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Análisis de factores peri-concepcionales que influyen en la proporción del sexo en el ratón
(2014-12-03) Laguna Barraza, Ricardo Alonso; Gutiérrez Adán, Alfonso; Facultad de Veterinaria
Introducción: La proporción de sexos está distribuida de forma equilibrada en la mayor parte de las especies, y generalmente está determinada por el sexo heterogamético. En mamíferos, los ovocitos producidos por las hembras mantienen siempre la misma carga cromosómica sexual (cromosoma “X”), y son los machos, con una dotación cromosómica distinta en sus gametos (cromosomas “X” e “Y”) los que determinan el sexo. Durante la espermatogénesis se produce igual cantidad de gametos portadores del cromosoma “X” e “Y”, por lo que la probabilidad de tener una cría macho o una cría hembra por cada evento de fecundación en especies monotocas o politocas sería del 50%. Sin embargo, los datos obtenidos por los registros en muchas especies nos muestran que no siempre la proporción de los sexos es equilibrada al 50%. En la literatura se han descrito muchos factores que podrían tener influencia directa o indirecta en el desequilibrio de la proporción de sexos. A pesar de ello, hasta la fecha se desconocen con precisión los mecanismos por los cuales se produce este fenómeno. Objetivo: La presente tesis propone analizar distintos factores y posibles mecanismos que pueden estar relacionados con la proporción de sexos. Metodología: En nuestro estudio, utilizamos un modelo ratón transgénico que posee una secuencia marcadora integrada en el cromosoma “X”, y hemos analizado en primer lugar la posible distorsión primaria y secundaria del sexo debida a la presencia del transgén. Así como la calidad embrionaria medida en número de células del blastocisto. Analizamos el efecto de la dieta durante los periodos de pre-implantación y post-implantación, tomando en consideración la lateralidad (origen ovárico o uterino). Se estudiaron las relaciones que existen entre la ovariectomía y la compensación hormonal ovárica, la proporción del sexo y la posición adoptada en el útero por cada uno de los sexos. Se analizó si existía una relación entre la velocidad de desarrollo pre-implantacional (segunda división mitótica embrionaria y posterior desarrollo a blastocisto) y la calidad y el sexo de los embriones producidos in vivo. Resultados y Discusión: En el capítulo I. Se observó que esta modificación genética, no alteraba las proporciones primaria ni secundaria de sexos, ni el número celular de embriones pre-implantacionales, y debido a ello, consideramos el factor transgénico como no determinante en la proporción de los sexos. En el capítulo II se encontraron diferencias de proporción del sexo cuando se registraron los datos del lado de procedencia (derecho o izquierdo), principalmente en estadios cercanos al momento de la fecundación, y en ratonas de menor constitución física. Estas diferencias se correlacionan con la perdida embrionaria y dejan de ser significativas cuando se observaban estas proporciones de manera global. En el capítulo III, no se encontraron diferencias en las proporciones de machos y hembras entre las hemi-ovariectomías derecha e izquierda. Sin embargo los resultados muestran una preferencia de las hembras a implantar en secciones uterinas cercanas al cérvix, siendo estas hembras de un peso inferior al resto de hembras implantadas en otras secciones del útero. Por último, en el capítulo IV, nuestros resultados no indican una diferencia de la proporción del sexo en los embriones recuperados en el paso de 2 a 3 células, ni tampoco en la velocidad de desarrollo a blastocisto. Solamente se observó una mayor proporción de hembras en los embriones que más lentamente se dividían a 3 células y posteriormente tardaban más en llegar al estadio de blastocisto. También se observó una relación entre la calidad embrionaria definida por la expresión de marcadores de pluripotencia y la velocidad de división pre-implantacional. Summary Introduction: Sex ratio is equally distributed in most species, and it is generally determined by the heterogametic sex. In mammals, oocytes produced by females always keep the same chromosomal sex (chromosome “X”); however, the males, with a different chromosome in their gametes (chromosomes “X” and “Y”)determine the sex. During spermatogenesis, equal number of gametes carrying the chromosome “X” and “Y” is produced. According to Mendelian’s genetic, the chance of breeding a male or a female pup per fertilization event in polytocous and monotocous species would be 50%. However, the data obtained in many species show that not always the sex ratio is balanced at 50%. In the literature, many factors that could have a direct or indirect influence on the imbalance of the sex ratio have been described. However, the precise mechanism by which this phenomenon occurs is still unknown. Objetive: This thesis aims to analyze various factors and possible mechanisms that may be related to the sex ratio. Methods: In our study, we used a transgenic mouse model that presents a marker sequence integrated in the “X” chromosome, and we first analyzed the possible primary and secondary sex distortion due to the presence of the transgene, as well as embryo quality measured by the number of cells of the blastocyst. We analyzed the effect of diet during pre-implantation and post-implantation periods, considering laterality (ovarian or uterine origin). The relationship between ovariectomy and ovarian hormonal balance, sex proportion and position in the uterus for each of the sexes were studied. We analyzed whether there was a relationship between the rate of preimplantation development (second mitotic division and subsequent embryo development to blastocyst) and the quality and sex of embryos produced in vivo. Results and discussion: In chapter I, It was noted that this genetic modification did not alter the sex ratio primary or secondary, or cell number of pre-implantation embryos, and because of this, we considered the transgenic factor as non-determinant in the sex ratio. In Chapter II, differences in sex ratio were found when the data of the source side (right or left) were recorded, mainly in stages near to the time of fertilization, and in mice with minor physical condition. These differences were correlated with embryonic loss and were not significantly different when these ratios were observed globally. In Chapter III, no differences in the proportions of males and females between the right and left hemi-ovariectomy were found. However, the results showed that females had a tendency to implant in sections close to uterine cervix, presenting a lower weight than those females implanted elsewhere in the uterus. Finally, in Chapter IV, our results do not show a difference in the sex ratio in embryos recovered in the 2 to 3-cells stage, nor on the rate of development to blastocyst. It was only observed a higher proportion of females in embryos that arrived to the 3-cell stage the slowest and subsequently took longer to reach the blastocyst stage. A relationship between the embryo quality defined by the expression of markers of pluripotency and by the preimplantation speed division was also observed.
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Análisis de la expresión y función del inhibidor de antizimas 2 (AZIN2) en ratones transgénicos : estudio de nuevos ortólogos y parálogos de AZIN2
(2016-11-29) Lambertos Escudero, Ana; Peñafiel García, Rafael; Facultad de Medicina
BACKGROUND AND AIMS Polyamines are ubiquitous organic cations that play multiple essential roles in mammalian physiology. Ornithine decarboxylase (ODC) is the rate limiting enzyme in polyamine biosynthesis and it is regulated by antizymes, a family of small proteins whose synthesis is stimulated by high polyamine levels. AZs bind to ODC inhibiting its enzymatic activity and target it for degradation by the 26S proteasome. AZs are themselves regulated by another ODC-related family named antizyme inhibitors (AZINs), consisting of two members: AZIN1 and AZIN2. These proteins lack enzymatic activity but they bind to AZs with higher affinity than ODC, counteracting the effects of antizymes on ODC. AZIN1 is a ubiquitous protein that participates in the regulation of polyamine metabolism and cell growth and its disruption in mice causes death soon after birth. AZIN2 is mainly expressed in brain and testis, followed by other secretory tissues and cells. Although the physiological role of AZIN2 is mostly unknown, some data suggests that it is involved in cell growth, vesicular trafficking, secretion and spermiogenesis. In order to study the expression pattern of AZIN2 and its physiological role in mouse, AZIN2 KO mice were generated by the insertion of a beta geo cassette, resulting in a fused protein formed by the N-terminus extreme of AZIN2 and the reporter enzyme β-galactosidase. On the other hand, advances in genome sequencing revealed the existence of many orthologous of Azin2, and a new paralogue of Azin2 in mouse, named Gm853, whose study by transient transfected cells is a main aim of the present work. RESULTS AND CONCLUSIONS 1. Expression of the reporter gene lacZ in tissues of mice lacking Azin2. AZIN2 KO generated mice provide qualitative and quantitative information about the expression and function of AZIN2. Hystochemical and biochemical analysis of the reporter β-galactosidase activity in different tissues of AZIN2 KO mice confirmed significant expression of AZIN2 in epidydymis, adrenal glands, pancreas, heart, lung and eyes, in addition to testis and brain, pointing to secretory regions. However, none of the KO tissues examined showed significantly variation in polyamine content. Finally, the microarray analysis of gene differential expression between WT and KO mice did not show common changes, except the marked reduction of Azin2 expression. 2. The role of AZIN2 in male reproductive system. Hystological sections from testis and epididymis of AZIN2 KO and WT mice showed that AZIN2 was mainly expressed in haploid cells but also in Leydig cells, suggesting that AZIN2 is required not only for the synthesis but also for the function of mature sperm cells. Besides, the sperm motility test revealed that most AZIN2 KO sperm cells were not able to move across the test medium. However, this deficiency in motor skills did not have major consequences in male fertility, as AZIN2 KO mice demonstrated to be as fertile as their WT counterparts. Finally, the deprivation of AZIN2 in male reproductive system was also associated to decreased biosynthesis and secretion of testosterone. 3. Expression and function of AZIN2 in other secretory cells and tissues. Phenotypic analysis of AZIN2 KO mice. The role of AZIN2 in murine physiology was analysed in other secretory cells and tissues apart from testis by comparing the gain or the loss of functions in AZIN2 KO mice. In brain, AZIN2 prevails in the cerebellum and hippocampus areas and its disruption in these areas correlates with a deficient motor function in mice. The expression of AZIN2 in adrenal glands and pancreas was restricted to the adrenal medulla and to Langerhans islets, respectively. In other tissues such as heart, eyes, lung and kidney, the expression of AZIN2 was also restricted to specific types of cells. In pancreas, the absence of AZIN2 generates a slight hyperglycemia associated to impaired synthesis and secretion of insulin from β cells. 4. Structural and functional properties of Xenopus Azin2. Studies about ODC in Xenopus reveal the existence of two homologous proteins named XODC1 and XODC2, with different spatial and temporary patterns of expression. XODC2 appears on gene databases as XAZIN2, thus, it is considered an orthologous of mAZIN2 and hAZIN2. Unlike mAZIN2, the orthologous of AZIN2 in Xenopus laevis (xlAZIN2) is degraded by AZ1 and possesses decarboxylase activity of ornithine and lysine, showing higher affinity for lysine than for ornithine. The comparative analysis of xlAZIN2 with mODC and mAZIN2 revealed additional similarities with mODC, based on the cytosolic subcellular localization and the ability to form aggregates such as homotetramers. Similarly to mODC, xlAZIN2 stimulates agmatine uptake, decreases that of putrescine and spermidine and presents a short half-life, lower than 30 minutes. 5. Study of mouse Gm853, a new paralogue of Odc and Azin2. Comparative analysis of protein sequences from ODC paralogues revealed GM853 as a new homologue protein of ODC and AZINs in mouse, presenting all conserved residues for enzymatic activity. Experiments with transfected cells demonstrated that GM853 is not an antizyme inhibitor as it does not prevent the interaction between ODC and AZ1. Otherwise, it is a very stable protein mainly located in the cytosol and it is able to form homodimers and homotetramers but no heterodimers with other paralogues. Besides, GM853 presents enzymatic activity, being the first decarboxylase for L-Leucine described in mammals. The expression of GM853 in mice is restricted to renal tissue with higher representation in male kidneys, related to increased levels of testosterone. The product of Leucine decarboxylation is the isopenthylamine and it is rapidly excreted with urine. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS Las poliaminas son cationes orgánicos presentes en todas las células con funciones esenciales en la fisiología de todos los mamíferos. Ornitina descarboxilasa (ODC) es la enzima limitante en la biosíntesis de poliaminas y está regulada por los antizimas (AZs), una familia de pequeñas proteínas cuya síntesis es estimulada por las propias poliaminas. Los AZs se unen a ODC inhibiendo su actividad enzimática y la conducen al proteasoma 26S para su degradación. Los AZs son a su vez regulados por otra familia de proteínas relacionadas con ODC, denominadas inhibidores de antizimas (AZINs), formada por dos miembros: AZIN1 y AZIN2. Estas proteínas carecen de actividad enzimática pero se unen a los AZs con más afinidad que ODC, contrarrestando los efectos de los antizimas sobre ODC. AZIN1 es una proteína ubicua que participa en la regulación del metabolismo de poliaminas y el crecimiento celular y su abatimiento en ratones causa la muerte poco después de nacer. AZIN2 se expresa fundamentalmente en cerebro y testículos, además de otros tejidos y células secretoras. Aunque el papel fisiológico de AZIN2 no se conoce con certeza, algunos experimentos sugieren que está implicado en el crecimiento celular, el tráfico vesicular, secreción y espermatogénesis. Con el fin de estudiar el patrón de expresión de AZIN2 y su implicación fisiológica en ratón, se generaron ratones KO de AZIN2 mediante la inserción de un cassette beta geo, que dio lugar a una proteína recombinante formada por el extremo N-terminal de AZIN2 y la enzima reportera β-galactosidasa. Por otro lado, los avances en el ámbito de la secuenciación de genomas, han revelado la existencia de un gran número de ortólogos de Azin2, así como un nuevo parálogo de Azin2 en ratón, denominado Gm853, cuyo estudio mediante células transfectadas también es objeto de esta tesis doctoral. RESULTADOS Y CONCLUSIONES 1. Expresión del gen reportero lacZ en tejidos de ratones con abatimiento de Azin2. El modelo de ratón transgénico con abatimiento del gen Azin2 generado, permitía el estudio de la expresión y posible función de la proteína AZIN2. El análisis histoquímico y bioquímico de la actividad β-galactosidasa en tejidos de ratones KO de AZIN2 confirmó la expresión de AZIN2 en epidídimo, glándula adrenal, páncreas, corazón, pulmón y ojos, aparte de testículo y cerebro, apuntando a células secretoras. Sin embargo, en ninguno de los tejidos estudiados en ratones deficientes en AZIN2 se observó reducción significativa de los niveles tisulares de poliaminas. Finalmente, el estudio comparativo de la expresión de genes entre ratones WT y KO mediante microarrays, no mostró cambios comunes en todos ellos salvo la marcada reducción de la expresión de Azin2. 2. The role of AZIN2 in male reproductive system. El análisis histoquímico de secciones de testículos y epidídimos WT y KO de AZIN2 mostró que AZIN2 se expresa fundamentalmente en células haploides, pero también en las células de Leydig, sugiriendo su participación no solo enla síntesis sino también en la maduración de los espermatozoides. Además, el test de movilidad espermática mostró que la mayoría de los espermatozoides KO de AZIN2 no eran capaces de desplazarse en el medio de ensayo. Sin embargo, esta deficiencia en la motilidad no tuvo consecuencias en la fertilidad de los ratones machos, demostrando ser tan fértiles como los WT. Finalmente, el abatimiento de AZIN2 en el aparato reproductor masculino se asoció a una disminución en la biosíntesis y la secreción de testosterona. 3. Expresión y función de AZIN2 en otros tejidos y células secretoras. Análisis fenotípico de los ratones KO de AZIN2. El papel de AZIN2 en la fisiología murina en otros tejidos que expresan AZIN2 se analizó comparando los cambios sobre la función en ratones KO de AZIN. En el cerebro de ratón, AZIN2 predomina en el cerebelo y en el hipocampo y su disrrupción en estas áreas está relacionada con un una función motora deficiente. La expression de AZIN2 en la glándula adrenal y el páncreas se limitó a la médula adrenal y a los islotes de Langerhans, respectivamente. En otros tejidos como corazón, ojos, pulmón y riñón, la expression de AZIN2 se concentró en tipos de células específicas. En páncreas, la ausencia de AZIN2 genera una ligera hiperglucemia porque afecta a la síntesis y secreción de insulina por las células β. 4. Propiedades estructurales y funcionales de Azin2 de Xenopus. El estudio de ODC en Xenopus reveló la existencia de dos proteínas homólogas denominadas XODC1 y XODC2, con diferente patró de expresión espacial y temporal. XODC2 aparece en las bancos de genes como XAZIN2, siendo considerado un ortólogo de mAZIN2 y hAZIN2. Al contrario que AZIN2 de ratón, su ortólogo en Xenopus (xlAZIN2) es degradado por AZ1 y presenta actividad descarboxilasa de ornitina y lisina, con una afinidad superior por lisina que por ornitina. El análisis comparativo de xlAZIN2 con mODC y mAZIN2 mostró una mayor semejanza con mODC, basándose en su localización subcelular citosólica y en la capacidad de ambas proteínas para formar oligómeros. Además, al igual que mODC, xlAZIN2 presenta una vida media muy corta (inferior a 30 minutos) y estimula la captación de agmatina en detrimento de la de putrescina y espermidina. 5. Estudio de Gm853, un nuevo parálogo de Odc y Azin2 en ratón. El análisis comparativo de la secuencia proteica de los distintos parálogos de ODC reveló la existencia de GM853, una nueva proteína homóloga de ODC y AZINs en ratón, que conserva todos los residuos relacionados con la actividad catalítica. Estudios con células transfectadas demostraron que GM853 no es un inhibidor de antizimas, ya que no evita la interacción entre ODC y AZ1. En cambio, es una proteína estable localizada fundamentalmente en el citosol y es capaz de formar homodímeros y homotetrámeros pero no heterodímeros con otros parálogos. GM853 presenta actividad enzimática, siendo la primera proteína descrita en mamíferos con actividad descarboxilasa de leucina. En ratón, GM853 se encuentra en el riñón y su expresión depende de los niveles de testosterona, predominando en el riñón de ratones machos. El producto de la descarboxilación de la leucina es la isopentilamina, una amina que es rápidamente eliminada a través de la orina.
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Caracterización de las células ganglionares de la retina melanopsínicas y estudio de la degeneración y neuroprotección de las células ganglionares de la retina en el roedor
(2014-03-13) Galindo Romero, Caridad; Agudo Barriuso, Marta; Vidal Sanz, Manuel; Villegas Pérez, María Paz; Facultad de Medicina
Objetivos Caracterizar la población de células ganglionares de la retina melanopsínicas (CGRm) en la rata adulta en relación con la población total de células ganglionares de la retina (CGR) y analizar su distribución espacial en la retina. Caracterizar si el Brn3a es un buen marcador de las CGR en ratones albino (Swiss) y pigmentado (C57BL/6). Analizar la curva temporal de muerte de las CGR de ratón después de la sección del nervio óptico (SNO), y evaluar el efecto neuroprotector del factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) sobre estas neuronas. Investigar la respuesta de las células de microglía fagocítica en las retinas axotomizadas y en las contralaterales a la lesión. Material y métodos La caracterización de las CGRm se llevó a cabo en 16 ratas albinas adultas Sprague-Dawley (SD). Para saber si las CGRm envían sus axones a través del nervio óptico (NO), se aplicó Fluorogold (FG) en el muñón del NO. Para conocer la proporción de CGRm que proyectaban a los colículos superiores (CS), región retinorrecipiente a la que proyectan el 98,4% de las CGRs en la rata, se aplicó FG en ambos CS. para saber si las CGRm expresan Brn3a y cuantificar automáticamente y comparar el número y distribución espacial de ambas poblaciones, se realizó la inmunodetección doble de melanopsina y Brn3a en retinas de animales intactos. Se utilizaron 158 ratones adultos pigmentados C57BL/6 y 34 albinos Swiss. Una semana antes de la SNO (a 0,5 mm del disco óptico), las CGR se trazaron retrógradamente con metanosulfonato de hidroxistilbamidina (OHSt), un análogo del FG. Para caracterizar el Brn3a como marcador de las CGR y su curso temporal de muerte tras SNO, los animales fueron sacrificados a diferentes intervalos de supervivencia tras la SNO (2, 5, 7, 9, 14 o 21 días). Como control se usaron animales intactos. Las retinas se disecaron en montajes globales y se incubaron con anticuerpos contra Brn3a. En un segundo grupo de experimentos se evaluó el efecto de una inyección intravítrea de BDNF (2,5 µg) o vehículo (PBS) en la población de CGR y de la microglía fagocítica. A tiempos crecientes tras la cirugía (3, 5, 7 y 14 días) se disecaron las retinas a plano y se inmunodetectó el Brn3a (CGR) e Iba1 (células de la microglía). Las CGR-OHSt+ y Brn3a+ se cuantificaron y se analizó la distribución espacial de las CGR-Brn3a+ construyendo mapas de isodensidad celular. Además, se cuantificaron las células de microglía fagocítica marcadas transcelularmente con OHSt e inmunodetectadas con Iba1 y se analizó su distribución espacial mediante mapas de vecinos. El mismo análisis de las CGR y las células de microglía se realizó en las retinas contralaterales a la SNO. Resultados En las retinas de rata en las que las CGR habían sido marcadas con FG aplicado en el MNO, se observó que el 99,05% de las CGR que expresan melanopsina se marcaban también con FG, por lo que estas neuronas proyectan sus axones a través del NO. Un 90,62% de las CGRm se encontraban marcadas con FG aplicado en los CS, por lo que estas células emiten proyecciones retinotectales. Tan sólo un 0,20% de las CGRm expresan Brn3a. La población total de CGRm fue de 2.046±48, lo cual supone un 2,62% de la población de CGR de rata adulta. Los mapas de vecinos revelaban una mayor densidad de CGRm en la periferia de la retina, y más concretamente en la región superotemporal. Esta distribución es complementaria a la distribución de la población de general CGR. En la retina de ratón, el Brn3a se expresa únicamente en las CGR y su expresión no se afecta por la SNO. En la retina de ratón pigmentado C57BL/6 y albino Swiss, el Brn3a se expresa en un 85,5% y 92,6% de las CGR-OHSt+, respectivamente. En ambas estirpes de ratones, los mapas de isodensidad revelan que la distribución de las CGR-Brn3a+ es muy similar a las CGR-OHSt+. En ambas cepas de ratón, la pérdida de CGR después de la SNO comienza a ser significativa con ambos marcadores a los 3 días después de la SNO y disminuye significativamente hasta los 9 días postlesión, momento en el que sobrevive un 15% de la población original Los mapas de isodensidad muestran que la muerte de CGR inducida por la SNO es difusa. En los grupos tratados con BDNF, la muerte se retrasa hasta los 5 días después de la SNO y la supervivencia de CGR es, a todos los tiempos post-lesión, significativamente mayor que al tratar con vehículo. Los mapas de isodensidad muestran que el BDNF retrasa la muerte de las CGR por toda la retina, no únicamente en la zona de la inyección. Conforme aumenta el tiempo después de la SNO, aumenta el número de células de microglía fagocítica, tanto en los grupos tratados con BDNF como en los tratados con vehículo, pero el número es menor en las retinas tratadas con BDNF. Los mapas de vecinos revelan que las células de microglía fagocítica aparecen a los 3 días de manera homogénea por toda la retina y que, conforme aumenta el tiempo post-SNO, aumenta el número de células microgliales que se distribuyen con un gradiente de densidad decreciente del centro a la periferia de la retina. Finalmente, en las retinas contralaterales a la SNO, se observa un aumento significativo del número de células de microglía fagocítica en comparación con las retinas control, aumento que es igual en los grupos tratados con BDNF o con vehículo. Estas células aparecen a los 3 días después de la SNO y su número y distribución se mantiene estable hasta los 14 días post-SNO. En cuanto a la población de CGR en estas retinas contralaterales a la SNO, el número de CGR es significativamente menor a los 21 días después de la SNO comparado con retinas control. SUMMARY Objectives To characterize the total numbers and spatial distribution of melanopsin retinal ganglion cells (mRGC) in the adult rat retina, in relation with the total population of retinal ganglion cells (RGC). To characterize whether Brn3a is a good marker for RGC in two mouse strains, an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) one. To analyze the temporal loss of RGC after optic nerve transaction (ONT), to assess the neuroprotective effect of BDNF in axotomized RGCs. To investigate the response of phagocytic microglial cells after ONT in the injured and contralateral to the lesion retinas. Material and methods Two months old albino Sprague-Dawley (SD) rats (n=16) were used to characterize the mRGC population. To investigate whether all retinal neurons immunodetected with melanopsin sent their axons through the optic nerve (ON), FG was applied in the ON stump. To assess the proportion of mRGC that project their axons to the superioir colliculi (SCi), the retinotectal area where 98.4% of the RGC project their axons in the rat, FG was applied onto both SCi. To assess whether mRGC express Brn3a and to quantify and compare the numbers and spatial distribution of both populations, Brn3a and melanopsin were double immunodetected in retinas from intact animals For the study in mouse, two months old mice were used (n= 158 pigmented C57BL/6 mice, and n= 34 albino Swiss mice). RGC were traced one week before ONT (at 0.5 mm from the optic disk), or euthanasia with hydroxystilbamidine methanesulfonate (OHSt, a FG analogue). To characterize Brn3a as a RGC marker and analyze the temporal loss of RGC after ONT, animals were sacrificed at increasing intervals post-ONT (2, 5, 7, 9, 14 or 21 days). As control, retinas from naive animals were used. Retinas were dissected as flat-mounts and immunodetected for Brn3a. In a second experimental group, the effect of an intravitreal injection of BDNF (2,5 µg) or vehicle (PBS) on RGC and phagocytic microglia was investigated. At increasing times post-surgery, ( 3, 5, 7, and 14 days) retinas were dissected as flatmounts, and Brn3a (RGC) and Iba1 (microglial cells) were double immunodetected. OHSt+RGC and Brn3a+RGC were quantified and the spatial distribution of Brn3a+RGC was assessed by isodensity maps. Phagocytic microglial cells transcellularly labelled with OHSt and Iba1+ were also quantified and their spatial distribution analyzed with neighbour maps. The same analyses were carried out in the contralateral to the lesion retinas. Results In rat retinas traced with FG from the ON, 99.05%, of the RGC that express melanopsin (mRGC) were traced. Thus, mRGC send their axons through the ON. When the tracer was applied to both SCi, 90.6% of the mRGC were traced, thus, most of the mRGC project to them. Finally, Brn3a and melanopsin were doubly immunodetected to assess whether ipRGCs express this transcription factor, and we found that only 0.20% of them were Brn3a+. In flat-mounted retinas, the total number of mRGC was 2,047±309, which amounts to a 2.6% of the total population of RGC. Neighbour maps disclosed that mRGC are placed preferentially in the retinal periphery and that their density is higher in the supero-temporal quadrant. This distribution is complementary to the general RGC population. In mouse retinas, Brn3a is only expressed by RGC and its expression does not change after ONT. In flat-mounted retinas of pigmented C57BL/6 and albino Swiss mice, Brn3a is expressed in 85.5% and 92.6% of the OHSt+RGC, respectively. In both mouse strains, isodensity maps reveal a similar distribution of Brn3a+RGC and OHSt+RGC. In mouse, RGC loss after ONT is first significant 3 days after ONT with both markers, OHSt and Brn3a. From 3 to 9 days post-ONT, the number of RGC decreases significantly. At 9 days, only 15% of the total population is still alive. Isodensity maps reveal that ONT induces a diffuse loss of RGC in the whole retina. In the experimental groups treated with BDNF, RGC death is delayed until 5 days after ONT, and the survival of RGC was higher than in the vehicle-treated groups at all time post-ONT. Isondensity maps showed that BDNF delays RGC death across the whole retina and not only in the localized area of the injection. In both experimental groups, phagocytic microglial cells appeared at 3 days after ONT and the number of these cells increased as the time post-lesion increased, although this response was significantly attenuated by BDNF administration. At 3 days, phagocytic microglial cells were distributed homogenously across the retina. As the time post-lesion increased, their density was higher in the centre than in the periphery of the retina. Finally, in the contralateral to the lesion retinas, there was a significant increase of phagocytic microglial cells compared to control retinas and this increease was the same in the BDNF and vehicle treated groups. These cells appear at 3 days post ONT and their number and distribution is stable up to 14 days post-ONT. Concerning the RGC population in the contralateral retinas, their number significantly decreased at 21 days after ONT, compared to control retinas.
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Caracterizacion en roedores adultos de la población de células ganglionares de retina melanopsínicas y estudio de la degeneración de las células ganglionares tras hipertensión ocular y neuroprotección
(2015-07-02) Valiente Soriano, Francisco Javier; Vidal Sanz, Manuel; Agudo Barriuso, Marta; Avilés Trigueros, Marcelino; Facultad de Medicina
Objetivos • Caracterizar la población de CGRm del ratón pigmentado y albino adulto. • Estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO en ratón pigmentado. • Estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO y su protección con BDNF en rata albina adulta. Material y métodos Para la realización de los experimentos se utilizaron ratones machos pigmentados y albinos adultos y ratas hembras adultas albinas. Las manipulaciones de los animales se realizaron siguiendo la normativa europea (Directiva 2010/63/UE) y nacional (RD 53/2013) sobre la protección de los animales utilizados para la experimentación y otros fines científicos. Para caracterizar la población de CGRm del ratón pigmentado y albino adulto, se inmunodetectaron secciones transversales de retina y retinas a plano con el anticuerpo contra la melanopsina, con el anticuerpo contra Brn3a y se contratiñeron los núcleos de todas las células de la retina con DAPI. Para estudiar la proyección de las CGRm, se aplicó en ambos CS o en el muñón del nervio óptico el trazador neuronal OHSt. Para estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO en ratón pigmentado, se caracterizó el modelo de HTO fotocoagulando con láser las venas perilimbares y epiesclerales del ratón. Para analizar el curso temporal de daño axonal y muerte de las CGR y las CGRm, las CGR fueron trazadas retrógradamente desde los CS con OHSt, las retinas se inmunodetectaron con Brn3a y melanopsina, y se analizaron a las 2 y 4 semanas. Para estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO y su protección con BDNF en rata albina adulta, se analizó el curso temporal de daño axonal y muerte de las CGR y CGRm tras HTO en retinas tratadas con BDNF o vehículo. Las CGR fueron trazadas retrógradamente desde los CS con FG, y las retinas se inmunodetectaron con Brn3a y se analizaron a 12 y 15 días tras la inducción de la HTO. Para el análisis estadístico, el test Kruskal-Wallis se utilizó cuando se compararon dos o más grupos y el test Mann-Whitney cuando se compararon dos grupos solamente. Las diferencias entre grupos se consideraron estadísticamente significativas para p<0.05. Resultados Los ratones pigmentados y albinos tienen un número similar de CGRm (1.021±109 CGRm pigmentado y 962±169 CGRm albino). En los ratones pigmentados las CGRm son más abundantes en la retina tempora y en los albinos están más localizadas en la retina superior. Ambos ratones también tienen CGRm desplazadas (CGRm-d) en la capa nuclear interna, que representan el 14% del total de CGRm en ratones pigmentados y el 5% en los albinos. El marcaje desde ambos CS muestra que el 98% (pigmentado) y el 97% (albino) de la población total de CGRm se marcan retrógradamente, mientras que el estudio de colocalización de melanopsina y Brn3a confirma que un porcentaje muy pequeño de CGRm expresa este factor de transcripción en ratones. En el estudio del marcaje retrógrado colocando OHSt en el muñón del nervio óptico demuestra que no todas las CGRm eran trazadas. Existía una subpoblación de CGRm-d (14% en pigmentados y 28% en albinos) y CGRm residentes en la zona ciliar marginal de la retina (20% en pigmentados y 24% en albinos) que no se trazaban desde el nervio óptico; por lo que estas células no envían el axón a través del nervio óptico y pueden ser consideradas interneuronas de la retina, quizá relacionadas con el reflejo pupilar intrínseco. En el estudio de la caracterización del modelo de hipertensión ocular en el ratón pigmentado observamos un aumento significativo de la presión intraocular desde las primeras 6 horas de la fotocoagulación láser hasta los 5 días. En ratón pigmentado, la HTO resulta en una pérdida difusa y/o sectorial de CGR trazadas con el trazador neuronal OHSt (CGR OHSt+) (50% a 2 semanas y 62% a 4 semanas). Sin embargo, a las 2 semanas aún se observa un 66% de CGR marcadas con Brn3a (CGR Brn3a+). Esto indica que sobreviven en la retina aproximadamente un 16% de CGR cuyo transporte axonal retrógrado está comprometido. Parte de estas CGR acaban muriendo y a las 4 semanas el número de CGR trazadas con OHSt e inmunodetectadas con Brn3a se iguala. La población de CGRm disminuyó aproximadamente al 59% a las 2 semanas y al 46% a las 4 semanas, valores similares a los de las CGR Brn3a+ para los mismos tiempos. La distribución topográfica de la pérdida de CGRm, aunque era mayor en la zona supero-temporal de retina, no era sectorial, sino difusa a lo largo de la retina y no se complementaba con la distribución de la pérdida del resto de CGR. En rata albina, la HTO resulta en una pérdida sectorial de las CGR FG+ (78 y 84% a los 12 y 15 días, respectivamente). El número de CGR Brn3a+ fue significativamente mayor para ambos tiempos de estudio, esto indica que una proporción considerable (≈21 - 26%) de CGR sobreviven en la retina con su transporte axonal retrógrado deteriorado. Las CGRm también presentaron una disminución significativa (50-51%) y esta pérdida, al igual que en ratón, fue difusa. La administración intravítrea de BDNF aumentó la supervivencia de las CGR Brn3a+ a 81 y 67% a los 12 y 15 días, respectivamente, pero no tuvo ningún efecto sobre las CGRm. D. Francisco Javier Valiente Soriano “Characterization in adult rodents of the melanopsin retinal ganglion cells population and study of the retinal ganglion cells degeneration after ocular hypertension and neuroprotection” SUMMARY Objetives • Characterization of the mRGC population of adult pigmented and albino mouse. • Study the RGC and mRGC degeneration after OHT in the pigmented mouse. • Study the RGC and mRGC degeneration after OHT and their protection with BDNF in adult albino rat. Material and methods To perform the experiments we used adult pigmented mice, adult albino mice and female adult albino rats. Manipulations of animals were carried out according to the European (Directive 2010/63/UE) and National (RD 53/2013) regulations existing on the protection of animals used for experimentation and other scientific purposes. To study the characterization of the mRGC population of adult pigmented and albino mouse, cross sections of retina and whole mounts were immunoreacted with anti-melanopsin antibody, with anti-Brn3a antibody and stained with DAPI. To study the projection of the mRGC, the neuronal tracer OHSt was applied in both SC or in the optic nerve. To study the RGC and mRGC degeneration after OHT in the pigmented mouse, ocular hypertension model was performed by laser photocoagulation of the perilimbar and epiescleral veins of the experimental eye. To study the time course of the axonal damage and RGC and mRGC death caused, the RGC were traced from the SC with OHSt and retinas were immunodetected with Brn3a and melanopsin and analyzed at 2 and 4 weeks. To study the RGC and mRGC degeneration after OHT and their protection with BDNF in adult albino rat, we analyzed the time course of the axonal damage and RGC and mRGC death after OHT in BDNF or vehicle-treated retinas, RGC were retrogradely traced from the SC with the retrogradely transported tracer fluorogold (FG), retinas were immunodetected with Brn3a and analyzed at 12 and 15 days after the induction of OHT. For statistical analysis, Kruskal–Wallis test was used when comparing more than two groups and Mann–Whitney when comparing two groups only. Differences were considered significant when p<0.05. Results Both pigmented and albino mice have a similar number of mRGC (1,021±109 mRGC in pigmented, 962±169 mRGC in albino). The mRGC are most abundant in the temporal retina in pigmented mice, and in dorsal retina in albino mice. Both mice also have displaced mRGC (d-mRGC) located in the inner nuclear layer representing 14% of the total population of mRGC in pigmented mice and 5% in albino mice. The 98% (pigmented) or 97% (albino) of the total population of mRGC were marked retrogradely from both SC, while the colocalization study of melanopsin and Brn3a confirms that a very small percentage of this transcription factor was expressed by mice mRGC. A surprising fact in the study of retrograde labeling with OHSt applied on the ON stump was that not all the mRGC were traced. A subpopulation of d-mRGC (14% in pigmented and 28% in albino) and mRGC located in the ciliary marginal zone of the retina (20% pigmented and 24% in albino) that were not traced from the optic nerve, that means that these cells do not send an axon into the optic nerve and can be considered an interneuron of the retina, perhaps related to the intrinsic pupil reflex. In the study of the characterization of ocular hypertension model in pigmented mouse, a significant increase of the intraocular pressure (IOP) was observed from 6 hours of laser photocoagulation up to 5 days. OHT results in a sectorial and/or diffuse loss of RGC traced with OHSt (OHSt+RGC) (50% at 2 weeks and 62% at 4 weeks). However, at 2 weeks, 66% of RGC, which were immunodetected with Brn3a (Brn3a+RGC) were still present. This indicates that at this time around 16% of RGC survive in the retina with their retrograde axonal transport committed. These RGC, however, died at 4 weeks and the number of traced OHSt+RGC and immunodetected Brn3a+RGC was equal. The mRGC population decreased to 59% at 2 weeks and to 46% at 4 weeks. These percentages of loss were similar to the Brn3a+RGC at the same time points. The loss of the mRGC was higher in the supero-temporal area of the retina. However, this loss was not sectorial, but was diffuse along the retina, and did not parallel the distribution of loss of the rest of RGC. In albino rat, OHT resulted in a sectorial loss of FG+RGC (78-84% at 12 and 15 days, respectively). The number of Brn3a+RGC was significantly higher in both times of study, which indicates that a significant proportion (≈21-26%) of RGC survive in the retina with their impaired retrograde axonal transport. The mRGC also presented a significant reduction of approximately 50-51%, and this loss, as in mice, was diffuse. The intravitreal administration of BDNF increased the Brn3a+RGC survival to 81% and 67% at 12 and 15 days, respectively, but had no effect on the mRGC. The study of the inner retinal vasculature did not show any abnormality that could explain the sectorial loss of RGC.
Open Access
Curso temporal de la degeneración axonal, muerte de células ganglionares de la retina y activación de la caspasa 3 en retinas de roedor adulto tras lesión axonal
(2016-03-21) Sánchez-Migallón Carreras, María del Cielo; Agudo Barriuso, Marta; Vidal Sanz, Manuel; Facultad de Medicina
Objetivos - Investigar si la expresión de Brn3a tras axotomía del nervio óptico desaparece porque las CGR mueren, o porque se ha producido una alteración celular como consecuencia de la lesión axonal, independientemente de que las CGR sigan vivas. - Analizar y comparar el curso temporal de pérdida de las CGR y la activación de caspasa 3 después de corte (SNO) o aplastamiento del nervio óptico (ApNO) en ratón. Evaluar la supervivencia de las CGR y la activación de la caspasa 3 tras la administración del factor trófico derivado de cerebro (BDNF) o del inhibidor de la caspasa 3 (ZDEVD_fmk). - Analizar, en ratón, la supervivencia de las CGR que expresan Brn3a o melanopsina a largo plazo después de SNO o ApNO y estudiar la degeneración de los axones intrarretinianos de las CGR. Material y Métodos Animales: Para la realización de estos objetivos se han utilizado ratas hembra adultas y albinas (Sprague-Dawley de 180-200 gr de peso) y ratones machos, adultos y albinos (Swiss de 30-32 gr de peso). Los animales han sido tratados según la normativa europea (Directiva 2010/63/UE) y nacional (RD53/2013) vigente sobre la protección de los animales que son utilizados para la experimentación y otros fines científicos. Todas las manipulaciones y procedimientos experimentales que implicaban dolor, sufrimiento o lesión fueron realizadas bajo anestesia. Los animales se anestesiaron intraperitonealmente (i.p.) con una mezcla de Ketamina (70 mg/kg de peso corporal) y Xilacina (10 mg/kg de peso corporal). La eutanasia se realizo con una sobredosis letal de una solución de pentobarbital sódico al 20% inyectado i.p. (0.5-1 ml). Lesión del nervio óptico: Se realizó la sección (SNO, en rata y ratón) o el aplastamiento (ApNO, en ratón) del nervio óptico izquierdo. Ambas cirugías se realizaron a 0.5 mm de la cabeza del nervio óptico. Las retinas se analizaron a tiempos crecientes tras estas cirugías (de 1 a 90 días, n=4-8 por cirugía, tiempo y especie). Como control se usaron retinas de animales intactos o las retinas derechas, contralaterales a la lesión. Inyección intravítrea: Los productos administrados fueron: BDNF (5 μg en rata, 2,5 μg en ratón), el inhibidor irreversible de caspasa 3 ZDEVD_fmk (125 ng/inyección, en ratón), y los correspondientes vehículos. En general, se realizó un solo tratamiento justo después de la lesión de nervio óptico. En el caso del ZDEVD_fmk se hicieron grupos adicionales de animales en los que se administro a los 2 días de la lesión o se hicieron múltiples inyecciones. Para descartar posible toxicidad del inhibidor, éste se examinó en un grupo sin lesión de nervio óptico. Las retinas fueron analizadas a distintos tiempos tras el tratamiento (de 3 a 14 días, n=4-6/ grupo). Procesado y disección de las retinas: Para la realización de Western Blotting, las retinas se disecaron en fresco, y se congelaron inmediatamente. Para los estudios anatómicos, los animales se perfundieron con paraformaldehído y las retinas fijadas se disecaron a plano. Inmunodetección: Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: i/ cabra anti-Brn3a para detectar la población general de CGR, ii/ conejo anti-melanopsina, para identificar la subpoblación de CGR m+; iii/ conejo anti-caspasa 3 activa, para detectar células en apoptosis y, iv/ ratón anti-pNFH (clon RT97) para detectar los axones intrarretinianos de las CGR. La detección secundaria se efectuó con anticuerpos acoplados a los fluoróforos Alexa 488 o 594. Adquisición de imágenes: Todas las retinas montadas a plano se examinaron y fotografiaron en el microscopio de fluorescencia asociado a una cámara CCD y equipado con una platina motorizada controlada por un sistema de análisis de imagen: Image-Pro Plus® (IPP 5.1; Media Cybernetics). Para hacer reconstrucciones de las retinas completas se capturaron imágenes individuales de forma secuencial y no solapada comprendiendo toda la superficie de la retina y posteriormente fueron unidas para formar el fotomontaje (154/140 imágenes individuales por retina). Cuantificación: El número total de CGR trazadas en retinas control y de CGR Brn3a+ en retinas control o lesionadas se cuantificó automáticamente con el programa Image-Pro Plus. En retinas lesionadas el número de CGR trazadas se estimó a partir de contajes manuales de 12 muestras de la retina porque la presencia de células de microglía transcelularmente marcadas con el trazador impide el contaje automático.Las CGR m+, CGR a-caspasa 3+ y los somas de CGR pNFH+ se puntearon sobre el fotomontaje y su número se cuantificó automáticamente usando el programa Image-Pro Plus. Topografía: Para conocer la distribución topográfica de las CGR FG+ y CGR Brn3a+ se realizaron mapas de isodensidad. La distribución de las CGR m+, CGR-a-caspasa 3+ y somas de CGR pNFH+ se visualizó usando el método del vecino más próximo (mapas de vecinos). Estos mapas se realizaron con el programa Sigma Plot (SigmaPlot®11, Systat Software). Estadística: El análisis estadístico y de regresión se llevo a cabo con los programas SigmaStat (Systat Software) o GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). Las diferencias se consideraron significativas cuando p<0,05. Resultados Investigar si la expresión de Brn3a tras axotomía desaparece porque las CGR mueren, o porque se ha producido una alteración celular como consecuencia de la lesión axonal, independientemente de que las CGR sigan vivas. Para realizar este objetivo se usó como modelo la rata albina. Se realizaron dos grupos experimentales. Una semana antes de la lesión de nervio óptico se trazaron las CGR desde los CS con el trazador FG. Pasada esta semana, se seccionó el nervio óptico (SNO) izquierdo de todos los animales. En un grupo justo después de la SNO se administró 5 µg de BDNF intravitrealmente en la retina izquierda, y en el otro se administró el mismo volumen de vehículo. Las retinas fueron analizadas a 7, 9 y 12 días después de la lesión (n=6-8/ tiempo y tratamiento). Las retinas derechas fueron usadas como control. En ambos grupos, la supervivencia de las CGR disminuye con el tiempo post-lesión pero lo hace con mayor rapidez en el grupo tratado con vehículo. De hecho, el número de CGR fue significativamente mayor en el grupo tratado con BDNF comparado con el tratado con vehículo, a todos los tiempos (7, 9 y 12 días), y esto se observa con ambos marcadores, FG y Brn3a. Es más, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en el número de CGR Brn3a+ o FG+ a ninguno de los tiempos analizados, dentro de un mismo grupo. Estos datos indican que la expresión de Brn3a se mantiene en las CGR lesionadas siempre y cuando estén vivas. Finalmente, en los mapas de isodensidad de las CGR Brn3a+ se observo que la pérdida de CGR es homogénea en la retina y que una única inyección intravítrea de BNDF protege las CGR a lo largo de toda la retina. Analizar y comparar el curso temporal de pérdida de las CGR y la activación de caspasa 3 después de corte (SNO) o aplastamiento del nervio óptico (ApNO) en ratón. Evaluar la supervivencia de las CGR y la activación de la caspasa 3 tras la administración de BDNF o ZDEVD_fmk. Se utilizó como modelo el ratón adulto albino. Se realizaron varios grupos: i/ SNO, o ApNO; ii/ SNO + tratamiento con BDNF, iii/ SNO + tratamiento con el inhibidor de la caspasa 3, ZDEVD_fmk. Las retinas fueron analizadas de 1 a 10 días después de la lesión, y en todas se cuantifico el número de CGR Brn3a+ y de CGR que expresan caspasa 3 activa (CGR a-caspasa 3+). La pérdida temporal de CGR y la aparición de CGR a-caspasa 3+ es la misma después de SNO o ApNO. La pérdida de CGR se produce en dos fases exponenciales, una rápida y una lenta. Durante los primeros 7 días se pierde un 65% de CGR, desde el día 8 al 10 la pérdida es más lenta con un muerte adicional del 4% de las CGR. La aparición de CGR a-caspasa 3+ es Gaussiana, alcanzando su pico máximo a los 4 días de la lesión, disminuyendo a partir de entonces. La expresión de Brn3a disminuye cuando las CGR empiezan a expresar a-caspasa 3, y esto se revierte por el tratamiento con BDNF o ZDEVD_fmk. La tasa de rescate de las CGR de ambos tratamientos es la misma y ambos retrasan la pérdida de CGR en un día. Un tratamiento tardío con ZDEVD_fmk no rescata CGR y varias inyecciones (a 0, 2 y 4 días tras la lesión) no son más eficaces que una sola en el momento de la lesión. Tanto la pérdida de CGR como la aparición de CGR a-caspasa 3+ es uniforme por toda la retina. Analizar, en ratón, la supervivencia de las CGR que expresan Brn3a o melanopsina a largo plazo después de SNO o ApNO y estudiar la degeneración de los axones intrarretinianos de las CGR. Para llevar a cabo este objetivo, se utilizó como modelo el ratón adulto albino. Un grupo fue sometido a SNO y otro a ApNO. Las retinas se analizaron a tiempos crecientes tras cada lesión (de 3 a 90 días) y se analizaron las CGR Brn3a+, CGR m+, CGR pNFH+ y los axones de las CGR intrarretinianos. El número medio de CGR Brn3a+ y de CGR m+ en las retinas intactas y en las contralaterales a la lesión no fue diferente, indicando que la axotomía unilateral no causa muerte de CGR en las retinas no lesionadas. En cambio, el número de somas CGR pNFH+ en las retinas contralaterales fue estadísticamente mayor que en las retinas intactas. En retinas lesionadas la pérdida significativa de CGR ocurre a los 3 días y progresa exponencialmente hasta los 15 días momento en el cual sobrevive un 20% de CGR Brn3a+ y un 26% de CGR m+. Desde los 15 a los 90 días, el porcentaje de CGR m+ se mantiene constante, sin embargo dentro de la población Brn3a+ hay un descenso gradual, de manera que sólo 5% de CGR Brn3a+ sobreviven a este último tiempo. Las CGR pNFH+ se observan a partir del día 3, y su número aumenta progresivamente hasta los 5 días, cuando alcanzan su máximo. A partir del día 5 empieza a decrecer gradualmente el número de somas pNFH+, de manera similar a la activación de la caspasa 3. La degeneración axonal es más lenta que la pérdida de CGR. De hecho, la pérdida de axones se observa a los 14 días, momento en el que sólo sobreviven 22% de CGR. Sin embargo los síntomas de degeneración axonal comienzan a ser visibles ya a los 3 días tras la axotomía (CGR pNFH+). Finalmente, no se observó diferencia en ninguno de los parámetros analizados entre la sección y el aplastamiento del nervio óptico. Conclusiones 1. La expresión de Brn3a se mantiene en CGR vivas, independientemente de la lesión axonal, por lo que el Brn3a es un buen marcador de CGR tanto para estudiar su pérdida como para analizar el efecto neuroprotector de distintas terapias. 2. En rata y en ratón, la muerte de CGR tras axotomía es homogénea y afecta a toda la retina. 3. En ratón, el aplastamiento y la sección del nervio óptico inducen el mismo curso temporal de pérdida de CGR, activación de caspasa 3, aparición de somas pNFH+ y degeneración de los axones intrarretinianos. 4. La pérdida de CGR es significativa al tercer día tras la lesión y progresa en dos fases una rápida hasta los 7 días y una lenta desde los 8 días en adelante, por lo que la ventana terapéutica es muy estrecha (estos datos son clave para planear estrategias de neuroprotección). 5. El BDNF y el inhibidor de la caspasa 3 ZDEVD_fmk producen la misma tasa de rescate de las CGR tras la axotomía. Ambos retrasan el comienzo de la degeneración en 1 día. 6. Un tratamiento tardío con ZDEVD_fmk no rescata las CGR y varias inyecciones no son más eficaces que una sola en el momento de la lesión. 7. La axotomía a largo plazo no causa muerte de CGR en la retina contralateral a la lesión en el ratón albino. 8. La respuesta de la población general de CGR (Brn3a+) y la subpoblación que expresa melanopsina a la axotomía es diferente, siendo el porcentaje de supervivencia de esta última significativamente mayor. 9. La expresión de pNFH en los somas de las CGR es un evento temprano de degeneración neuronal que sigue un curso similar al de la activación de caspasa 3. 10. En ratón, como en rata, la pérdida axonal es más lenta que la pérdida de los somas neuronales. SUMMARY Objectives - To investigate whether the expression of Brn3a after optic nerve axotomy is lost because the RGCs die or because of the axonal injury, independently of the RGCs being still alive. - To analyze and compare the temporal course of RGC loss and the activation of caspase 3 after optic nerve transection (ONT) or crush (ONC) in mice. To evaluate the survival of RGC and activation of caspase 3 after administration of brain derived neurotrophic factor (BDNF) or a caspase 3 inhibitor (ZDEVD_fmk). - To analyze, in mice, the long term survival of the general RGC population (Brn3a+RGCs) and the melanopsin expressing subpopulation (m+RGCs) to ONT or ONC. To study the degeneration of RGC intraretinal axons. Material and methods Animals: In this thesis, we have used adult, albino female rats (Sprague-Dawley, 180-200 g, body weight) and adult, albino male mice (Swiss, 30-32 g body weight). All experimental procedures were carried out in accordance with the Association for Research in Vision and Ophthalmology and the European Unión Guidelines for the Use of Animals in Research and were approved by the Ethical and Animal Studies Committee of the University of Murcia (Spain). Animals subjected to surgery were anaesthetized with a mixture of xylazine (10 mg/kg body weight; ) and ketamine (70 mg/kg body weight) administered intraperitoneally (i.p.). All animals were sacrificed with an i.p. overdose of 20% pentobarbital (0.5-1 ml). Optic nerve lesion. In all instances the injury was performed to the left optic nerve. Optic nerve transection (ONT, in rats and mice) or optic nerve crush (ONC, in mice) were done at 0.5mm from the optic head. Retinas were analyzed at increasing time points after the injuries (from 1 to 90 days, n=4-8 per injury, time point and species). As control, we used retinas from intact animals or the right retinas, contralateral to the injured ones. Intravitreal injection. The following products were administered: BDNF (5 μg in rat, 2.5 μg in mice), the irreversible caspase 3 inhibitor, ZDEVD_fmk (125 ng/injection, in mice) and the corresponding vehicles. As a rule, a single injection was done just after the optic nerve injury. Regarding ZDEVD_fmk several additional groups were prepared, to which the injection was performed 2 days after the lesion, or they received multiple doses. To discard the possible toxicity of this inhibitor, this was tested in intact retinas. Retinas were analyzed at increasing time points after the treatment (from 3 to 14 days, n=4-6/group). Retinal processing and dissection: For western blot analysis, retinas were fresh dissected an immediately frozen. For anatomical studies, animals were perfused with paraformaldehyde and the fixed retinas dissected as flat mounts. Immunodetection: Primary antibodies: i/ goat anti-Brn3a to identify the general RGC population; ii/ rabbit anti-melanopsin, to identify the m+RGC subpopulation; iii/ rabbit anti-cleaved caspase 3 (active caspase 3) to detect cells in apoptosis; and iv/ mouse anti-pNFH (RT-97 clone) to identify the intraretinal RGC axons. Secondary detection was done with the appropriate antibodies coupled to Alexa 488 or Alexa 594 fluorophores. Image acquisition: All retinas were photographed under an epifluorescence microscope equipped with a computer-driven motorized stage controlled by Image-Pro Plus (IPP 5.1; Media Cybernetics). Retinal multiframe acquisitions were photographed in a raster-scan pattern in which frames were captured side-by-side with no gap or overlap between them with a 20x objective. Single frames were focused manually before acquisition of the image. All frames from each retina (140-154 acquisitions/retina) were then fed into the IPP image analysis program, to tile them and reconstruct the retinal photomontages. Quantification: The total number of traced RGCs in control retinas, and Brn3a+RGCs in control and injured retinas was automatically quantified with the Image-Pro Plus program using a computerized method developed in our lab. In the injured retinas, the number of traced-RGCs was inferred from manual counting of 12 retinal samples, since the presence of transcellularly labelled microglial cells impairs the automated routine. To achieve this, a new semi-automated macro was validated in control retinas. m+RGCs, c-caspase 3+RGCs, and the somas of pNFH+RGCs were dotted on the retinal photomontage and their number automatically quantified using the Image-Pro Plus program. Topography: To determine the spatial distribution of FG+RGCs and Brn3a+RGCs isodensity maps were used. The distribution of m+RGCs, c-caspase 3+RGCs and pNFH+RGCs was visualized using neighbor maps. These maps were constructed with SigmaPlot (SigmaPlot®11, Systat Software). Statistics: Statistical and regression analyses were carried out using SigmaStat (Systat Software) or GraphPad Prism 5 (GraphPad Software) programs. Differences were considered significant when p<0.05. Results To investigate whether the expression of Brn3a after optic nerve axotomy is lost because the RGCs die or because of the axonal injury, independently of the RGCs being still alive. For this objective the animal model was the albino rat. Two experimental groups were done. A week before the optic nerve lesion, RGCs were traced from the SC with FG. After this week the left optic nerve of all animals was transected (ONT). In the first group a single injection of 5 µg of BDNF was administered right after the ONT, the second group received the same volume of vehicle. Retinas were analyzed at 2, 9 and 12 days after the lesion (n=6-8/ time point and treatment. Right retinas were used as controls. In both groups the number of surviving RGCs decreases with the time post-lesion, but this decrease is quicker in the vehicle-treated group. In fact, the number of RGCs was significantly higher in the BDNF treated group at all time points (7, 9 and 12 days), and this is observed with both markers, FG and Brn3a. Furthermore, there were not significant differences in the number of Brn3a+RGCs or FG+RGCs at neither of the analyzed time points within the same group. These data indicate that the expression of Brn3a is maintained in injured RGCs as long as they are alive. Finally, Brn3a+RGC isodensity maps show that the loss of RGCs is homogeneous across the retina and that a single intravitreal injection of BDNF protects the entire retinal surface. To analyze and compare the temporal course of RGC loss and the activation of caspase 3 after optic nerve transection (ONT) or crush (ONC) in mice. To evaluate the survival of RGCs and activation of caspase 3 after administration of brain derived neurotrophic factor (BDNF) or a caspase 3 inhibitor (ZDEVD_fmk). For this objective the animal model was the albino mice. Several groups were made: i/ ONT or ONC; ii/ ONT + BDNF; iii/ ONT + the caspase 3 inhibitor ZDEVD_fmk. Retinas were analyzed from 1 to 7 days after the lesion, and in all of them the total number of Brn3a+RGCs and c-casp3+RGCs was quantified. The temporal loss of RGCs and the appearance of c-casp3+RGCs is the same after both lesions. RGC loss occurs in two exponential phases, one quick and one slow. During the first seven days, 65% of the RGCs die, from the eighth to the tenth day RGC death is slower causing an addition loss of 4%. The appearance of c-casp3+RGCs is Gaussian, peaking at 4 days after the lesion and decreasing thereafter. The expression of Brn3a decreases when the expression of c-caspase 3 increases, and this is reverted by BDNF or ZDEVD_fmk treatment. The RGC rescue rate in both treatments is the same, and both delay RGC loss by one day. The delayed treatment with ZDEVD_fmk does not rescue RGCs, and several doses (at 0, 2 and 4 days after the lesion) are not better than a single injection at the same of the injury. Both, the loss of RGCs and the appearance of apoptotic (c-caspase 3+) RGCs is uniform across the retina. To analyze, in mice, the long term survival of the general RGCs population (Brn3a+RGC) and the melanopsin expressing subpopulation (m+RGC) to ONT or ONC. To study the degeneration of RGC intraretinal axons. For this objective the animal model was the albino mice. A group of animals received ONT and the other ONC. Retinas were dissected at increasing times after each lesion (from 3 to 90 days) and Brn3a+RGCs, m+RGCs, pNFH+RGCs and the RGC intraretinal axons were identified. The mean number of Brn3a+RGCs and m+RGCs in contralateral to the injured retinas did not differ from intact retinas, indicating that unilateral axotomy does not cause RGC death in the uninjured retina. However, the number of pNFH+RGC somas in the contralateral retinas was significantly higher than in intact retinas. In the injured retinas, RGC loss is first significant at day 3, and progresses exponentially till day 15, when 20% and 26% of Brn3a+RGCs and m+RGCs survive, respectively. From 15 to 90 days, the percent of surviving m+RGCs is constant, however within the Brn3a population there is a gradual decrease and so just 5% of them survive at 90 days. pNFH+RGC somas appear already at day 3 after the lesion and their number increases progressively till 5 days, when if peaks. Thereafter, their number decreases gradually, in a similar course as the appearance of c-caspase3+RGCs. Axonal degeneration is slower than the loss of RGCs, in fact axonal loss is observed at day 14, when only 22% of RGCs survive. However, the symptoms of axonal degeneration are visible already at 3 days after the axotomy (pNFH+RGCs). Finally, there were no differences in any of the analyzed parameters between ONC and ONT. Conclusions 1. Brn3a expression is maintained in alive RGCs independently of being injured. Thus, Brn3a is a good RGC marker to study the loss and to analyze the neuroprotective effect of different therapies. 2. In rats and mice, RGC death after axotomy is homogeneous and affects the whole retina. 3. In mice, ONT and ONC induce the same temporal course of RGC death, activation of caspase 3, appearance of RGC somas pNFH+ and degeneration of intraretinal axons. 4. RGC loss is significant 3 days after the lesion, and progresses in two phases, one quick until the seventh day, and one slow from the eighth day onwards, therefore the therapeutic window is very narrow. These data are essential to plan neuroprotective strategies. 5. Both, BDNF and the caspase 3 inhibitor ZDEVD_fmk induce the same RGC rescue rate after axotomy. Both delay the beginning of the degeneration by 1 day. 6. A delayed administration of ZDEVD_fmk does not rescue RGCs and several injections are not better than a single one at the moment of the lesion. La axotomía a largo plazo no causa muerte de CGR en la retina contralateral a la lesión en el ratón albino. 7. The response of the general RGC population (Brn3a+) and the melanopsin expressing subpopulation is different, being the survival percent of the latter significantly higher. 8. The expression of pNFH in the RGC somas is an early marker of neuronal degeneration and follows a similar trend to the activation of caspase 3. 9. In mice, as in rats, axonal loss is slower than the loss of neuronal somas.
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Efecto de la melatonina y de HA/β-TCP/C sobre la pulpa dental de molares de rata
(2015-01-09) Guerrero Gironés, Julia; Ortiz Ruiz, Antonio José; Alcaina Lorente, Mª Antonia; Facultad de Medicina
OBJETIVOS La melatonina juega un papel esencial en la regulación del crecimiento óseo. El efecto de la melatonina sobre los odontoblastos podría ser similar a su acción sobre los osteoblastos. La hidroxiapatita (HA) y el fosfato beta-tricálcico (β-TCP) son biocerámicas usadas como sustitutos óseos que, unidas a colágeno (C) como soporte, tienen unas cualidades osteoconductoras satisfactorias. El objetivo de nuestro estudio es evaluar la respuesta de la pulpa de molares de rata a la melatonina y a la mezcla HA/β-TCP/C cuando se usan como agentes para la realización de protecciones pulpares directas y comparar sus efectos sobre la pulpa dental con el producido por el MTA. Además, queremos evaluar la acción antioxidante sistémica de la melatonina administrada por vía oral, y su influencia sobre el efecto que el MTA y la melatonina tienen sobre la pulpa dental cuando se usan como agentes para la realización de protecciones pulpares directas en molares de rata. METODOLOGÍA Se realizaron protecciones pulpares directas en los molares superiores de 28 ratas Sprague Dawley. Los grupos de estudio fueron: MTA 30 días, Melatonina 30 días, MTA + Melatonina administrada por vía oral (v.o.) 30 días; Melatonina + Melatonina v.o. 30 días, MTA 60 días, Melatonina 60 días, HA/β-TCP/C 30 días. En los grupos MTA+ Melatonina v.o. 30 días y Melatonina + Melatonina v.o. 30 días, se añadió melatonina en el agua de bebida que los animales bebieron ad líbitum (10 mg / 100 ml). Después del período de estudio, 30 ó 60 días según el grupo, los animales fueron sacrificados y se les extrajo 5 ml de sangre, los riñones y el hígado con el fin de evaluar el estrés oxidativo por medio de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS). Los fragmentos de maxilar que contenían los molares de estudio se prepararon para la evaluación histológica. A partir de estas muestras, se determinó el grado de inflamación pulpar, el grado de necrosis pulpar, la presencia de puente dentinario y dentina reparativa en la cámara pulpar, la presencia y la regularidad de la capa odontoblástica y la presencia de fibrosis pulpar. RESULTADOS No se observaron diferencias significativas entre los diferentes tratamientos en cuanto a grado de inflamación (p=0,024), vitalidad pulpar (p=0,61) y fibrosis (p=0,194). Para la variable puente dentinario y dentina reparativa hubo diferencias significativas (p=0,002): el grupo MTA 30 días se asoció a presencia y el grupo HA/β-TCP/C 30 días se asoció a ausencia de puente dentinario y dentina reparativa. Para la variable capa odontoblástica también hubo diferencias significativas entre los grupos (p=0,002): el grupo MTA 30 días se asoció a la presencia de una capa odontoblástica regular, el grupo MTA + Melatonina v.o. 30 días se asoció a la presencia de capa odontoblástica ya sea regular o irregular, los grupos Melatonina 60 días y HA/β-TCP/C 30 días se asociaron significativamente a la ausencia de una capa odontoblástica regular. En el análisis del estrés oxidativo no se detectaron diferencias significativas entre los distintos grupos: plasma (p=0.799), riñón (P=0.130) e hígado (p=0.724). CONCLUSIONES Los efectos sobre la pulpa dental de la melatonina y HA/β-TCP/C usados como materiales de recubrimiento pulpar son similares a los del MTA cuando valoramos el grado de inflamación, la vitalidad pulpar y la presencia de fibrosis pulpar. El consumo de melatonina por vía oral no añade ningún efecto histológico al producido por el MTA y la melatonina aplicados directamente sobre la pulpa dental. El nivel de estrés oxidativo en plasma, riñón e hígado no se modifican en ninguno de los grupos por el consumo de melatonina en el agua de bebida. ABSTRACT OBJETIVE Melatonin plays an essential role in the regulation of bone growth. The actions that melatonin exert on odontoblasts may be similar to action on osteoblasts. Hydroxyapatite (HA) and beta-tricalcium phosphate (β-TCP) are bioceramics used as bone substitutes, which together with collagen (C) as support, have satisfactory osteoconductive qualities. The aim of this research was to evaluate pulp response to melatonin and to mixture HA/β-TCP/C used for direct pulp capping and to evaluate the antioxidant effect of melatonin administered orally and its influence on dental pulp. METHODS Direct pulp capping was performed on the upper molars of 28 Sprague-Dawley rats. The study groups were: MTA 30 days; Melatonin 30 days; MTA + Melatonin taken orally 30 days; Melatonin + Melatonin taken orally 30 days; MTA 60 days; Melatonin 60 days;.HA/β-TCP/C 30 days. In the groups MTA + Melatonin taken orally 30 days and Melatonin + Melatonin taken orally 30 days, the animals drank water dosed with melatonin ad libitum (10 mg/100 ml). After 30 or 60 days depend of the group, the animals were sacrificed and 5 ml of blood, the kidneys and liver were extracted in order to evaluate oxidative stress by means of thiobarbituric acid reactive substances testing (TBARS), and fragments of the maxilla containing the study molars were prepared for histological evaluation. The degree of pulp inflammation, the degree of pulp necrosis, the presence of reparative dentin and dentin bridging the pulp chamber, the presence and regularity of the odontoblastic layer and the presence of pulp fibrosis were evaluated from these samples. RESULTS No significant differences were found between the study groups for the histological variables degree of pulp inflammation (p=0,024), degree of pulp necrosis (p=0,61) and presence of pulp fibrosis (p=0,194). There were significant differences for the histological variable presence of reparative dentin and dentin bridging the pulp chamber (p=0,002); group MTA 30 days was associated to presence and group HA/β-TCP/C 30 days was associated to ausence of reparative dentin and dentin bridging. There were significant differences for the variable presence and regularity of the odontoblastic layer between groups (p=0,002); group MTA 30 days was associated to regular odontoblastic layer; group MTA+Melatonin taken orally 30 days was significantly associated to odontoblastic layer regular or irregular; groups Melatonin 60 days and HA/β-TCP/C 30 days were associated to ausence of regular odontoblastic layer. In oxidative stress analysis no significant differences were found between the study groups: blood (p=0.799), kidney (P=0.130) and liver (p=0.724). CONCLUSION The effect of melatonin and HA/β-TCP/C on pulp is similar to that of MTA to the degree of pulp inflammation, the degree of pulp necrosis and the present of pulp fibrosis. Oral administration of melatonin did not modify the local effects of MTA or of melatonin on dental pulp or reduce basal level oxidative stress.
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Efecto del envejecimiento y de la exposición a fotoperiodo corto en el epitelio seminífero de hámster ( "Mesocricetus auratus"), proliferación y apoptosis, vías moleculares de la apoptosis / Eva Morales Bartolomé ; dirección Luis Miguel Pastor García, Adelina Zuasti Elizondo y Concepción Ferrer Cazorla.
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Biología Celular,, 2004) Morales Bartolomé, Eva
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Efecto radioprotector del licopeno, curcumina, hidroxitirosol y melatonina sobre glándula parótida de ratas
(2016-10-20) Valle Rodríguez, Ekaitz Antoni; López Jornet, María Pía; Gómez García, Francisco; Facultad de Medicina
INTRODUCCIÓN La radioterapia constituye hoy en día un pilar importante en el tratamiento oncológico. El efecto de la irradiación puede provocar efectos no deseados sobre tejidos sanos. La radiación ionizante en las glándulas salivales produce efectos inflamatorios y degenerativos en el parénquima de las glándulas salivales, especialmente en las células acinares serosas, provocando una disminución de la tasa de secreción salival y consecuentemente problemas como infecciones orales, caries dentales, y dificultades para comer. Es un reto para la ciencia paliar estos efectos mediante sustancias radioprotectoras. OBJETIVOS El objetivo general de esta tesis es la evaluación del efecto radioprotector del licopeno, curcumina, hidroxitirosol y melatonina en las glándulas salivales parotideas de ratas Sprague Dawley a dosis única de 20Gy de radiación. Se han analizado variables histopatológicas en las glándulas parótidas como la necrosis celular, pérdida de estructura acinar, daño de conductos y vacuolización y también valores histomorfométricos como el área y perímetro de los acinos en cada uno de los grupos de estudio. MATERIAL Y MÉTODOS Se han utilizado 58 parotidas de 30 ratas Sprague Dawley (se perdieron 2 muestras del grupo control durante el procesado) divididas aleatoriamente en 6 grupos de estudio: control (n=8), licopeno (n=10), curcumina (n=10), hidroxitirosol (n=10), melatonina (n=10) y DMSO (n=10). Las diferentes sustancias fueron administradas vía peritoneal 24 horas antes de la irradiación (20Gy) y las ratas fueron sacrificadas 24 horas después de la irradiación. Las muestras fueron fijadas con Hematoxilina-Eosina y observadas bajo microscopio óptico a 40x. RESULTADOS En cuanto a las variables histopatológicas: la necrosis celular (p=0,008) y la pérdida de estructura acinar (p=0,020), es significativamente menor en los grupos de las ratas radioprotegidas, no habiendo diferencias entre los diferentes radioprotectores. En el daño de conductos (p=0,001), es significativamente menor en los grupos de las ratas radioprotegidas siendo la melatonina la que obtuvo resultados significativamente mejores con respecto a la curcumina y el licopeno. En cuanto a la vacuolización (p=0,047), el grupo del DMSO presentó un menor grado que el resto de grupos a estudio, no habiendo diferencias entre ellos. En cuanto a variables histomorfométricas, área y perímetro de los acinos, podemos decir que la melatonina, la curcumina y el hidroxitirosol tienen un mayor área y perímetro de forma significativa (p<0,001) con respecto al grupo control, licopeno y DMSO por lo que se puede deducir que a mayor área y perímetro, menor afectación del acino. CONCLUSIONES En nuestro estudio hemos observado que el grupo de ratas control (no radioprotegidas) ofrecían de forma significativa peores resultados en todas las variables a estudio con respecto a al menos uno de los radioprotectores estudiados. INTRODUCTION Radiotherapy is an important pillar in cancer treatment nowadays. The effect of irradiation may cause unwanted effects on healthy tissues. Ionizing radiation in the salivary glands results in inflammatory and degenerative effects in the parenchyma of the salivary glands, particularly in serous acinar cells, producing a decrease in the rate of salivary secretion and thus, further issues such as oral infections, dental cavities, and difficulty eating. It is a challenge for the science to relieve these effects by means of radio protective substances. TARGET The general aim of this thesis is the evaluation of the radio protective effect that lycopene, curcumin, hydroxytyrosol and melatonin produce in the parotid salivary glands of Sprague Dawley rats to the only dose of 20Gy of radiation. There were analysed histopathological variables in the parotid glands as the cellular necrosis, loss of acinar structure, damage of ducts and vacuolation as well as histomorphometric values as the area and perimeter of the acinus on each of the study groups. MATERIALS AND METHODOLOGY There were used 58 parotid glands from 30 Sprague Dawley rats (2 samples of the control group got lost during the process), which were randomly sorted in 6 groups of study: control (n=8), lycopene (n=10), curcumin (n=10), hydroxytyrosol (n=10), melatonin (n=10) and DMSO (n=10). The different substances were administered through peritoneal way 24 hours before the irradiation (20Gy) and the rats were sacrificed 24 hours after the irradiation. The samples were tinted with Haematoxylin-Eosin and observed under optical microscope to 40x. RESULTS In terms of the histopathological variables: the cellular necrosis (p=0,008) and the acinar structure´s loss (p=0,020), both are significantly less in those groups where rats received radiological protection with no differences between the substances used. With regards to ducts´ damage (p=0,001), this is considerably lower in the groups with treated rats resulting the melatonin the substance getting notably better results rather than curcumin and lycopene. As for the vacuolation (p=0,047), the DMSO group showed up with a lower level than the remaining study groups, which, in fact, did not unveil differences between them. Regarding the histomorphometric values, area and acinus perimeter, it can be stated that melatonin, curcumin and and hydroxytyrosol have a significant larger area and perimeter (p <0,001) compared to the control, lycopene and DMSO groups, therefore it can be concluded that the larger area and perimeter are, the lesser the affectation to the acinus is. OUTCOME After the research, it was noticed that the “control group” of rats (with no protection) were showing significant worse results on every variable in the survey with regards to -at least- one of the proposed substances.
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Efectos de la astaxantina en el fotoenvejecimiento cutáneo inducido en ratones SKH1/CRL por radiación UV
(2014-09-22) Ruiz Sánchez, Virtudes; Martínez Díaz, F.; Departamento de Oftalmología, Optometría, Otorrinolaringología y Anatomía Patológica
El fotoenvejecimiento es un tema de enorme interés socio-sanitario (Kawada, 2011) al ser un proceso patológico común Su manejo clínico y terapéutico implica un alto presupuesto sanitario (Yaar, 2007; Jemal, 2011; Siegel, 2012). Los países desarrollados invierten sumas millonarias en la investigación de sustancias que eviten o retrasen sus efectos (Gil Ortega,2014). De ahí el interés del desarrollo de modelos experimentales para su estudio, así como el de nuevas medidas de fotoprotección. El primer objetivo de nuestro trabajo correspondió al establecimiento de un modelo de fotoenvejecimiento cutáneo en ratones SKH-1 mediante exposición crónica a RUV; el segundo fue evaluar los posibles efectos protectores de la Astaxantina. Utilizamos 60 ratones SKH1/CRL, expuestos a RUV (98,6% UVA y 1,4% UVB) / 60 minutos / sesión / 3 veces a la semana / 80 sesiones, con un total de 1.688 J/cm2 por animal. Los ratones se dividieron en dos grupos (N= 30): El Control sólo recibió RUV y el segundo, RUV más Astaxantina / oral / 0,05 mg / animal / dia. Dado que en la mayoría de los animales de este grupo no se originaron lesiones neoplásicas al final del experimento (80 sesiones), seguimos aplicando hasta un total de 113 sesiones (2.384,3 J/cm2) a 10 ratones,. Los animales expuestos exclusivamente a RUV Grupo Control presentaron las alteraciones características descritas en el fotoenvejecimiento (100% de carcinomas escamosos), por lo que lo consideramos un modelo experimental idóneo para el estudio de estas patologías. No obstante, encontramos diferencias entre las lesiones de los animales tratados con Astaxantina, respecto a las del Control: el eritema se hacía fijo con aspecto reticulado, 15-16 sesiones mas tarde que en el Control; la presentación del marcado patrón geométrico de la piel (8-10 sesiones); arrugas (15-16 sesiones); engrosamiento cutáneo-lesiones queratósicas (10-12 sesiones) y de las lesiones eritemato-erosivas (5-6 sesiones). Las diferencias más destacables fueron en las lesiones tumorales, ya que solo las presentaron 10 animales del grupo tratado. De los 20 que recibieron 80 sesiones, solo 2 presentaron tumores; y de los 10 que recibieron 113 sesiones, se presentaron solo en 6 a partir de la sesión 100 y en 2 tras la 113. Todas las neoplasias correspondían a carcinomas de células escamosas. Microscópicamente, también encontramos diferencias en las lesiones precancerosas: la displasia en: el 60% de los animales tras la sesión 80 y en el 80% tras la 113; el carcinoma “in situ” en el 25% y el 75% respectivamente, mientras que en los animales del grupo Control se observaban ambos en el 100% de los animales. En el estudio inmunohistoquímico, constatamos un incremento significativo de la tasa de proliferación celular en los tumores del grupo control respecto a los tratados. La expresión de MMP-9 resultó más alta en los tumores de los animales tratados que en los del control. Sin embargo, el inhibidor de metaloproteinasas TIMP-1, se expresó de forma más intensa en el estroma de los tumores de los animales tratados que en los controles, sugiriendo que el tratamiento con astaxantina podría inhibir la progresión tumoral, mediante la inducción de la síntesis de inhibidores de metaloproteinasas en el estroma tumoral. ABSTRACT Photoaging, a common pathological process, is of enormous socio-sanitary interest (Kawada, 2011) and its clinical and therapeutic treatment is expensive (Yaar, 2007; Jemal, 2011; Siegel, 2012). Developed countries invest enormous sums of money in research into substances to prevent or delay the effects of the process (Gil Ortega, 2014) – hence the interest in developing experimental models for its study and new protection methods. The first objective of our study was to establish a model of cutaneous photoaging in SKH-1 mice chronically exposed to UVR, and the second to evaluate the possible protective effects of Astaxanthin. Sixty SKH1/CRL mice were exposed to 80 sessions of UVR (98.6% UVA and 1.4% UVB) for 60 minutos/session, 3 times per week (total of 1,688 J/cm2 per animal). The mice were divided into two groups (N= 30): the control group, which only received UVR, and a second group, which received UVR and Astaxanthin adminsitered orally at 0.05 mg / animal / day. Since most of the animals of the second group showed no neoplastic lesions at the end of the 80 sessions, the treatment was continued in 10 mice to reach 113 sessions (2,384,3 J/cm2). The control group animals showed the alterations characteristic of photoaging (100% squamous carcinomas), so that the experimental model can be considered ideal for studying such pathologies. However, there were differences in the lesions treated with Astaxanthin compared with the control group: erythema became permanent and showed a reticulated pattern 15-16 sessions later than in the control group; a marked geometric pattern of the skin (8-10 sessions later); swelling and/of queratósicas cutáneo-lesiones (10-12 sessions later); wrinkling (15-16 sessions) and eritemato-erosivas lesions (5-6 sessions later). The most pronounced differences concerned the tumoral lesions, which only appeared in 10 animals of the treated group. Of the 20 animals that received 80 sessions, only 2 showed tumours, while, of the 10 animals that received 113 sessions, tumour growth was evident in 6 after 100 sessions and another 2 after 113 sessions. All the neoplasias corresponded to squamous cell carcinomas. Microscopically, there were also differences in the precancerous lesions observed: dysplasia in 60% of animals after 80 sessions and in 80% after 113 sessions. “In situ” carcinomas were observed in 25 and 75%, respectively of the treated animals. In the control group, on the other hand, both were observed in 100% of the animals. An immunohistochemical study pointed to a significantly higher cell proliferation rate in the tumours of the control group, while MMP-9 expression was higher in the tumours of the treated group. Metaloproteinase TIMP-1 inhibitor expression was greater in the stroma of the tumours of the treated animals, suggesting that treatment with astaxanthin may inhibit tumour progression by inducing the synthesis of inhibitors of metaloproteinases in the tumoral stroma.
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Efectos de los aceites de almendras dulces y de crisálida del gusano de la seda sobre el fotoenvejecimiento cutáneo inducido en ratones SKH1/CRL por radiación UV
(2014-04-28) Gil Ortega, Ana María; Vicente Ortega, Vicente; Gómez García, Francisco José; Sánchez-Pedreño Guillén, Paloma; Departamento de Oftalmología, Optometría, Otorrinolaringología y Anatomía Patológica
La piel es el órgano más extenso del organismo y puede sufrir, además del envejecimiento cronológico, el denominado fotoenvejecimiento o envejecimiento cutáneo patológico. Está caracterizado por un envejecimiento cutáneo más extenso y sobre todo, de mayor gravedad, pues engloba la fotocarcinogénesis o presentación de cánceres cutáneos. Desde la Antigüedad, el hombre tuvo conciencia de la importancia del Sol en su vida, pero también de sus efectos indeseables. En la actualidad las sociedades de los países desarrollados invierten sumas millonarias en la investigación de sustancias que eviten o retrasen los efectos del envejecimiento, no sólo por el culto a la belleza, sino por el gran coste económico que tiene la asistencia sanitaria de las lesiones. En los últimos años, los aceites esenciales han recibido gran atención dada su capacidad antioxidante, que podría interferir en los mecanismos de fotoenvejecimiento, evitando la formación de radicales libres y potenciando el subsistema inmunológico cutáneo. Por otro lado, a las dificultades metodológicas que supone la lenta evolución de los tumores, se suman las limitaciones éticas del desarrollo de modelos experimentales en humanos. Por esta razón, el primero de los objetivos de nuestro trabajo fue el establecimiento de un modelo de fotoenvejecimiento cutáneo en ratones SKH-1, mediante la exposición crónica a Radiación Ultravioleta (RUV), para en el segundo objetivo de nuestro estudio, evaluar las propiedades de dos aceites, el de almendras dulces y el de la crisálida del gusano de la seda, como posibles fotoprotectores. Para la realización del estudio, utilizamos 60 ratones SKH1/CRL, que se sometieron a radiación ultravioleta, 60 minutos por sesión, tres veces por semana, durante un total de 80 sesiones, con 1.688 J/cm2 de energía total absorbida por cada animal. Los ratones se dividieron en tres grupos. El primero (Control) sólo recibió RUV y los otros dos fueron tratados tópicamente, previamente a la irradiación, con aceite de almendras dulces (Grupo II) y con aceite de la crisálida del gusano de seda (Grupo III). Todos los animales expuestos a las RUV presentaron las alteraciones características del fotoenvejecimiento y fotocarcinogénesis cutánea, por lo que consideramos este modelo experimental idóneo para el estudio de esta patología, ya que la exposición crónica a las radiaciones provocó todo el espectro de lesiones propias del fotoenvejecimiento, si la exposición era prolongada (entre 65 y 80 sesiones), además de tratarse de un modelo fácilmente reproducible y de bajo coste. No obstante, en nuestro estudio observamos diferencias significativas entre los animales tratados con el aceite de la crisálida del gusano de seda (Grupo III) respecto a los de los otros dos grupos. En los ratones del grupo III se observa un retraso en la presentación de las lesiones cutáneas (6-9 semanas), con respecto a los otros grupos y hubo dos animales sin lesiones tumorales al final del experimento. Además, el área media de las lesiones era menor en el grupo III un 59,14% respecto al grupo control (reducción del 40,86%); el grupo tratado con aceite de almendras dulces, tan sólo redujo el área media en un 10%. Esto sugiere las propiedades fotoprotectoras del aceite de crisálida del gusano de seda, probablemente debidas a la acción de la sericina que contiene, que es un potente antioxidante. Este retraso en la presentación de lesiones neoplásicas y su menor volumen fue confirmado por el estudio inmunohistoquímico, respecto a la metaloproteinasa 9 (MMPs-9) y los inhibidores TIMP. The skin is the largest organ of the body and may, in addition to chronological aging, suffer some disease called photoaging. It is characterized by a large aging of the skin and above all, what is more dangerous, photocarcinogenesis or presentation of skin cancers . Since antiquity, men became aware of the importance of the sun in our life, but also of its undesirable effects. At present, a lot of companies of developed countries invest a large amount of money in researching, looking for substances that prevent or delay the effects of aging, not only for beauty, but also by the great economic cost of health care. In recent years, essential oils have received great attention due to its antioxidant capacity, which may interfere with the mechanisms of photoaging, preventing the formation of free radicals and boosting the skin 's immune subsystem. Furthermore, to the methodological difficulties of the slow evolution of tumors, ethical constraints on development of experimental models in humans are added . Therefore, the first objective of our work was to establish a model of cutaneous photoaging in SKH -1 mice by chronic exposure to Ultraviolet Radiation (UVR). The second objetive of our study was to evaluate the properties of two oils, sweet almond and chrysalis of silkworm, as possible photoprotective . For the study, we used 60 mice SKH1/CRL, that received ultraviolet radiation, 60 minutes per session, three times per week, for a total of 80 sessions , with 1,688 J/cm2 of total energy absorbed by each animal. The mice were divided into three groups. The first (control) received only UVR and the other two were treated topically prior to irradiation, with sweet almond oil (Group II ) and oil of silkworm chrysalis (Group III). All animals exposed to UVR showed the characteristic alterations of cutaneous photoaging and photocarcinogenesis, so consider this experimental model as ideal for the study of this disease, since chronic exposure to radiation caused the entire spectrum of lesions characteristic of photoaging, if the exposure was prolonged (65 to 80 sessions), besides being an easily reproducible and not expensive model . However, in our study we observed significant differences between animals treated with oil of chrysalis silkworm (Group III) compared to the other two groups. In Group III, mice observed a delay in the presentation of skin lesions (6-9 weeks), with respect to the other groups, and there were three animals without tumor lesions at the end of the experiment. In addition, the mean area of lesions was lower in group III (59.14 %) than in the control group (40.86 % reduction), the group treated with sweet almond oil only reduced the area by 10 %. This suggests the photoprotective properties of oil of silkworm chrysalis, probably due to the action containing sericin, which is a potent antioxidant. This delay in the presentation of neoplastic lesions and their smaller area was confirmed by immunohistochemical study, regarding metalloproteinase 9 ( MMP -9) and TIMP inhibitors.
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Encarrilamiento y masking en el nocturnalismo de un roedor diurno (Octodon degus) = Role of entrainment and masking on the nocturnalism of a diurnal rodent (Octodon degus)
(Universidad de Murcia, 2010-12-20) Vivanco Jodar, Pablo; Madrid Pérez, Juan Antonio; Rol de Lama, María de los Ángeles; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Fisiología
El Octodon degus es un roedor endémico de Chile que ha sido caracterizado como diurno tanto en su medio natural como en condiciones de laboratorio. Sin embargo, se ha descrito que algunos individuos invierten su actividad a nocturna cuando se les permite hacer ejercicio en una rueda giratoria instalada en su jaula. Esta tesis doctoral tiene como objetivos: entender este proceso de nocturnalismo, caracterizar los mecanismos circadianos implicados y definir el papel que juega el marcapasos central circadiano. Los resultados apuntan a que el nocturnalismo en los degus se basa en una respuesta termorreguladora de evitación temporal frente a altas temperaturas diurnas. Esta actividad nocturna la consiguen mediante encarrilamiento estable del reloj circadiano pero también mediante la inhibición de la actividad locomotora ante la presencia de luz (masking). Además, la secreción endógena de melatonina, o su administración exógena, como el propio marcapasos circadiano no parecen estar implicados en esta respuesta. Abstract: Octodon degus is an endemic Chilean rodent which has been characterized as diurnal in both natural habitat and laboratory conditions. However, a switch from diurnal to nocturnal activity has been described in some individuals when they are allowed to exercise in a wheel placed in their cage. The aims of this doctoral thesis are: understand this process of nocturnalism, characterize the circadian mechanisms involved in it and define the role of the circadian pacemaker. The results indicate that degus’ nocturnalism is based on a thermorregulatory response of temporal avoidance against high diurnal temperature. This nocturnal activity is achieved by steady-entrainment of the central pacemaker but also by locomotor activity suppression induced by the presence of the light (masking). Moreover, both the endogenous secretion of melatonin, or its exogenous administration, and the circadian pacemaker seem not to be implicated in this response.
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Estudio de la respuesta de proteínas de fase aguda en la capibara ("Hydrochaerus hydrochaeris) / Mariane Feser; directores, José Joaquín Cerón Madrigal, Fernando Tecles Vicente, Silvia Martínez Subiela.
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Medicina y Cirugía Animal,, 2007) Feser, Mariane
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Estudio de migración de neuronas Pax6+ en el tálamo del pollo y del ratón
(2015-07-02) Domenech Hita, Jose Manuel; Puelles López, Luis; Departamento de Anatomía Humana y Psicobiología
OBJETIVO GENERAL El objetivo general de esta tesis es la caracterización de la migración protagonizada por un conjunto de neuronas Pax6+ en el tálamo del pollo y del ratón y su análisis comparativo. MATERIALES Y MÉTODOS Se utilizaron embriones de pollo (HH28 – HH38) para analizar mediante técnicas de inmunohistoquímica y de hibridación in situ con sondas de mRNA del gen Pax6 en secciones de vibratomo. También se llevaron a cabo marcajes mediante BDA y posterior cultivo organotípico. Las preparaciones fueron escaneadas y analizadas. Las imágenes de secciones de cerebros de ratón procesadas mediante hibridación in situ para el gen Pax6 de estadios embrionarios y postnatales fueron obtenidas del atlas de desarrollo del ratón (Allen Brain Atlas). RESULTADOS Y CONCLUSIONES Las observaciones obtenidas confirman la existencia de una migración neuronal tardía que se origina en la región retrohabenular, en el techo posterior del prosómero 2. Las células migratorias Pax6+ comienzan a visualizarse claramente en la región retrohabenular en el estadio HH31, terminando la migración aparentemente en HH37. Se desplazan desde su origen laterorrostralmente en la zona fronteriza entre la región habenular y el tálamo propiamente dicho. En el caso del pollo, este avance es más marcado y alcanza, a través del núcleo superficial microcelular, regiones cercanas a la frontera intertalámica, incorporándose escasas células de esta migración a la región habenular lateral. En ratón, en cambio, la migración penetra más importantemente en la región habenular lateral donde acaba integrándose en el subnúcleo parvocelular de la división lateral del núcleo habenular lateral y a penas se observan otras células fuera de esa zona habenular. En el pollo se observa un segundo origen celular Pax6+ a continuación del área retrohabenular, ya en la zona pretectal precomisural. Desde este origen existe una pequeña migración que alcanza aparentemente las inmediaciones del núcleo parvocelular de la comisura posterior. El resultado de los marcajes con BDA in vitro en el estadio HH31, de producción inicial de estas células, corroboró la existencia de un movimiento migratorio desde este origen en la región retrohabenular hacia la zona de destino descrita mediante hibridación in situ de Pax6, tanto en el caso de la migración talámica como la pretectal. Desde el punto de vista de la anatomía comparada, se concluye que los fenómenos retrohabenulares migratorios observados en el pollo y en el ratón coinciden en su cronología embriológica, ya que aparecen en estadios comparables y en ambos casos figura como diana la región habenular lateral. Si bien en el pollo aparecen células que parecen invadir zonas no habenulares cercanas cabe preguntarse si no cabría incluir dichas regiones en la zona habenular. En el caso del ratón las células migradas componen una subpoblación menor del área habenular lateral que forma el subnúcleo parvocelular de la división lateral del núcleo habenular lateral. STUDY OF THE MIGRATION OF PAX6+ NEURONS IN THE CHICK AND MOUSE THALAMUS GENERAL AIM The overall objective of this thesis is to characterize the migration of a population of Pax6+ neurons in the chick and mouse thalamus and its comparative analysis. METHODS Chick embryos (HH28 – HH38) were used to analyze by immunohistochemistry and in situ hybridization with Pax6 mRNA probes in vibratome sections. Labelling with BDA were also carried out and subsequent organotypic culture. The preparations were scanned and analyzed. The images of mouse brain sections processed by in situ hybridization for the Pax6 gene in embryonic and postnatal stages were obtained from the atlas of mouse development (Allen Brain Atlas). RESULTS AND CONCLUSIONS The observations confirm the existence of a late neuronal migration originated in the retrohabenular region, in the posterior roof of prosomere 2. Migratory Pax6+ cells become clearly visible in the retrohabenular region at HH31, finishing the migration apparently at HH37. They progress from their origin latero-rostrally through the habenular-thalamic border. This advance is more pronounced in the chick, reaching through the superficial microcellular nucleus regions near the intrathalamic border, joining few of these migrating cells the lateral habenular region. In contrast, the migration in mouse penetrates mainly in the lateral habenular region where it integrates the parvocellular subnucleus of the lateral division of the lateral habenular nucleus and scarce cells are found out of the habenular region. A second Pax6+ cellular origin is found in chick, adjacent to the retrohabenular area, in the precommisural pretectal region. From this origin a small migration takes place apparently to the surroundings of the parvocellular nucleus of the posterior commisure. The results of the in vitro BDA labelling at HH31, initial production stage of these cells, confirmed the existence of a migratory movement from this origin in the retrohabenular region to the target area described by Pax6 in situ hybridization, for both thalamic and pretectal migrations. From a comparative anatomical point of view, the retrohabenular migratory phenomena observed in chick and mouse concur in their embryological chronology, since they appear at comparable stages and the target is the lateral habenular region in both cases. While in chick there appear cells invading nearby non habenular regions, one might wonder whether these regions should be included in the habenular zone. In the case of mouse, the migrated cells shape a minor subpopulation of the lateral habenular area that forms the parvocellular part of the lateral division of the lateral habenular nucleus.
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Estudio del efecto de polifenoles vegetales sobre un modelo de fotoenvejecimiento en ratones SKH1
(2014-11-25) Belmar Ruiz, María José; Gómez García, Francisco José; García Carrillo, Nuria; Facultad de Medicina
La piel sufre, con el paso del tiempo, el envejecimiento cronológico o intrínseco, pero además, debido a la exposición prolongada a la radiación solar, puede verse afectada por el denominado fotoenvejecimiento o envejecimiento extrínseco. Este fenómeno está caracterizado por lesiones cutáneas más extensas y, sobre todo, de mayor gravedad, pues engloba también la presentación de cánceres cutáneos (fotocarcinogénesis). Diversas sustancias polifenólicas de origen botánico, por su capacidad antioxidante, podrían mediar en los mecanismos del fotoenvejecimiento, evitando la formación de radicales libres, el daño al material genético, y en última instancia en la prevención del cáncer cutáneo. Existen limitaciones éticas del desarrollo de modelos experimentales en humanos. Por este motivo, el primero de los objetivos de nuestro trabajo fue el establecimiento de un modelo de fotoenvejecimiento cutáneo en ratones SKH-1 mediante la exposición crónica a la radiación ultravioleta. El segundo objetivo de nuestro estudio, fue evaluar las propiedades de los extractos de granada, fresno y uva, como posibles fotoprotectores. Para la realización de este estudio utilizamos 48 ratones hembras SKH-1/CRL, que se sometieron a radiación ultravioleta, 60 minutos por sesión, tres veces por semana, durante un total de 75 sesiones, con una energía total absorbida por animal, de 1.688 J/cm 2. Los ratones se dividieron en cuatro grupos. El primero sólo recibió RUV (control) y los otros tres eran tratados oralmente con los antioxidantes en el pienso: Extracto de granada (grupo I), fresno (grupo II) y uva (grupo III). Todos los animales expuestos a las RUV presentaron alteraciones características del fotoenvejecimiento y fotocarcinogénesis cutáneos, por lo que consideramos el modelo experimental como óptimo para el estudio de esta patología, pues la exposición crónica a las radiaciones provoca el espectro de lesiones propias del fotoenvejecimiento, si la exposición es prolongada (entre 65-80 sesiones) y además se trata de un modelo fácilmente reproducible y de bajo coste. De los extractos estudiados, el que mostró mejores propiedades sobre el fotoenvejecimiento y la fotocarcinogénesis, fue el E. de granada, con una reducción de las áreas lesionales de un 97,56% respecto al grupo control, de un 90% en la incidencia de carcinomas invasores y de un 38,67% en la tasa de proliferación tumoral (PCNA). Además, el tiempo de presentación de las lesiones fue de los más tardíos entre los polifenoles estudiados. Debido a los prometedores resultados descritos en la bibliografía consultada y los obtenidos por nosotros mismos, consideramos útil realizar ensayos clínicos con los agentes estudiados, que permitan conocer el posible efecto preventivo frente al cáncer cutáneo en humanos, ya sea mediante su incorporación a cremas solares o a la dieta, y su posible papel como agentes coadyuvantes en el tratamiento convencional de esta patología. ABSTRACT With time, the skin suffers chronological or intrinsic aging, but if exposed for long periods to solar radiation, it will also be affected by the process known as photoaging or extrinsic aging. The phenomenon is accompanied by extensive cutaneous lesions and may, more importantly, give rise to skin cancers (photocarcinogenesis). Several polyphenolic substances of vegetal origin are known to have antioxidant effects and may mediate in photoaging mechanisms, preventing the formation of free radicals and damage to genetic material, and, ultimately, contributing to the prevention of skin cancer. There are ethical limitations to the development of experimental models in humans, for which reason our first aim was to establish a model of cutaneous photoaging in SKH-1 mice chronically exposed to ultraviolet radiation. The second aim was to evaluate the possible photoprotective properties of pomegranate, ash and grape extracts. For this, 48 female SKH-1/CRL mice were submitted to 75 sessions of ultraviolet radiation (three, 60 minute sessions per week, total energy absorbed per animal 1,688 J/cm2). The mice were divided into four groups, the first of which (control) was exposed to the above UVR sessions, while the other three groups, besides being exposed to UVR, were given the following extracts as antioxidants in their feed: pomegranate (group 1), ash (group 2) and grape (group 3). All the animals exposed only to UVR showed the alterations characteristic of photoaging so that the experimental model can be considered ideal for studying this pathology if exposure is sufficiently long (65-80 sessions) and especially as it is easily reproducible and inexpensive Of the extracts studied, pomegranate showed the best anti-photoaging and anti-photocarcinogenesis properties, reducing the areas affected by lesions by 97.56% compared with the control, the incidence of invasive carcinomas by 90% and the tumoral proliferation rate (PCNA) by 38.7%. In addition, all the lesions appeared later than when the other polyphenols were provided. Due to the promising results described in the literature consulted and those obtained in our study, we consider that clinical trials are justifiable using the agents studied. These would throw light on the possible preventative role they might have in human skin cancer, whether through inclusion in sunscreens or in the diet, and also the part they could play as adjuvants in the conventional treatment of this pathology.
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Funcionalidad de las poliaminas sobre el desarrollo del sistema inmune y la microbiota intestinal durante el periodo de lactancia: influencia del procesado de las fórmulas infantiles en el contenido en poliaminas y en la liberación de péptidos durante la digestión: ensayo de funcionalidad empleando como modelo ratones BALB/cOlaHsd lactantes
(2014-12-15) Gómez Gallego, Carlos; Ros Berruezo, Gaspar Francisco; Periago Castón, María Jesús; Collado Amores, Mª Carmen; Facultad de Veterinaria
Introducción: La lactancia materna es la forma de alimentación recomendada, siempre que sea posible, al menos durante los primeros seis meses de vida. Si esto no es posible, existen fórmulas artificiales con las que poder cubrir los requerimientos nutricionales de los recién nacidos. La exposición a determinados factores ambientales, incluidos factores nutricionales, durante el periodo intrauterino y los meses posteriores al nacimiento podría determinar la susceptibilidad a determinadas enfermedades en etapas posteriores de la vida. Se ha demostrado una menor susceptibilidad a determinadas enfermedades en niños alimentados con leche materna frente a aquellos que lo han sido con fórmulas infantiles, incluyendo menor riesgo de enfermedades gastrointestinales y respiratorias, y menor riesgo de obesidad y diabetes en la edad adulta. El hecho de que estos cambios se prolonguen hasta la edad adulta sugiere que la exposición temprana a factores nutricionales podría estar asociada a cambios epigenéticos. Las poliaminas son policationes orgánicos presentes en todas las células de mamíferos. Su interés es debido a su función, siendo esenciales para la proliferación y la diferenciación celular. Su presencia ha sido demostrada en la leche humana siendo las poliaminas más abundantes la espermidina y la espermina. Objetivos: El objetivo de la presente Tesis ha sido evaluar si la adición de poliaminas tras el procesado podría mejorar el desarrollo del sistema inmune y producir un patrón de colonización microbiana similar al obtenido mediante lactancia materna utilizando como modelo ratones BALB/cOlaHsd. Métodos: 60 crías de ratón de 14 días de edad fueron distribuidas aleatoriamente en cuatro grupos: 1) ratones sin destetar con lactancia normal; 2) ratones destetados precozmente alimentados con fórmulas infantiles; y 3) tres grupos distintos de ratones destetados precozmente alimentado con una fórmula infantil suplementada con concentraciones crecientes de poliaminas. Se analizó la microbiota intestinal mediante fluorescent in situ hybridization (FISH) y detección por citometría de flujo y PCR cuantitativa. Además, se analizaron poblaciones linfocitarias mediante citometría de flujo y la expresión de genes relacionados con la activación, proliferación y diferenciación de linfocitos T y B. Resultados y Conclusiones: En relación a la microbiota, nuestros resultado muestran, por primera vez que nosotros sepamos, que la suplementación de las fórmulas infantiles con poliaminas modula las poblaciones bacterianas de Bacteroides-Prevotella, Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. y bacterias similares a Akkermansia, incluida A. muciniphila, hasta niveles parecidos a los del grupo alimentado con lactancia normal en un efecto que parece ser dependiente de la dosis de poliaminas administrada. De forma similar a lo que ocurría con la microbiota intestinal, la suplementación de la fórmula infantil con poliaminas induce cambios en las poblaciones linfocitarias y la expresión génica, incrementándose el porcentaje de linfocitos B en sangre, y linfocitos CD4+, CD8+ y B en bazo, en una proporción dependiente de la dosis de poliaminas; y reduce las diferencias en la expresión de los genes Cd1d1, Cd40, Hdac5, Hdac7, Clcf1 y Tlr4 cuando se compara con lactancia normal. Los resultados obtenidos de este estudio ayudan a comprender la compleja interrelación entre la nutrición, el sistema inmune y la microbiota intestinal durante el periodo de lactancia. Los resultados obtenidos deberían ser estudiados en humanos, ya que de demostrarse efectos similares, la suplementación de las fórmulas infantiles con poliaminas podría contribuir a un mejor desarrollo, con un efecto beneficioso sobre la salud, de niños alimentados con fórmulas. ABSTRACT Introduction: As has been recommended by a large number of health or breastfeeding organisations, whenever feasible, infants should be fully breastfed for at least six months. If full breastfeeding is not possible, safe and suitable infant formula should be used. According to the early programming theory, environmental exposure, including nutritional exposure during the intrauterine stage and during the perinatal months of life, might make children more susceptible to some diseases later in life. Indeed, it has been demonstrated that infants who have been breastfed have a lower susceptibility to some diseases than infants who were fed with artificial manufactured formulas. The fact that these changes are extended into adult life suggests than early exposure to nutritional factors are associated with epigenetic changes. Polyamines are organic polycations that are present in all mammalian cells. They have significant interest due to their reported biological roles in eukaryotic cells, because they are essential to cell proliferation and differentiation. Their presence has been demonstrated in human milk as being the most abundant spermidine and spermine polyamines. Objectives: the main objective of the present thesis was to evaluate whether the addition of polyamines after processing could improve immune system development and the microbial colonization pattern in a similar way that breast feeding do. Methods: A total of 60 mice pups (14-days old) were randomly assigned to four-day intervention groups as follows: 1) breastfed unweaned pups; 2) early weaned pups fed with infant formula; and 3) three different groups of early weaned pups fed with infant formula supplemented with increasing levels of polyamines. After a four-day diet intervention, samples were obtained. Microbiota composition was analysed by fluorescent in situ hybridization (FISH) coupled with flow cytometry detection, and by quantitative PCR targeted at 14 bacteria genus and species. The lymphocyte populations in the blood, spleen and mesenteric lymph nodes were analysed by fluorescence activated cell sorting (FACS); moreover, the expression of genes encoding T-cell and B-cell activation, proliferation and differentiation, as well as Toll-like receptors (TLRs), in the small intestinal tissues was assessed using a 96-well RT-PCR arrays. Results and Conclusions: Regarding the microbiota composition, independently of the analysis methods, our results showed, for the first time to our knowledge, that supplementation of infant formula with polyamines modulates Bacteroides-Prevotella, Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. and Akkermansia-like bacteria groups, including A. muciniphila, to levels closely related to normal lactation group, in a dose-dependent manner and immune system parameters in infant formula feeding compared to mice with normal lactation. Similar to microbiota, the supplementation of manufactured infant formula in polyamines induces changes in lymphocyte populations and gene expression, increasing the percentage of B-cells in blood and CD4+, CD8+ and B-cells in the spleen in a dose-dependent manner, and it reduces differences in the expression of Cd1d1, Cd40, Hdac5, Hdac7, Clcf1 and Tlr4 genes compared with normal lactation. The results obtained from this study highlight the complex interplay between nutrition, the immune system and microbial colonization patterns during lactation. Such an effect requires further investigation in human infants because supplementation of an infant formula in polyamines might contribute to healthy gastrointestinal tract development in children fed with commercial formula.
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Identificación y caracterización de la población total de las células ganglionares de la retina en rata : nuevos métodos de trazado, expresión de melanopsina y de factores de transcripción Brn3:estudio de la respuesta neuronal y microglial a la axotomía y efecto del envejecimiento en la retina
(2015-12-01) Nadal Nicolás, Francisco Manuel; Agudo Barriuso, Marta; Vidal Sanz, Manuel; Facultad de Medicina
Introducción La retina es parte del sistema nervioso central (SNC) y se localiza en la cara interna del globo ocular. Su función principal es la fototransducción de las ondas electromagnéticas del espectro de la luz visible en energía eléctrica. Esta función es realizada por los fotorreceptores (conos y bastones). Tras su procesamiento, la información llega a las células ganglionares de retina (CGR). Las CGR son las únicas neuronas aferentes de la retina y transmiten la información visual al cerebro a través de sus axones, que forman el nervio óptico (NO). En roedores, la mayoría de las CGR proyecta contralateralmente, siendo la población ipsilateral menor del 5%. Dentro de las CGR existe un subtipo que contiene un pigmento fotosensible, la melanopsina, que les confiere la propiedad de la fototransducción. Estas CGR melanopsínicas son responsables principalmente de funciones extravisuales o no formadoras de imágenes, como son el reflejo pupilar o la sincronización del ritmo circadiano con la luz. Objetivos 1º Caracterizar un muevo marcador para identificar las CGR de rata: Brn3a. 2º. Caracterizar la expresión de los factores de transcripción de familia Brn3 en las CGR de rata: Brn3a, Brn3b y Brn3c. 3º. Caracterizar las CGR desplazadas en rata albina y pigmentada. 4º. Caracterizar la población de CGR con proyección retino-retiniana en rata. 5º. Desarrollar nuevos métodos de trazado de las CGR de rata: desde el nervio óptico intacto y desde el tracto óptico. 6º. Analizar el efecto del trazado y la lesión axonal en las CGR melanopsínicas y en la expresión de melanopsina en rata albina y pigmentada. 7º. Caracterizar el efecto a largo plazo de la lesión del nervio óptico en la población general de CGR y CGR melanopsínicas ortotópicas y desplazadas y en el resto de las células que componen la capa de células ganglionares en rata albina y pigmentada. 8º. Caracterizar la respuesta de las células microgliales en la retina de rata tras axotomía del nervio óptico. 9º. Caracterizar el efecto del envejecimiento en la retina de rata albina y pigmentada. Material y Métodos. Resultados y Conclusiones Para identificar las CGR clásicamente se han usado técnicas de trazado. Los trazadores como el Fluorogold® (FG) se aplican o en el NO, para identificar la proyección retinofugal completa, o en los colículos superiores (CS), adonde proyectan el 98,4%% de las CGRs en roedores. En esta tesis hemos puesto a punto dos métodos nuevos de trazado: desde el NO intacto o desde el tracto óptico mediante una inyección bilateral estereotáctica. Ambas técnicas son asequibles, reproducibles y fiables. Además, hemos caracterizado el Brn3a como marcador de CGR. El Brn3a es un marcador fiable y eficiente para identificar y cuantificar las CGR en retinas intactas y con lesión axonal y además, permite analizar la topografía de las CGR después del daño axonal ya que a diferencia de los trazadores neuronales, no presenta interferencia con la microglía fagocítica trazada transcelularmente. Conjuntamente hemos analizado la expresión de los tres miembros de la familia Brn3 en las CGR, y hemos demostrado que el 70% de las CGR co-expresan dos o tres miembros de la familia Brn3 y el 30% restante expresa solamente Brn3a (26%) o Brn3b (4%) en retina de rata. Por tanto, el Brn3a se expresa en todas las CGRs exceptuando las CGR melanopsínicas y la mitad de la población ipsilateral. La mayoría de las CGR se localizan en la capa de las células ganglionares (CCG), conocidas como CGR ortotópicas (CGRo), aunque una pequeña población de CGR se encuentra desplazada a la capa nuclear interna o a la capa plexiforme interna. Estas CGR se llaman células de Dogiel o CGR desplazadas (CGRd). Nosotros hemos estudiado a ambas poblaciones en paralelo. Mientras que las CGR ortotópicas se distribuyen principalmente por la región dorso-central de la retina, las CGR desplazadas tienen una topografía diferente, se encuentran en el ecuador de la retina, con un densidad mayor en la retina temporal y son más abundantes en la rata pigmentada. La mayoría de las CGRd expresan Brn3a, y una pequeña proporción expresa melanopsina, estas últimas se distribuyen de manera similar a las CGRo melanopsínicas: son más abundantes en la retina dorso-temporal. Existe una pequeña población de CGR que proyecta a la retina contralateral, éstas son las CGR de proyección retino-retiniana (CGR ret-ret). Hemos corroborado que esta proyección es mayor en animales jóvenes que en adultos y que se encuentran preferentemente en la retina nasal y, además hemos demostrado que éstas expresan Brn3a o melanopsina y que, las que lo hacen, son las que se mantienen en los animales adultos. En la CCG, además de las CGRo hay otras poblaciones celulares: células endoteliales, células gliales y las células amacrinas desplazadas (CAd). En esta tesis hemos descrito que el 45% de las neuronas de la CCG son CGRs y el 55% restante son CAd. Y si excluimos las células endoteliales, las células gliales representarían un 10% de la población total de la capa de células ganglionares. En esta tesis, también analizamos como el albinismo afecta a las CGR. El albinismo es una enfermedad hereditaria, en la que hay una ausencia parcial o total de pigmentación que, entre otras, provoca una serie de anomalías en el sistema visual tales como una menor proyección ipsilateral y número de CGRd y, la agudeza visual y el nistagmus optocinético están afectados. Nosotros hemos demostrado que el albinismo produce los mismos defectos en la población melanopsínica que en el resto de las CGR: disminución en el número de CGRd-m y una proporción inferior de ipsilateralidad. Las lesiones en el SNC provocan la muerte neuronal con secuelas permanentes e irrecuperables, ya que las neuronas del SNC no se reemplazan. En esta tesis hemos utilizado dos modelos de degeneración de SNC que afectan específicamente a las CGR: la lesión traumática axonal por sección (SNO) o aplastamiento (ApNO) de nervio óptico, y la hipertensión ocular (HTO) como modelo de glaucoma aumentando la presión intraocular por fotocoagulación láser de la malla trabecular y las venas perilimbares y episclerales. Usando el modelo de la elevación de la presión intraocular hemos observado que las CGR desplazadas presentan la misma respuesta que las CGR ortotópicas. Y los modelos de axotomía de nervio óptico también nos han permitido documentar que estas lesiones causan la pérdida específica de CGR (ortotópicas y desplazadas), sin afectar a otras poblaciones de la capa de células ganglionares. Sin embargo, dentro de las CGR, las CGR melanopsinicas tienen un curso temporal de pérdida diferente, son más resistentes a la lesión, pero la expresión de melanopsina se infra-regula transitoriamente como respuesta tanto la axotomía como al trazado retrógrado desde el NO. Así, este hallazgo debe ser tenido en cuenta cuando se utilice la melanopsina para estudiar la población de las CGR intrínsicamente fotosensibles. Las células de la microglía (CM) son los macrófagos residentes del SNC. En condiciones normales se encuentran en estado de vigilancia. Sin embargo, tras una lesión neurodegenerativa se activan fagocitando desechos celulares. La aproximación experimental que se utiliza para identificar las CM que han fagocitado una neurona (o CM fagocíticas, CMF) se basa en el hecho de que las CM acumulan en sus fagolisosomas productos exógenos, proceso conocido como marcaje transcelular. Así, cuando una CM fagocita una CGR en degeneración previamente trazada, acumula el trazador siendo posible distinguirla de las CM que no han fagocitado. En esta tesis hemos cuantificado y analizado la distribución de las CM en la CCG y la CPI tanto en animales intactos como después de ambos modelos de axotomia (SNO y ApNO). La aparición de las CMF después del insulto aumenta al aumentar el tiempo post-lesión y se distribuyen en la región central de la retina donde hay una mayor pérdida de las CGR, a diferencia de los animales intactos donde se distribuyen homogéneamente. Aunque éste aumento de CMF es más rápido después de la SNO, existe una correlación lineal y topográfica entre la aparición de las CMF y la pérdida de CGR. La aparición de las CMF en la CCG y el descenso de las CM no fagocíticas en la CPI a 14d de ambas lesiones, sugiere que tras la lesión de las CGR las CM migran entre ambas capas. La pérdida funcional o estructural de la actividad sensorial relacionada con la edad, es muy relevante cuando afecta al sistema visual, ya que de él dependemos más que de otros sentidos. No sólo los componentes puramente físicos implicados en la visión (córnea, cristalino, humor vítreo y humor acuoso) sufren cambios estructurales que influyen en la eficiencia de la transmisión lumínica perjudicando la calidad de la visión, sino que hay pérdida numérica y funcional en las poblaciones celulares implicadas en la transmisión de la información hasta el cerebro que aumenta con la edad. En esta tesis hemos comprobado que el envejecimiento causa principalmente un déficit funcional de la retina en ambas estirpes de rata analizadas. Pero anatómicamente, ni el número de células en la CCG, ni el transporte axonal anterógrado disminuyen con la edad, solamente en la cepa pigmentada, hay un descenso del número de fotoreceptores tipo cono. Y mediante un análisis “in vivo” (SD-OCT), también hemos observado un alargamiento y adelgazamiento progresivo de la retina. Para la realización de esta tesis ha sido necesario el desarrollo de rutinas informáticas que permitan tanto la cuantificación como la representación grafica de la distribución de las diversas poblaciones celulares estudiadas en la retina. Todas estas metodologías automáticas fueron realizadas en colaboración con D. Manuel Jiménez López. Introduction The retina is part of the central nervous system (CNS) and it is located in the posterior part of the ocular globe. The main function of the retina is to sense light. Photoreceptors, cones and rods and send the luminous information to retinal ganglion cells (RGCs) through intermediate neurons. RGCs are the only afferent retinal neurons and transmit this information from the retina to the retinorecipient areas in the brain through their axons that form the optic nerve (ON). In rodents, the majority of RGC project to the contralateral superior colliculi (SCi), being the ipsilateral projection smaller than 5%. There is a subtype of RGC that expresses a photosensitive pigment, melanopsin, that confers them the ability of phototransduction. Melanopsin+RGC (m+RGC) are responsible for the non visual functions triggered by light, such as the pupilary reflex and the circadian photoentrainment. Objetives 1st. To characterize Brn3a as a marker of rat RGCs. 2nd. To characterize the expression of Brn3 transcription factors, Brn3a, Brn3b and Brn3c, in rat RGCs. 3rd. To characterize the population of displaced RGCs in albino and pigmented rats. 4th. To characterize the population of RGCs that project retino-retinially. 5th. To investigate the efficiency of two new methods to trace rat RGCs: from the intact optic nerve and from the optic tract. 6th. To analyze the effect of tracing or axotomy on the expresión of melanopsin and detection of melanopsin+RGCs in albino and pigmented rat RGCs. 7th. To analyze in albino and pigmented rats the long term effect of optic nerve injury on RGCs and m+RGCs orthotopic and displaced, and on the rest of the ganglion cell layer cells. 8th. To analyze the microglial response in the rat retina after optic nerve axotomy. 9th. To study in albino and pigmented rats the effect of aging on the retina. Material and Methods. Results and Conclusions Retrograde tracing with tracers such as Fluorogold® (FG) is the classical approach to identify RGCs. Tracers are applied in the ON to identify the whole retinofugal projection or on the SC, where 98.4% of the RGC project to. In these thesis, we have tuned up two new methods to trace rat RGCs: from the intact optic nerve and from the optic tract by a bilateral stereotactic injection. Both techniques are affordable, reproducible and reliable. In addition we have characterized the Brn3a as a marker of rat RGCs. Brn3a is a reliable marker to identify, quantify and assess the viability of rat RGCs in health and disease. In addition, Brn3a immunodetection allows quantifying and determining the topography of RGCs after a given injury without interference of transcellularly- labelled microglial cells. We have analyzed the expression of the three members of the Brn3 family RGC, and we have shown that 70% of RGC co-express two or three Brn3 members and the remaining 30% expresses only Brn3a (25%) or Brn3b (4%). Brn3a is expressed by all RGCs except melanopsin+ ones and half of the ipsilateral projection. Most of the RGC are placed in the ganglion cell layer (GCL), these are orthotopic RGC (oRGC). However a small proportion of them is located in the inner nuclear layer or in the inner plexiform layer. These are known as Dogiel's cells or displaced RGC (dRGC). We have studied both counterpart together. While the ortothopic RGCs, are denser in the dorso-central retina, the displaced RGCs have a different topography, they are found in the retinal equator, with a higher density in the temporal retina and are more abundant in pigmented animals. Most of the dRGCs express Brn3a, and a small proportion express melanopsin, the last ones have a similar distribution than the m+-oRGCs: they are more abundant in the dorso-temporal retina. There is a small number of RGC projects to the contralateral retina, these are retino-retinal projecting RGC (ret-ret RGC). We have beared out the retino-retinal projection is minute but higher in young than in adult animals. Ret-ret RGCs are mainly nasal, and express Brn3a or melanopsin and those do it, are preserved in adult animals. In the GCL besides oRGC there are endothelial cells, glial cells and displaced amacrine cells (dAC). In this work, we have described that 45%percent of neurons in the GCL are RGCs, and 55% are displaced amacrine cells. And, if we exclude the endothelial cells, glial cells represent 10% of the total cell population of the ganglion cell layer. In this thesis, we have also analyzed how albinism affects RGCs. Albinism is a hereditary disease caused by the partial or total lack of pigmentation that causes a long list of abnormalities in the visual system such as an impaired visual acuity and optokinetic nystagmus and defects in the crossing of the retinofugal projections. Here, we added to this knowledge, that albinism produces in the melanopsin population the same defects than in the general RGC population: reduced number of displaced m+RGCs and a lower ipsilaterally. CNS lesions induce the permanent and irreversible death of the affected neurons, since CNS neurons do not proliferate and thus, are not replaced. In this thesis we have used two models of RGC degeneration: traumatic axonal injury (axotomy) transecting (ONT) or crushing (ONC) the optic nerve, and ocular hypertension (OHT), a model of glaucoma created by increasing the intraocular pressure with laser photocoagulation of the trabecular meshwork, the perilimbar and episcleral veins. Using the ocular hypertension, we have observed that the dRGCs and oRGC respond similarly to lesion. And the axotomy models also allowed us to document that after axotomy only RGCs are lost (ortothopic and displaced) without affecting other populations in the ganglion cell layer. However, within RGCs, the m+RGCs have a different course of loss, they are more resistant to injury, but the expression of melanopsin is temporarily under-regulated in response to both axotomy and retrograde tracing from the NO. Thus, this finding should be considered when melanopsin is used to study the population of the intrinsically photosensitive CGR. Microglial cells (MC) are the CNS resident macrophages. In the healthy CNS they are found in a resting (surveying) state. However, during a neurodegenerative process, they activate and among other functions, phagocytose the cellular debris. The experimental approach to identify CM that have phagocytose a neuron (phagocytic microglial cells, PMC) is based on the fact that CM accumulate in their phagolysosomes exogenous compounds, such as tracers. This process is known as transcellular tracing. Thus, when a MC engulfs a traced RGC it is possible to distinguish it from the rest of MC. In this thesis, we quantified and analyzed the distribution of MC in the GCL and the IPL in intact animal or after both axotomy models (SNO and APNO). The number of CMF after the insult increases with time post-injury. These PMC are distributed in the central region of the retina where the loss of RGCs is greater, unlike in intact animals where they are homogeneously distributed. The appearance of PMC correlates linearly and topographically with the loss of RGCs. The increase of PMC in the GCL and the decrease of MC in the IPL suggest that upon RGC injury, MC migrate between both layers. Aging is very relevant when affects the visual system, since we depend on vision more than on any other senses. Not only the physical components of the eye (cornea, lens, vitreous and aqueous humor) through which the light passes age, there is also a progressive neuronal loss and degeneration. In this thesis we found that aging causes, mainly, a functional deficit in the retina in both rat strains. Anatomically, neither the number of cells in the GCL nor the anterograde axonal transport diminishes with age, however, in the pigmented, but not in the albino rat, there is a loss of cone photoreceptors. And by “in vivo” analysis (SD-OCT), we have also observed a progressive elongation and thinning of the retina. For the consecution of this thesis it has been necessary to develop several automated routines to perform the quantification and graphic representation of the different cell populations analyzed. All these automated methodologies were created in collaboration with D. Manuel Jimenez López.
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Inventory and distribution of the rodents in Aurès Mountains and Ziban oasis (Northeast of Algeria)
(Murcia: Servicio de publicaciones de la Universidad de Murcia, 2018) Drouai, Hakim; Belhamra, Mohammed; Mimeche, Fateh
Our study presents an inventory of rodents in Northeast of Algeria. The species were captured at two regions: Taouziant (Aurès Montain) and Bouchagroune (Ziban oasis). The sampling period takes ten months at each site: in Taouziant between February to November 2014 and in Bouchagroune, from September 2013 to June 2014. The method of trapping online was performed using 40 wire traps installed at the studied regions. Eight species were captured. They belong to three subfamilies and six genera. Three species occur in the two regions: Rattus rattus, Mus musculus and Gerbillus amoenus. Three species were captured in Taouziant cereal fields ( Rattus norvegicus, Meriones shawii and Jaculus jaculus) and two species were found in Bouchagroune palm grove (Psammomys obesus and Gerbillus gerbillus).
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Modelo de tratamiento experimental de la fotocarcinogénesis por irradiación ultravioleta crónica en ratones SKH-1
(2016-12-22) Arribas Díaz, Blanca; Vicente Ortega, Vicente; Gómez García, Francisco José; Escuela Internacional de Doctorado
La piel es el órgano más externo y extenso que recibe directamente las radiaciones UV solares, responsables del fotoenvejecimiento y la fotocarcinogénesis cutáneos. El objetivo de nuestro trabajo ha consistido en el desarrollo de un modelo experimental de fotoenvejecimiento mediante la exposición crónica a RUV, así como la evaluación de los efectos del tratamiento con ingenol mebutato y paclitaxel sobre las lesiones originadas. Para ello utilizamos 72 ratones SKH-1 que se expusieron a 65 sesiones de radiación UV (98,6% RUV A y 1,4% RUV B) de 60 minutos de duración, 4 días a la semana; cada animal fue expuesto a 1.371,5 J/cm2. Los ratones se dividieron en 6 grupos (n=12) según el tratamiento aplicado: grupo I (RUV exclusivamente); grupo II, tratados con ingenol mebutato durante 3 días consecutivos; grupo III, tratados con paclitaxel+5% GES durante 3 semanas; grupo I , tratados con paclitaxel+5% GES 6 semanas; grupo V, tratados con paclitaxel+1,2% GES 3 semanas y Grupo VI, tratados con paclitaxel+1,2% GES 6 semanas. Tras el período de tratamiento los ratones fueron observados durante 1 mes, y finalmente se realizó su sacrifio y necropsia. Todos los animales presentaban clínicamente todo el espectro lesional del fotoenvejecimiento y la fotocarcinogénesis cutáneos. En los animales tratados con ingenol mebutato se produjo la reducción de la superficie de las lesiones desarrolladas durante la irradiación, así como la reducción del 17% de la incidencia de carcinomas con respecto al grupo Control, mientras que los animales de los grupos tratados con distintas formulaciones de paclitaxel lograron reducir la incidencia de carcinomas entre el 25 y el 50%, siendo los animales tratados con paclitaxel+1,2% GES durante 3 semanas los que mostraron mayor grado de respuesta al tratamiento con una reducción de la incidencia de carcinomas del 50%. En el estudio inmunohistoquímico los animales de todos los grupos mostraron un comportamiento similar. Se observó la disminución de expresión de PCNA y, por tanto la proliferación celular y una mayor expresión de MMP-9 en los carcinomas in situ y microinvasores, lo que sugiere una mayor actividad de estas enzimas en estadíos iniciales de la carcinogénesis; mientras que el inhibidor de metaloproteinasas TIMP-1 parece tener poca relevancia en el proceso neoplásico en nuestro modelo. En conclusión, el presente modelo reproduce el efecto sobre la piel de la exposición crónica a la radiación ultravioleta, provocando las alteraciones del fotoenvejecimiento y el desarrollo de carcinomas. El tratamiento de la piel con signos de daño actínico con ingenol mebutato o con paclitaxel previene la evolución de las lesiones hasta el desarrollo de carcinomas espinocelulares. SUMARY The skin is the outermost and extensive organ that directly receives solar UV radiation, responsible for photoaging and skin photocarcinogenicity. The aim of our work was to develop an experimental model of photoaging by chronic exposure to UVR, as well as the assessment of the effects of the treatment with paclitaxel and mebutato ingenol on the injuries caused. We used 72 SKH-1 mice wich were exposed to 65 sessions of UV radiation (98.6% UVR A and 1.4% UVR B) of 60 minutes length, 4 days a week; each animal was exposed to 1371.5 J / cm2. Mice were divided into 6 groups (n = 12) as the treatment applied: Group I (only UVR); Group II, treated with ingenol mebutato for 3 consecutive days; Group III, treated with paclitaxel + 5% GES for 3 weeks; Group IV, treated with paclitaxel + 5% GES for six weeks; Group V, treated with paclitaxel + 1.2% GES 3 weeks; and Group VI, treated with paclitaxel + 1.2% GES 6 for weeks. After the treatment period mice were observed for 1 month, and finally its sacrifice and necropsy was performed. All animals showed clinically the whole lesional spectrum of skin photoaging and photocarcinogenicity. In animals treated with mebutato ingenol, the surface of the lesions developed during irradiation was reduced, and a 17% reduction in the incidence of carcinomas compared to the control group, while animals on the groups treated with different paclitaxel formulations reduced the incidence of carcinomas between 25 and 50%, the animals treated with paclitaxel + 1.2% GES for 3 weeks showed increased responsiveness to treatment with reduced incidence of carcinomas 50%. In the immunohistochemical study animals in all groups showed a similar behavior. A decreased expression of PCNA was observed, and thus cell proliferation and increased expression of MMP-9 in situ and microinvasive carcinomas, suggesting an increased activity of these enzymes in early stages of carcinogenesis; while the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 seems to have little relevance in the neoplastic process in our model. In conclusion, this model reproduces the effect on skin of chronic exposure to ultraviolet radiation, causing alterations of photoaging and development of carcinomas. Treatment of skin with signs of photodamage with mebutato ingenol or paclitaxel prevented the evolution of injury to the development of squamous cell carcinomas.
Open Access
The most commonly used drugs during early childhood and their relationship to the incisor molar hypomineralization syndrome : experimental study in mice= Relación entre los fármacos de uso más frecuente en la primera infancia y la aparición del síndrome de hipomineralización incisivo-molar: estudio experimental en ratones
(2017-03-22) Serna Muñoz, Clara; Ortiz Ruiz, Antonio José; Finke, Christian; Facultad de Medicina
El término hipomineralización incisivo molar (MIH) fue descrito por primera vez por Weerheijm, Jälevik y Alaluusua (2001), y definitivamente adoptado por la comunidad dental internacional como resultado de un consenso tras varias discusiones sobre un defecto del desarrollo del esmalte en el Congreso de la Academia Europea de Odontopediatría celebrado en Atenas, en 2003 (Weerheijm et al., 2003). La MIH es un defecto cualitativo del esmalte, que afecta a los primeros molares y los incisivos permanentes, pero puede afectar a cualquier diente. El uso de medicaciones durante los tres primeros años de vida ha sido postulado como una posible causa postnatal. El primer objetivo de la tesis ha sido realizar una revisión sistemática sobre la relación entre el MIH y el uso de medicaciones durante el embarazo y los primeros cuatro años de vida. Después de aplicar los criterios de admisibilidad, se seleccionaron 20 artículos para esta revisión.Las conclusiones de este estudio fueron que la evidencia disponible sugiere que no puede decirse que algún fármaco produzca inequívocamente MIH. Se necesitan más estudios prospectivos bien diseñados en los que los investigadores describan el tiempo y la edad de administración del fármaco y el tipo de defecto de esmalte producido. El segundo objetivo de la tesis fue realizar un estudio macroscópico de los incisivos y molares de los ratones tratados con amoxicilina, amoxilicina + ácido clavulánico, eritromicina, ibuprofeno, paracetamol y celecoxib durante los días 21 a 50 de vida. Tras sacrificar a los animales, se extrajeron los maxilares y las mandíbulas y tras su limpieza y preparación se observaron al estereomicroscopio, conectado a la cámara digital Leica DC500. Se obtuvieron imágenes de todas las hemimaxilas y hemimandíbulas. No se observaron defectos cualitativos del esmalte en los dientes observados en nuestros grupos experimentales. La presencia de zonas amarillentas, particularmente en los incisivos, es característico de la dentición murina. El tercer objetivo fue estudiar la morfología del la superficie del esmalte de molares de los ratones tratados con amoxicilina, amoxilicina + ácido clavulánico, eritromicina, ibuprofeno, paracetamol y celecoxib durante los días 21 a 50 de vida usando un microscopio electrónico de barrido (SEM). Se usaron seis hemimandíbulas y 6 hemimaxilas de cada grupo. Se tomaron entre 75 y 80 imágenes de cada grupo a distintos niveles de magnificación para su posterior evaluación. El desgaste debido a atrición y zonas libres de esmalte sobre todo en las cúspides del tercer molar, características de la dentición murina, fueron observadas. El objetivo 4 fue estudiar la composición elemental del esmalte de molares de ratones tratados con amoxicilina, amoxicilina + ácido clavulánico, eritromicina, paracetamol, ibuprofeno y celecoxib durante los días 21 a 50 de vida usando análisis de energía dispersiva de rayos X (EDX). Se usaron seis hemimaxilas y seis hemimandibulas. Se realizó un análisis cuantitativo de los elementos mediante EDX. Los resultados obtenidos sugieren que la administración de paracetamol y celecoxib durante la fase final del periodo de maduración del tercer molar de ratón puede reducir las concentraciones de Ca y P. El objetivo 5 fue determinar los niveles de ciclooxigenasa 2 en el órgano del esmalte de incisivo de ratones tratados con amoxicilina, amoxilicina + ácido clavulánico, eritromicina, ibuprofeno, paracetamol y celecoxib durante los días 21 a 50 de vida mediante análisis inmunohistoquímico. Se examinaron 12 incisivos por grupo. La COX 2 está involucrada en el estadio de maduración del órgano del esmalte, y su inducción es necesaria para el proceso de maduración normal, y por tanto, la inhibición de la COX-2 parece que podría alterar la amelogénesis mediante un proceso anormal de aporte de Ca y P, facilitando la aparición de MIH. SUMMARY The term molar incisor hypomineralization (MIH) was first described by Weerheijm, Jälevik and Alaluusua (2001), and definitely adopted by the international dental community as a result of a consensus after many discussions regarding the defects in enamel development in the Congress of the European Academy of Paediatric Dentistry in Athens in 2003 (Weerheijm et al., 2003). MIH is a qualitative enamel defect that mainly affects the first permanent molars and incisors but may affect any tooth. The use of medications during the first three years of life has been postulated as a possible postnatal cause. The first objective of the thesis was to conduct a systematic review about the relationship between MIH and the use of drugs during pregnancy and the first four years of life. After application of the eligibility criteria, 20 articles were selected for this review . The conclusions of this study was that available evidence suggests that no drug can unequivocally be said to produce MIH. More well-designed, prospective studies whose investigators describe the time or age of drug exposure and the kind of enamel defect produced are needed. The second objetive was to conduct a macroscopic study of the incisors and molars of mice treated with amoxicillin, amoxicillin+ clavulanic acid, erythromycin, ibuprofen, acetaminophen, and celecoxib during days 21-50 of life. After slaughtering the animals, the maxillaries and mandibles were extracted and prepared for their observtion. The stereomicroscope was connected to a Leica DC500 digital camera and digital images of all hemimaxilares and all hemimandibles were obtained using the Leica Application Suite (v 2.5.0) acquisition software. No qualitative enamel defects were observed in the teeth of our experimental groups. The presence of yellowing, particularly in the incisors, is a feature of murine dentition. The third objetive was to study the morphology of the enamel surface of the molars of mice treated with amoxicillin, amoxicillin+ clavulanic acid, erythromycin, acetaminophen, ibuprofen and celecoxib during days 21-50 of life using a scanning electron microscope (SEM) Six hemimandibles and 6 hemimaxilares from each group were used. Between 75 and 80 digital images of each group at different levels of magnification were selected for further evaluation. Wear due to attrition and enamel free zones in most third molar cusps, characteristic of murine dentition, were observed. The objective 4 was to study the elemental composition of the molar enamel of mice treated with amoxicillin, amoxicillin+clavulanic acid, erythromycin, acetaminophen, ibuprofen and celecoxib during days 21 to 50 of life by spectrometric analysis using X-ray diffraction (EDX). Six hemimaxilares and 6 mandibles were used.. A quantitative analysis of the elements was made by EDX.The administration of paracetamol and celecoxib during the final phase of the maturation period of the third mouse molar reduced concentrations of Ca and P. The objective 5 was to determine levels of cyclooxygenase 2 in the enamel organ of the incisors of mice treated with amoxicillin, amoxicillin+ clavulanic acid, erythromycin, acetaminophen, ibuprofen and celecoxib during days 21 to 50 of life using immunohistochemical analysis. Twelve incisors per group were examined. COX2 is involved in the maturation stage of the enamel organ, and its induction must be necessary to the normal maturation process, and thus COX2 inhibition would appear to alter amelogenesis by an abnormal supplementation of Ca and P, facilitating MIH.

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