Browsing by Subject "Infección"

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    Caracterizació molecular y funcional de Gbp4 de pez cebra : un nuevo componente del inflamasoma= Molecular and functional chraterization of zebrafish Gbp4: a new inflammasome component
    (2015-09-08) Tyrkalska, Sylwia Dominika; Mulero Méndez, Victoriano Francisco; Escuela Internacional de Doctorado
    INTRODUCCIÓN: La señalización a través de los NOD-like receptors (NLRs), que son una familia de receptores citosólicos de reconocimiento de patrones (PRRs), da lugar al procesamiento y activación de las citoquinas pro-inflamatorias IL-1 β e IL-18 mediados por caspasa-1, así como de la inducción de una forma de muerte celular recientemente descrita llamada piroptosis. Para ello, los NLRs median la formación de plataformas multiproteicas de señalización llamadas inflamasomas, que alertan al sistema inmune de la presencia de infección o daño tisular. OBJETIVOS: (1) Establecimiento de un modelo de infección de Salmonella Typhimurium en pez cebra para estudiar la activación, el ensamblaje y el funcionamiento del inflamasoma; (2) Caracterización del papel de la flagelina de S. Typhimurium en el mecanismo de infección en pez cebra; (3) Caracterización del papel de Gbp4 de pez cebra en la activación y ensamblaje del inflamasoma, así como en la eliminación de S. Typhimurium; (4) Caracterización del papel de los neutrófilos en la eliminación de S. Typhimurium dependiente de Gbp4 en pez cebra; (5) Caracterización del papel de Gbp4 en la producción de prostaglandinas dependiente del inflamasoma, y del de las prostaglandinas en la eliminación de S. Typhimurium. METODOLOGÍA: Los métodos utilizados en la tesis doctoral son: Ensayos de infección con S. Typhimurium, ensayos de actividad caspasa-1, toma de imágenes de larvas de pez cebra, reclutamiento de neutrófilos y análisis de la muerte celular, ensayos de luminescencia, citometría de flujo, análisis de expresión génica, Western blot, ensayo de reconstitución del inflamasoma en células HEK293. RESULTADOS: Aquí demostramos que la proteína Gbp4 de pez cebra, una enzima GTPasa inducible por IFNγ que alberga un dominio C-terminal CARD, se expresa en los neutrófilos y es necesaria para la eliminación de Salmonella Typhimurium in vivo dependiente del inflamasoma. A pesar de la presencia del dominio CARD, Gbp4 requiere la presencia de la proteína adaptadora Asc para desempeñar su función antibacteriana. Además, la actividad GTPasa de Gbp4 es indispensable para la activación del inflamasoma, el reclutamiento de neutrófilos al lugar de la infección, y la eliminación de S. Typhimurium. La reconstitución de los complejos Gbp4-Asc en células embrionarias humanas de riñón (HEK293) en cultivo, nos mostró que forman complejos macromoleculares con un anillo exterior de Asc y un núcleo de Gbp4. Mecanísticamente, Gbp4 es esencial para la liberación de prostaglandinas dependiente del inflamasoma, de las cuales PGD2 se asocia con la eliminación de bacterias mediada por Gbp4. Por tanto, nuestros resultados señalan a las proteínas de unión con GTPasa como los adaptadores clave del inflamasoma necesarios para la biosíntesis de prostaglandinas y la eliminación de bacterias intracelulares por los neutrófilos in vivo. CONCLUSIONES: (1) El pez cebra es un excelente modelo para estudiar la activación y la función del inflamasoma en respuesta a una infección por S. Typhimurium; (2) El reconocimiento intracelular de S. Typhimurium en pez cebra depende altamente de la producción de flagelina; (3) La activación del inflamasoma dependiente de Gbp4 mejora la resistencia de las larvas de pez cebra e incrementa la actividad caspasa-1 después de la infección con S. Typhimurium; (4) Tanto Gbp4 mutante que carece de la actividad GTPasa, como el doble mutante al que también le falta el dominio CARD, se comportan como dominantes negativos, incrementando la susceptibilidad a S. Typhimurium y, en paralelo, reduciendo la actividad caspasa-1; (5) El mutante de Gbp4 sin el dominio CARD actúa, al igual que GBP5 de mamíferos, rescatando la elevada susceptibilidad de las larvas deficientes en Gbp4, pero no aumenta la actividad caspasa-1 después de la infección con S. Typhimurium en pez cebra; (6) Gbp4 regula el reclutamiento de neutrófilos al lugar de infección y, además, la eliminación de S. Typhimurium dependiente de Gbp4 esta mediada por los neutrófilos; (7) El inflamasoma dependiente de Gbp4 activa la biosíntesis de las prostaglandinas, que a su vez fomentan la eliminación de S. Typhimurium. INTRODUCTION: The nucleotide-binding domain leucine-rich repeats (NLRs) constitute a family of cytosolic pattern recognition receptors (PRRs), which are the responsible for the caspase-1-mediated processing and activation of pro-inflammatory cytokines, such us IL-1 β and IL-18, and the induction of a recently described form of cell death called pyroptosis. NLRs achieve these functions by forming multiprotein signaling platforms, called inflammasomes, which alert the immune system about the presence of infection or tissue damage. OBJECTIVES: Taking that into consideration, the objectives of the present work are: (1) Establishment of a zebrafish – Salmonella Typhimurium infection model to study inflammasome activation, assembly and function; (2) Characterization of the role of flagellin of S. Typhimurium in the infection mechanism in zebrafish; (3) Characterization of the role of zebrafish Gbp4 in inflammasome activation, assembly and clearance of S. Typhimurium; (4) Characterization of the role of neutrophils in the Gbp4-dependent clearance of S. Typhimurium in zebrafish; (5) Characterization of the role played by the Gbp4 inflammasome in prostaglandin production and S. Typhimurium clearance. METHODOLOGY: The following methods were used in this doctoral thesis: yolk sac or ear infection assays with S. Typhimurium, caspase-1 activity assays of infected larvae, counting of neutrophils using different zebrafish transgenic lines with fluorescent neutrophils using live imaging, neutrophil recruitment assays, cell death analysis, luminescence assays for the measurement of Il1-β contents, flow cytometry and FACS-sorting of fluorescent cells, gene expression analysis, western blot, inflammasome reconstitution assays in HEK293 cells. RESULTS: Here we report that zebrafish Gbp4, an IFNγ-inducible GTPase harboring a C-terminal CARD domain, is expressed in neutrophils and is required for the inflammasome-dependent clearance of Salmonella Typhimurium in vivo. Despite the presence of the CARD domain, Gbp4 requires the universal inflammasome adaptor protein Asc for mediating its antibacterial function. In addition, the GTPase activity of Gbp4 is indispensable for the inflammasome activation, the neutrophil recruitment and the clearance of S. Typhimurium. Reconstitution of Gbp4-Asc complexes in human embryonic kidney cells (HEK293) revealed a macromolecular complex with an outer ring of Asc and an core of Gbp4. Mechanistically, Gbp4 is essential for the inflammasome-dependent release of prostaglandins, of which PGD2 is associated with the Gbp4-mediated bacterial clearance. Our results, therefore, point to GTPase-binding proteins as the key inflammasome adaptors required for prostaglandin biosynthesis and intracellular bacterial clearance by neutrophils in vivo. CONCLUSIONS: The above results suggest that: (1) Zebrafish is an excellent model to study inflammasome activation and function upon S. Typhimurium infection; (2) Intracellular recognition of S. Typhimurium in zebrafish highly depends on flagellin production; (3) Gbp4-dependent inflammasome activation improves zebrafish larvae resistance and increases caspase-1 activity upon S. Typhimurium infection; (4) A Gbp4 mutant lacking GTPase activity, as well as a double GTPase and CARD mutant, behave as dominant negatives by increasing the susceptibility to S. Typhimurium and, in parallel, decreasing caspase-1 activity; (5) A Gbp4 mutant lacking the CARD domain acts as mammalian GBP5; that is, rescues the higher susceptibility of Gbp4-deficient larvae but fails to increase caspase-1 activity upon S. Typhimurium infection in zebrafish; (6) Gbp4 regulates neutrophil recruitment to the site of the infection. In addition, the Gbp4-dependent clearance of S. Typhimurium is mediated by neutrophils; (7) The Gbp4-dependent inflammasome activates prostaglandin biosynthesis, which in turn promotes S. Typhimurium clearance.
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    Colonización por ESKAPES y características clínicas de pacientes en estado crítico
    (Universidad de Murcia, 2020) Santos Zonta, Franciele do Nascimento; da Silva Roque, Márcia; Soares da Silva, Ruan Gabriel; Gabrieli Ritter, Amanda; Tondello Jacobsen, Fernanda
    Identificar la colonización por ESKAPES y las características clínicas de los pacientes hospitalizados en una Unidad de Cuidados Intensivos para Adultos de un hospital mixto en Paraná. Método: Investigación de campo, descriptiva, documental y experimental con enfoque cuantitativo, desarollada en una Unidad de Cuidados Intensivos adultos de un hospital mixto en el suroeste de Paraná, Brasil. La población del estudio consistió en pacientes con ingreso de 48 horas en la Unidad de Cuidados Intensivos, de abril a agosto de 2018 y de abril a agosto de 2019. La muestra totalizó 102 individuos. Para la recopilación de datos clínicos, se utilizó un Checklist y para el análisis microbiológico se recogieron muestras de las cavidades nasales y orales y la secreción traqueal. El análisis de los datos clínicos se produjo a través del software Statistical Package for the Social Sciences. Se realizaron pruebas de frecuencia y chi-cuadrado, teniendo en cuenta la p<0,05 significativa.Resultados: Se evaluaron un total de 102 pacientes ingresados en la Unidad de Cuidados Intensivos durante el período estudiado. De ellos, 57 (55,8%) fueron colonizados por microorganismos patógenos. En cuanto a la colonización por microorganismos, predominan Staphylococcus aureus (61,4%), seguido de Klebsiella pneumoniae (40,4%), Pseudomonas aeruginosa (26,3%) y Staphylococcus epidermidis (21,1%). Cabe destacar que Klebsiella pneumoniae y Staphylococcus aureus estuvieron presentes en las tres regiones evaluadas.
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    Infección por el virus del papiloma humano en mujeres con lesión intraepitelial cervical : aspectos virológicos y clinicopatológicos
    (2014-02-10) Moreno Docón, Antonio; Segovia Hernández, Manuel; Departamento de Genética y Microbiología
    Objetivos: En la actualidad, se conoce bien la relación que existe entre la infección por el virus del papiloma humano (VPH) y las lesiones precursoras del cáncer cervical. El principal objetivo de este estudio fue conocer la prevalencia general de la infección por VPH y estudiar los genotipos más frecuentes en mujeres con lesión intraepitelial cervical en la región de Murcia. Por otra parte, se ha evaluado la utilidad de la detección de VPH como marcador pronóstico de enfermedad residual en mujeres tratadas por lesión cervical de alto grado (CIN2+). Material y métodos: Se estudiaron muestras clínicas procedentes de 3.752 pacientes que tras una exploración ginecológica presentaron un resultado citológico anormal. Este estudio se realizó durante un periodo de 5 años (2008-2012), en un contexto de cribado asistencial oportunista, al no existir un modelo de cribado poblacional en nuestra comunidad. La detección de ADN del VPH se realizó mediante la técnica de captura de híbridos, mientras que la detección y tipado de VPH se realizó mediante una técnica de PCR microarray. Resultados: En nuestro estudio, encontramos que la tasa de detección de VPH fue del 53,5% en ASCUS, 73,2% en LSIL y 78,9% en HSIL. Los cuatro genotipos más frecuentes encontrados fueron los tipos 16 (31,1%), 31 (13,5%), 51 (13,4%) y el 53 (11,8%). La prevalencia del VPH 16 aumentó significativamente con el grado de la lesión citológica (p < 0,0001). El VPH 18 se detectó con una baja frecuencia (5,7%), datos en concordancia con otros estudios publicados en nuestro país. No encontramos diferencias significativas entre el número de tipos de VPH y el grado de severidad de la lesión cervical. La introducción del test de VPH en el seguimiento de mujeres tratadas mediante escisión con asa de diatermia, dada su elevada sensibilidad (93,7%) y valor predictivo negativo (97,3%), permite que estas mujeres pueden realizar su seguimiento mediante un protocolo de cribado convencional cada 3-5 años. ABSTRACT Objetives: At present, the relationship between human papillomavirus (HPV) infection and cervical preneoplasic lesions is well known. The aim of this study was to determine the overall prevalence of HPV infection, and study the most frequent genotypes in women with cervical intraepithelial lesion in the region of Murcia. Moreover, we evaluated the usefulness of HPV detection as a prognostic marker of residual disease in women treated for high-grade cervical lesions (CIN2+). Material and Methods: We studied 3.752 clinical samples from patients after gynecological examination which showed an abnormal cytology result. This study was conducted over a period of five years (2008-2012), in a context of opportunistic screening in the absence of a model for population screening in our community. Detection of HPV DNA was performed by hybrid capture technique, whereas HPV detection and typing was performed by microarray-PCR. Results : In our study we found that HPV detection rate was 53.5% in ASCUS , 73.2 % in LSIL and 78.9 % in HSIL . The four most common genotypes found were types 16 ( 31.1 % ) , 31 ( 13.5 % ) , 51 ( 13.4%) and 53 ( 11.8 % ) . The prevalence of HPV 16 increased significantly with the degree of cervical lesion (p <0.0001). The HPV 18 was detected with a low frequency (5.7 %), according to data published in other studies in our country. There are no significant differences between the number of HPV types and degree of severity of the cervical lesion. The introduction of HPV testing in the monitoring of women treated by diathermy loop excision , given its high sensitivity (93.7 % ) and negative predictive value ( 97.3 % ) , allows these women to follow it up with a conventional screening protocol every 3-5 years.
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    Perfil epidemiológico de sífilis congénita en una microrregión en el interior del estado de Bahia (2007-2017)
    (Murcia: Servicio de publicaciones de la Universidad de Murcia, 2019) Almeida, Kaic Trindade; Santos, Álisson Neves; Costa, Ana Karla Araújo Nascimento; Santos, Myllena Rodrigues dos; Menezes, Ana Maria Fernandes; Alves, Kelle Araújo Nascimento
    Objetivo:Analizar el perfil epidemiológico de Sífilis Congénita en 18 municipios en el interior del estado de Bahía entre 2007 y 2017.Método:Estudio descriptivo, transversal y cuantitativo de los casos confirmados de Sífilis Congénita en la microrregiónregistrados en el Sistema de Información de Agravios y Notificación.Resultados:En el período estudiado se confirmaron 39 casos, donde el 30,8% de las madres tiene entre 20 a 24 años, el 59% son pardas, el 46,2% tienen enseñanza fundamental incompleta, el 33,3% amas de casa, el 74,4% en el momento del parto / curetaje, el 41% recibió tratamiento inadecuado y el 38,5% de los socios no fueron tratados. Con respecto a los recién nacidos, el 69,2% fue diagnosticado con 0 días de vida, 74,4% con Sífilis Congénita reciente y 46,2% asintomáticos.Conclusión:Los datos revelan un serio problema de salud pública en la microrregión analizada apuntando también fallas en el sistema de notificación, observadas en el elevado índice de ignorados en las variables estudiadas.
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    Uso de antibióticos en el Hospital Clínico Univesitario Virgen de la Arrixaca 2012 : estudio descriptivo, patrones de cambio (1978, 1982, 2012) e influencia del tratamiento antibiótico protocolizado en la evolución de los pacientes con infecciones
    (2014-12-03) Bonillo García, Cristina; Gómez Gómez, Joaquín; García Vázquez, Elisa; Departamento de Medicina Interna
    Objetivos: 1. Describir el uso de antibióticos en el Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca (HCUVA) 2012. 2. Valorar la influencia de la protocolización del tratamiento antibiótico en la evolución del paciente con proceso infeccioso 3. Analizar los patrones de cambio en el uso de antibióticos (1978-1982-2012) 4. Evaluar los conocimientos, actitudes y las prácticas de prescripción de antibióticos entre los médicos del HCVA Pacientes y métodos: 1. Estudio prospectivo de todos los pacientes que recibieron tratamiento antibiótico a lo largo del mes de Abril de 2012. 2. Se analizaron los factores asociados a mortalidad y fallo terapéutico, definido como, persistencia microbiológica, recidiva o muerte. La significación estadística p <0,05 3. Las prescripciones de antibióticos fueron analizadas y comparados con las del mes de abril de 1978 (sin protocolo), 1982 (creación de comisión de enfermedades infecciosas y establecimiento de las líneas generales del control de antibióticos) y 2012 (protocolos bien establecidos y definidos incluyendo directrices para el tipo de infección y gravedad). Significación estadística p <0,05 4. Cuestionarios autoadministrados. Resultados: 1. 602 pacientes de 1265 pacientes ingresados durante el mes de estudio recibieron tratamiento antibiótico, siendo 178 considerado como prescripciones profilácticas y 342 tratamientos como empíricos. Ceftriaxona y levofloxacino fueron los antibióticos administrados con mayor frecuencia; 69% de los 424 tratamientos (no profilácticos) fueron considerados como adecuados. Hubo fracaso clínico en 110 casos (27%), fracaso microbiológico en 49 (13%), recaída en 31 (8%) y muerte en 30 (7,5%). 2. Los factores asociados al fallo clínico fueron, tratamiento inadecuado (OR 5.68, IC 95%: 2,898 a 11,217) y aislamiento de E. coli con producción de BLEE (OR 4,43 (IC del 95%: 1,492 a 13,184). 3. En el año 1978, el 46% de los pacientes ingresados recibieron tratamiento antibiótico, el 33% en 1982 y 49% en 2012 (p <0,05). En cuanto a los servicios médicos, la prescripción de antibióticos afectaba al 37%, 47% y 59% de los pacientes, en 1978, 1982 y 2012, respectivamente (p <0,05). La tasa de adecuación fue de 49%, 53% y 69% en los 3 periodos diferentes (p <0,05 para el año 2012 en comparación con 1978 o 1982); 35%, 32% y 21% de los pacientes recibieron más de 2 antibióticos en 1978, 1982 y 2012, respectivamente (p <0,05 para el año 2012 en comparación con 1978 o 1982). 4. Se completaron un total de 316 cuestionarios; dosis de antibiótico, vía de administración y duración del tratamiento se ajustaron siempre según la localización de la infección y las condiciones subyacentes en un 65%, 68% y 45%, respectivamente. La desescalada antibiótica fue reconocida como práctica habitual en el 20%; las posibles resistencias microbiológicas y el coste económico fueron considerados en un 31% y el 10% respectivamente; el 69% admite la administración de AB con, probablemente, ninguna indicación clínica. Conclusiones: 1. De 1265 pacientes ingresados en el HCUVA, 602 (49%) recibieron tratamiento antibiótico. Los antibióticos más usados fueron ceftriaxona y levofloxacino en los tratamientos terapéuticos y amoxicilina/ clavulánico en los profilácticos. La elección del antibiótico según protocolo fue adecuada en un 68,9% con una curación del 72,13%. 2. Como factores independientes asociados a peor evolución en el análisis multivariante encontramos, el tratamiento empírico y dirigido no adecuado a protocolo ; infección por E.coli multiresistente con BLEE y/o R a ciprofloxacino ; duración no adecuada del tratamiento antibiótico y la gravedad clínica inicial crítica 3. Como patrones de cambio en 2012 encontramos que el uso de antibióticos se asoció de forma significativa, con mayor adecuación, incremento de las prescripciones en los Servicios Médicos y aumento de la monoterapia como principal régimen terapéutico en comparación a los estudios de 1978 y 1982. No encontramos diferencias de su consumo entre 1978 y 2012. 4 .Las respuestas obtenidas en esta encuesta ponen de manifiesto el aparentemente limitado conocimiento de los médicos hospitalarios Objetives: 1. To descriptive the use of antibiotics in the Clinical Univertitary Hospital Virgen de la Arrixaca (HCUVA). 2. To analyze factors associated to “failure” in patients under antibiotic treatment with infectious process 3. To analyze antibiotic prescription (ABP) at our hospital comparing 3 different periods of time with different ABP policies (ABPP). 4. To evaluate knowledges attitudes and practices of antibiotic prescribing among doctors at a university hospital. Patients and methods: 1. all patients receiving an antibiotic treatment along April 2012 were prospectively observed. 2. Factors associated to mortality and clinical failure were analyzed. Failure was defined as microbiological failure, relapse or death. Statistically significance was established as p<0.05 3. all ABP per in-patients along April were analyzed and compared in 1978 (no special ABPP), 1982 (an infectious diseases comity was created and general lines of ABPP were established) and 2012 (ABPP were well established and defined including guidelines by infection and severity). Statistically significance was established as p<0.05 4. self-administered questionnaires. Results: 1. 602 of 1265 admitted patients during the study month included an AB in their medical prescriptions, being 178 considered as prophylactic AB prescriptions and 342 as empiric treatments. Ceftriaxone and levofloxacin were the most frequent AB; 69% of the 424 AB (non prophylactic) treatments were considered as adequate. 2. Clinical failure was recognized in 110 cases (27%), microbiological failure in 49 (13%), relapse in 31 (8%) and death in 30 (7.5%). Factors associated to “failure” were and Charlson score ≥3 ( OR 3.35, 95% CI 1.602-7.009); inadequate empirical treatment (OR 5.68, 95%CI 2.898-11.217) and ESBL producing E. coli isolation (OR 4.43 (95% CI 1.492-13.184). 3. in 1978, 46% of admitted patients included an AB in their treatments, 33% in 1982 and 49% in 2012 (p<0.05 as for 1982 compared to 1978 or 2014). As for medical departments, AB prescription affected 37%, 47% and 59% of the patients, in 1978, 1982 and 2012 respectively (p<0.05). Rate of adequacy was 49%, 53% and 69% in the 3 different periods (p<0.05 as for 2012 compared to 1978 or 1982); 35%, 32% and 21% of the patients received >2 antibiotics in 1978, 1982 and 2012 respectively (p<0.05 as for 2012 compared to 1978 or 1982). 4. a total of 316 questionnaires were completed; antibiotic dose, route of administration and treatment duration were always adjusted according to site of infection and underlying conditions in 65%, 68% and 45%, respectively. Antibiotic de-escalation was recognized as usual practice in 20%; 31% and 10% considers potential microbiological resistances and economical-cost when taking prescription decisions, respectively; 69% admits AB administration with probably no clinical indication. Conclusions: 1. 49% of admitted patients received antibiotic treatment, being ceftriaxone and levofloxacin the most used antibiotic in therapeutic and amoxicilin/ clavulanic in prophylactic. The choice of antibiotic was adequate in 68.9% with a 72.13% succes rate. 2. E.coli ESBL and / or R to ciprofloxacin; inadequate duration of antibiotic treatment and initial clinical severity is associated to clinical or microbiological failure and death. 3. increasing higher rates of in-patients include an AB in their treatments, being monotherapy and prescription in medical departments more frequent in the recent cohort. The rate of adequacy is higher in 2012 than in previous cohorts, probably related to the implement of ABPP 4. answers of questionary shows the apparently limited knowledge of physicians so an antibiotic stewardship program is needed in our hospital .