH MULTIDRUG RESISTANCE PHENOTYPE (MDR) AUTHOR: DAVID CEREZO FERNÁNDEZ INTRODUCTION: The acquisition of a multidrug-resistant (MDR) phenotype by tumor cells that renders them unsusceptible to anti-neoplasic agents is one of the main causes of chemotherapy failure in human malignancies. The increased expression of P-glycoprotein (MDR1, P-gp, ABCB1) in tumor cells contributes to drug resistance by extruding chemotherapeutic agents or by regulating programmed cell death. In the other hand, over-expression of anti-apoptotic Bcl-2 family members has been reported in hematologic malignancies and has been associated with chemotherapy resistance in various human cancers. As these findings, it is important to study alterations in MDR cells on MAPKs pathway and citokines secretion. OBJECTIVES: The aim of this work was to find a stimulus able to induce collateral sensitivity in murine and human leukemic MDR cells, and to characterize the type of death induced. The second aim was to study the contribution of MDR-1, caspases, family Bcl-2 proteins, MAPKs and citokines to this collateral sensitivity process. MATERIALS AND METHODS: To reach our objectives we used L1210 murine leukemia cells and its resistant derived cell line L1210R, as well as a transfected with a plasmid containing MDR-1 cell line obtained from L1210 (CBMC-6). It was used western-blot to study proteins expression, inhibition of MAPKs and caspases and RNAm silencing of MDR-1, Bcl-xL, Bcl-2 and Bax family to study the role of this proteins. RESULTS: It was found that resistant leukemic cells with P-gp over-expression, but not their sensitive counterparts, are hypersensitive to cold-induced cell death when exposed to temperatures below 4ºC. Transfection of parental cells with a P-gp-expressing plasmid makes these cells sensitive to cold stress, demonstrating an association between P-gp expression and cell death at low temperatures. Furthermore, we observed increased basal expression and activity of effector caspase-3 at physiological temperature (37ºC) in MDR cells. Treatment with a caspase-3 inhibitor partially rescues MDR leukemic cells from cold-induced apoptosis, which suggests that the cell death mechanism may require caspase-3 activity. Taken together, these findings demonstrate that P-gp expression plays a role in MDR cell survival, and is accompanied by a collateral sensitivity to cold stress. We demonstrate that parental leukemic (L1210) and CBMC-6 cells display high constitutive expression of anti-apoptotic Bcl-xL protein, while Bcl-2 protein expression was very low. By contrast, leukemic cells L1210R display a decrease of Bcl-xL and up-regulation of Bcl-2 protein expression levels. Furthermore, targeted inhibition of individual anti-apoptotic proteins by RNA silencing confirms that Bcl-xL expression is a key regulator of leukemic cells survival. In contrast, the silencing of Bcl-2 shows that L1210R survival doesn’t depend on Bcl-2 expression level. Together, our data demonstrate that parental leukemic cells survival are largely dependent on Bcl-xL protein expression, but acquisition of MDR phenotype by such cells abrogate such survival dependence and suggests that resistant cells became probably dependent on more than one anti-apoptotic protein for survival at physiological conditions. Additionally, the results obtained with CBMC-6 cells demonstrate that P-gp exert slight influence in the expression level of Bcl-2 family members. Similar results were obtained under cold stress and drug exposure. Related to MAPKs signaling pathway, we have addressed it importance in MDR phenotype development, as well as in hypothermia collateral sensitivity, showing that ERK and JNK inhibition can protect, partially, against stress-cold induced-death in L1210R and CBMC-6 cell lines. CONCLUSIONS: Collateral sensitivity to cold stress is associated to MDR phenotype in murine cells, and it occurs by a caspase-dependent apoptosis process in murine cells. Expression and functionality of MDR-1 is strongly associated to hypothermia sensitivity in murine cells. MDR phenotype development is accompanied by changes in Bcl-2 family proteins expression, but it is not shown an association with collateral sensitivity. ERK and JNK signaling pathways are implicated in collateral sensitivity process observed in MDR cells. Citokines signaling could play an important role on MDR cells stress response.
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    Estudio descriptivo mutacional de pacientes hemofílicos en la Región de Murcia.
    (2013-12-04) García Candel, Faustino; Moraleda Jiménez, José María; Tizzano Ferrari, Eduardo; Majado Martínez, Mª Juliana; Departamento de Medicina Interna
    Introducción: La Hemofilia se caracteriza por una deficiencia de la actividad de Factor VIII de la coagulación (Hemofilia A) o de Factor IX de la coagulación (Hemofilia B). La prevalencia estimada es de alrededor de 1 por 5000 varones nacidos (para Hemofilia A) y de 1 por 30000 varones nacidos (para Hemofilia B). La transmisión es como un rasgo recesivo ligado al cromosoma X (herencia ligada al sexo). La clínica se basa en la aparición de sangrados recurrentes, cuya intensidad y frecuencia están en estrecha relación con la severidad del defecto de la proteína FVIII o FIX. La complicación más temida actualmente en el tratamiento de la enfermedad es la aparición de aloanticuerpos contra el factor VIII/FIX administrado y que aparece más frecuentemente en las formas graves. El gen del FVIII (F8) se encuentra en la porción telomérica distal del brazo largo del cromosoma X, en la banda Xq28. Consta de 26 exones que se extienden a lo largo de unas 186.000 pares de bases. Las alteraciones genéticas en el gen del FVIII (F8) se pueden clasificar en: grandes reaordenamientos. Inserciones o deleciones, y sustituciones simples. La alteración recurrente más importante clínicamente es un reordenamiento que afecta al intrón 22 (inversión del intrón 22), afectando aproximadamente al 45% de todas las formas graves de Hemofilia A. El gen del FIX (F9) se encuentra localizado en la región telomérica del brazo largo del cromosoma X, en la banda Xq27, tiene un tamaño cercano a las 34 Kb y consta de 8 exones y 7 intrones. Las mutaciones en el gen F9 se pueden clasificar en: mutaciones puntuales, mutaciones hotspots, mutaciones que truncan la proteína y mutaciones que afectan a la región promotora. El grupo más frecuente de alteraciones es el de las mutaciones puntuales. El estudio de las portadoras de Hemofilia constituye una parte fundamental en el manejo de esta patología, tanto para hacer un adecuado asesoramiento genético como para prevenir posibles eventos hemorrágicos en esta población. Para el diagnóstico molecular de la Hemofilia existen dos tipos de metodologías: Técnicas indirectas y la secuenciación nucleotídica directa. Objetivo: El objetivo principal es estudiar las mutaciones que afectan a los pacientes hemofílicos de la Región de Murcia. Material y Método: Estudiamos a 73 pacientes de un total de 80 censados, con una mediana de edad de 26 años (rango 3-76 años). De las 53 familias no relacionadas censadas, estudiamos a 46. La dosificación de los factores VIII y IX se realizó en el laboratorio de Hemostasia del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca, que cuenta con la acreditación de la norma 15189 por ENAC. Los afectados fueron distribuidos por familias no relacionadas, detectándose en cada una de ellas a las portadoras posibles y obligadas mediante la relación del árbol genealógico. El estudio genético se llevó a cabo tanto a los afectados como a las portadoras. Para Hemofilia A se estudió en primer lugar la presencia o ausencia de inversión del intrón 22 y del intrón 1 mediante PCR inversa. En los casos negativos se realizó secuenciación directa del gen F8. Para Hemofilia B se realizó secuenciación directa del gen F9 mediante PCR. Resultados: En nuestra región existen 80 pacientes hemofílicos vivos distribuidos en 53 familias. 65 (81,2%) tienen Hemofilia A y 15 (18,5%) Hemofilia B, con una mediana de edad de 28 años (1 mes-76 años). Existen 28 afectados con Hemofilia A grave, 7 con Hemofilia A moderada, 30 con Hemofilia A leve, 8 con Hemofilia B grave, 1 con Hemofilia B moderada y 6 con Hemofilia B leve. De los 73 pacientes estudiados (distribuidos en 46 familias) hemos encontrado la mutación causante de la enfermedad en todos ellos y se ha confirmado el estado de portadora mediante estudio genético en 102 casos de los 149 miembros femeninos de las distintas familias. El grupo de portadoras más numeroso corresponde al de edades entre 16 y 45 años. De las mutaciones encontradas en la población estudiada, las más frecuentes son las de tipo missense, seguidas por la inversión del intrón 22. Se han encontrado 11 mutaciones no descritas en los registros internacionales, correspondiendo la mayor parte a mutaciones de tipo missense. Existe una incidencia de casos sin antecedentes familiares del 52,2%, con predominio en los casos de HAG (28,3%). No se ha encontrado la alteración genética en la madre en 4 casos. Conclusiones: Se ha podido determinar la alteración genética causante de la Hemofilia en todos los pacientes estudiados, siendo el tipo de mutación más frecuente la missense. Existe un porcentaje importante de casos esporádicos, la mayoría con Hemofilia A grave, en los que se ha determinado los casos de portadoras y poder realizar un adecuado asesoramiento genético. La incidencia de inhibidores ha sido del 11%, algunos casos asociados a mutaciones no descritas en registros internacionales. Por otra parte, el algoritmo de estudio genético diseñado para este trabajo ha resultado efectivo. Introduction: Hemophilia is characterized by a deficiency in the activity of coagulation factor VIII (Hemophilia A) or coagulation Factor IX (Hemophilia B). The estimated prevalence is about 1 per 5000 male births (Hemophilia A) and 1 in 30,000 male births (for hemophilia B). The transmission as a recessive X-linked (sex-linked inheritance). The clinic is based on the occurrence of recurrent bleeding and the intensity and frequency are closely related to the severity of the defect protein. The most feared complication in the treatment of the disease is the occurrence of alloantibodies against factor VIII / FIX administered and most frequently occurring in severe forms. The F8 gene is in the distal portion of the long arm of chromosome X in the Xq28 band. Consists of 26 exons spanning along some 186,000 base pairs. Genetic alterations in the F8 gene can be classified as: Gross gene rearrangements. Insertions or deletions, and simple substitutions. The most important mutation is the recurrent rearrangement involving the intron 22 (intron 22 inversion), affecting approximately 45% of all severe forms of hemophilia A. The F9 gene is located at the telomeric region of the long arm of the X chromosome, on Xq27 band and has a size close to 34 kb and consists of 8 exons and 7 introns. Mutations in this gene can be classified into: point mutations, hotspots mutations, protein truncating mutations and promoter region mutations. The most common group of disorders is the point mutations. The study of carriers of Hemophilia is an essential part in the management of this condition, both for adequate genetic counseling and to prevent possible bleeding events in this population. For molecular diagnosis of haemophilia two types of methodologies: Indirect techniques and direct nucleotide sequencing Objective: The main objective is to study mutations affecting hemophiliacs patients in the Region of Murcia. Material and Methods: We studied 73 patients with a total of 80 census, with a median age of 26 years (range 3-76 years). Of the 53 unrelated families surveyed, we studied 46. The dosage of factor VIII and IX was held at the Hemostasis Laboratory University Hospital Virgen de la Arrixaca, with the accreditation of the standard 15189 by ENAC. These patients were distributed in unrelated families, detected in each of the carriers by performing the pedigree. The genetic study was conducted both affected and carriers. In Hemophilia A is first examined the presence or absence of intron 22 inversion and intron 1 inversion by inverse PCR. In negative cases direct sequencing was performed of F8 gene. Hemophilia B Direct sequencing was performed by PCR of F9 gene. Results: In our region there are 80 living hemophiliacs distributed in 53 families. 65 (81.2%) have Hemophilia A and 15 (18.5%) Hemophilia B, with a median age of 28 years (1 month-76 years). There are 28 affected with severe Hemophilia A, Hemophilia 7 with moderate, 30 with mild hemophilia A, 8 with severe haemophilia B, one with moderate Hemophilia B and 6 with mild Hemophilia B. Of the 73 patients studied (distributed in 46 families) have found the mutation in all of them and confirmed the carrier status by genetic study in 102 cases of the 149 female members of the different families. The largest carrier group corresponds to ages 16 and 45. Of the mutations found in the study population, the most common are missense, followed by the inversion of intron 22. We have found 11 mutations not described in the international records, being missense mutationts the most frequent. There is an incidence of cases with no family history of 52.2%, predominantly in severe Hemophilia A (28.3%). In four mother no genetic alteration was found. Conclusions: It was possible to determine the genetic alteration responsible for Hemophilia in all patients studied, being the most common type of the missense mutation. There is a significant percentage of sporadic cases, most with severe hemophilia A. In this cases, the carrier diagnosis is essential for an adequate genetic counseling. The incidence of inhibitors was 11%, some cases associated with mutations not described in international registrations. Moreover, genetic analysis algorithm designed for this work has been effective.
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    Factor V Leiden y enfermedad cerebrovascular / Juan Antonio Iniesta Valera ; directores Vicente Vicente García, Javier Corral de la Calle.
    (Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Medicina Interna,, 1996) Iniesta Valera, Juan Antonio
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    Identificación de nuevos elementos implicados en la regulación de antitrombina= Identification of new elements involved in antithrombin regulation.
    (2013-04-08) De la Morena Barrio, Mª Eugenia; Corral de la Calle, Javier; Vicente García, Vicente; Facultad de Medicina
    Resúmenes de 150 palabras en Inglés Deficiency of antithrombin caused by mutations affecting the gene encoding this key anticoagulant (SERPINC1) significantly increases the risk of thrombosis. We aim to identify new mechanisms involved in antithrombin deficiency. Using molecular, cellular and biochemical methods, we studied 29 patients with antithrombin deficiency without SERPINC1 mutation, a family study, three case-control studies including 2,980 patients and 3,996 controls, and two patients with congenital disorder of glycosylation (CDG). We identified the first mutation affecting the SERPINC1 promoter causing antithrombin deficiency. We confirmed the low genetic variability of SERPINC1 and its minor role on the heritability of antithrombin. Genome wide association studies and silencing experiments identified the first modulating gene of antithrombin, LARGE. We diagnosed a patient with CDG based on his antithrombin deficiency. Finally, we described a new disorder with identical biochemical features than CDGs, but only thrombosis, which is caused by a single mutation in PMM2 and concomitant alcohol consumption. Key Words: Antithrombin, Thrombosis, CDG, Mutations, SERPINC1 Resumen de 150 palabras en Castellano. La deficiencia de antitrombina causada por mutaciones en el gen SERPINC1 incrementa el riesgo trombótico. Nuestro objetivo fue identificar nuevos mecanismos implicados en la deficiencia de este anticoagulante. Empleando metodología molecular, celular y bioquímica estudiamos 29 pacientes con deficiencia de antitrombina sin mutaciones en SERPINC1, un estudio familiar, tres estudios caso-control (2,980 pacientes/3,996 controles) y dos pacientes con trastornos congénitos de glicosilación (CDG). Identificamos la primera mutación en el promotor de SERPINC1 que causa deficiencia de antitrombina. Confirmamos la baja variabilidad genética en SERPINC1 y su escasa influencia en la heredabilidad de antitrombina. Un GWAS y experimentos de silenciamiento mostraron que LARGE es el primer gen modulador de antitrombina. Diagnosticamos un CDG por la deficiencia de antitrombina de un paciente con trombosis recurrente y descubrimos nuevo desorden con patrón bioquímico similar al CDG pero solo con trombosis que es causado por una sola mutación en PMM2 y consumo de alcohol. Palabras clave: Antitrombina, Trombosis, CDG, Mutaciones, SERPINC1
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    Influencia de diversas condiciones analíticas en la determinación de colinesterasa en sangre entera mediante el método de Ellman
    (Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 2001) Tecles Vicente, Fernando; Martínez Subiela, Silvia; Cerón Madrigal, José Joaquín; Facultad de Veterinaria
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    Inyección percutánea eco-dirigiida de trombina en los seudoaneurismas femorales iatrógenos / Victoria Vázquez Sáez ; dirección, Antonio Piñero Madrona y Manuel Reus Pintado.
    (Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Cirugía, Pediatría, Obstetricia y Ginecología,, 2004) Vázquez Sáez, Victoria
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    Plaquetas: características ultraestructurales y su papel en la hemostasia y respuesta inflamatoria
    (Murcia: Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 1996) Bautista, María José; Carrasco, L.; Gómez-Villamandos, J. C.; Martín de las Mulas, J.; Pérez, J.; Méndez, A.; Sierra, M. A.; Facultad de Veterinaria
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    La sangre como criterio de acceso y perpetuación del poder político desde el Antiguo Régimen y cómo llaman capacidad a lo que es sangre y sangre a lo que es dinero. Un ejemplo de La Mancha.
    (Murcia: Servicio de Publicaciones de la Universidad de Murcia, 2016) Donoso García, Santiago
    Weber y la sociología clásica diferencian el acceso y configuración del poder político y el Estado en las sociedades modernas industriales frente a las sociedades pre-industriales. Weber habla del liderazgo propio de las sociedades pre-industriales basado en el parentesco y la sangre frente a la racionalización supuesta del Estado moderno industrial. Para justificar tal privilegio de acceso al deseado poder político se estableció en el Antiguo Régimen el privilegio de la mitad de oficios a la sangre noble y el impedimento a los considerados cristianos nuevos según una teoría de la sangre consecuente de la cosmovisión de la sociedad de la expiación. No obstante, el poder del dinero blanqueó sangre y linajes como medio de acceso y perpetuación en los oficios de alcaldes, deseables por sus rentas que conseguían "recta e irrectamente". La sangre y linaje, justificado como capacidad, explicaba los mecanismos de selección de las élites políticas. Pero hoy perduran las relaciones  de sangre y parentesco en todas las sociedades en las que las élites económicas,emparentadas entre sí, articulan el orden político de la sociedad, y el orden político condiciona el orden económico, el orden legislativo y, siempre lo intentan, el orden simbólico en el cual se justifican las posiciones privilegiadas