Browsing by Subject "Genética molecular"

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    Abordaje de estudio genético del cáncer de ovario epitelial de alto grado sensible a derivados del platino mediante técnicas de secuenciación masiva con un amplio panel de genes
    (Universidad de Murcia, 2023-10-31) García Aliaga, Ángeles; Ruiz Espejo, Francisco; Sarabia Meseguer, Mª Desamparados; Alonso Romero, José Luis; Escuela Internacional de Doctorado
    El cáncer de ovario es el cáncer ginecológico con una mayor mortalidad, representando el cáncer de ovario seroso de alto grado el 75% de esta patología, caracterizada por tener un curso agresivo y diagnosticarse en estadios avanzados. Uno de los criterios de inclusión según la Sociedad Española de Oncología Médica de alto riesgo para el síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario (SCMOH) es el diagnóstico de cáncer de ovario epitelial de alto grado no mucinoso. El SCMOH presenta un patrón de herencia autosómica dominante en genes de susceptibilidad al cáncer. Históricamente, el riesgo de SCMOH ha estado principalmente vinculado a mutaciones germinales en BRCA1/2. Sin embargo, actualmente también se encuentra asociado a genes supresores de tumores implicados en la reparación del ADN. El cáncer de ovario de alto grado se evidencia por ser genéticamente inestable y aproximadamente un 50% de estos tumores presentan deficiencia en los mecanismos de reparación del ADN mediante recombinación homóloga. El rendimiento diagnóstico obtenido en el estudio genético de CO ha sido del 22% en la población BRCA. Este dato justifica la importancia de incluir este fenotipo en los criterios de selección de la SEOM para el estudio del síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario. El estudio genético del CO, a través de un panel de genes de accionabilidad clínica relacionados con diversos síndromes hereditarios, logra aumentar el rendimiento diagnóstico con respecto solo el estudio de los genes BRCA1 y BRCA2. Por tanto, se hace necesario su inclusión en la práctica clínica. Desde un punto de vista clínico, un 52% de las variantes obtenidas han sido clasificadas como VP y un 48% como VUS. Al ampliar el estudio genético a un panel de genes, el número de VUS obtenidas se ve incrementado y pueden superar, incluso, en número a las VP. Es por ello, que el laboratorio debe de disponer de un registro actualizado de las VUS obtenidas y proceder a su reevaluación de forma periódica con el fin de lograr su clasificación clínica de forma inequívoca. Desde el punto de vista molecular, y en concordancia con la bibliografía, un 65% de las VP obtenidas han sido variantes tipo frameshift o de cambio del marco de lectura. Con respecto a las VUS obtenidas, un 87% han sido de tipo missense o con cambio de sentido, lo que dificulta su clasificación clínica en aquellos casos en donde no se disponga de información suficiente. El análisis de supervivencia del CO, en función de la respuesta al tratamiento en primera línea con derivados de platino, presenta un mejor pronóstico en el fenotipo sensible con respecto a los fenotipos parcialmente sensibles o resistentes. Este fenotipo sensible se comporta igual en presencia o ausencia de VP en los genes BRCA1/2, por lo que debe compartir características biológicas similares independientemente del genotipo BRCA. El uso de técnicas NGS para secuenciar un amplio panel de genes, genera una gran cantidad de VUS. Para facilitar y optimizar el manejo de estas variantes es indispensable el uso de algoritmos de priorización de VUS. Gracias a este algoritmo se ha podido reclasificar un 8% de las VUS obtenidas como priorizadas según las evidencias de patogenicidad, siendo una herramienta imprescindible en la práctica asistencial.
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    Análisis de biomarcadores genómicos, celulares y serológicos como predictores de rechazo o tolerancia en el trasplante renal
    (Universidad de Murcia, 2024-11-20) Jiménez Coll, Victor; Muro Amador, Manuel; Botella Martínez, Carmen; Escuela Internacional de Doctorado
    Objetivos: El objetivo principal de esta tesis es identificar y analizar nuevos biomarcadores que mejoren la detección precoz del rechazo y optimicen la terapia inmunosupresora en el contexto del trasplante renal. Para alcanzar este objetivo global, se plantean tres objetivos específicos: 1) Destacar, de entre los biomarcadores serológicos, celulares y genómicos emergentes, aquellos con mayor potencial para la detección temprana y precisa del rechazo en trasplantes renales. 2) Analizar la relación entre la activación de subpoblaciones de linfocitos T CD8+ y la necrosis tubular aguda (ATN) en pacientes trasplantados, y determinar si esta activación puede servir como biomarcador predictivo para identificar a los pacientes con mayor riesgo de desarrollar ATN en el primer mes postrasplante. 3) Evaluar la relación entre los niveles de antígenos de maduración de células B (BCMA) antes del trasplante y la reactivación temprana del citomegalovirus (CMV) en pacientes trasplantados, y analizar si los niveles elevados de BCMA pueden predecir una mayor carga viral de CMV tras el trasplante. Metodología: Este trabajo incluyó una revisión bibliográfica y dos estudios observacionales prospectivos en pacientes que recibieron trasplante renal. La revisión bibliográfica se basó en estudios publicados en los últimos 10 años en revistas revisadas por pares, centrados en biomarcadores serológicos, celulares y genómicos con aplicaciones clínicas en el trasplante renal. Para la búsqueda se utilizaron bases de datos científicas reconocidas como PubMed, Scopus y Web of Science. El primer estudio experimental incluyó a 31 pacientes trasplantados renales y 17 controles sanos. Se recolectaron muestras de sangre periférica durante el primer año postrasplante en diversos momentos: semanas 1 y 2, y meses 1, 2, 3, 6 y 12. Las células mononucleares fueron aisladas mediante gradiente de densidad y analizadas por citometría de flujo para cuantificar subpoblaciones de linfocitos T CD8+, midiendo los marcadores de activación CD25, CD69 y CD95. El segundo estudio incluyó a 30 pacientes seropositivos para CMV-IgG, todos ellos con injertos funcionantes al menos un mes después del trasplante. Los pacientes fueron seguidos durante los tres primeros meses postrasplante para monitorizar la reactivación del CMV mediante qPCR. Se recolectaron muestras de sangre periférica con EDTA antes del trasplante y a los 3 y 6 meses postrasplante. Las células leucocitarias se aislaron y se evaluaron los niveles de transcripción de BCMA, BAFF-R, TACI y otros marcadores mediante qPCR. Además, se analizaron las subpoblaciones de linfocitos B mediante citometría de flujo. Conclusiones: Los biomarcadores serológicos, celulares y genómicos emergentes han demostrado un gran potencial para mejorar la detección temprana y precisa del rechazo en trasplantes renales, superando las limitaciones de los métodos tradicionales. En particular, la activación de los linfocitos T CD8+, evaluada a través de los marcadores CD25, CD69 y CD95, se asocia directamente con la aparición de ATN en receptores de trasplante renal, lo que sugiere que estas células desempeñan un papel crucial en la lesión inmunomediada del injerto durante las primeras etapas postrasplante. Los niveles elevados de estos marcadores demostraron ser altamente predictivos para identificar a los pacientes con mayor riesgo de desarrollar ATN. Además, los niveles elevados de transcripción de BCMA antes del trasplante en pacientes receptores de injertos renales están asociados con la reactivación temprana del CMV postrasplante. La medición de estos niveles podría ser utilizada como un biomarcador clínico para predecir el riesgo de reactivación viral, facilitando una mejor gestión de las complicaciones asociadas al CMV tras el trasplante renal.
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    Análisis genómico y transcriptómico de caracteres ligados a la calidad del fruto en Albaricoquero
    (Universidad de Murcia, 2020-02-06) García Gómez, Beatriz Ester; Martínez-Gómez, Pedro; Ruiz González, David; Escuela Internacional de Doctorado
    El albaricoquero (Prunus armeniaca L.) es uno de los cultivos con mayor valor agronómico a nivel mundial, destacando su fruto por su calidad gustativa muy apreciada por el consumidor y como un alimento funcional con propiedades nutricionales y bioactivas, notablemente beneficioso para la salud humana. La adquisición de los caracteres de calidad tiene lugar durante la fase final de maduración del fruto, el cual es un proceso coordinado en el que se produce un cambio en la expresión de cientos a miles de genes, modificando numerosos procesos bioquímicos y fisiológicos que darán lugar a los rasgos característicos de calidad del fruto. En este contexto, la mejora de la calidad del fruto es uno de los objetivos prioritarios a conseguir en las nuevas variedades desarrolladas por los programas de mejora genética del albaricoquero. El objetivo de esta Tesis Doctoral es avanzar en el análisis genómico y transcriptómico de los mecanismos moleculares implicados en la expresión de caracteres asociados a calidad del fruto en albaricoquero a fin de identificar y validar genes candidatos ligados a la expresión de caracteres de calidad para posibilitar el desarrollo de marcadores moleculares específicos, aplicables a la selección asistida en los programas de mejora de la especie. Desde el punto de vista genómico, dos poblaciones segregantes fueron fenotipadas y genotipadas. Se saturó con nuevos marcadores de ADN los Grupos de Ligamiento (GLs) 3 y 4, donde trabajos anteriores habían localizado Quantitative Trait Loci (QTL) para caracteres ligados a calidad del fruto, permitiendo la identificación de QTLs significativos vinculados a rasgos fenológicos y de calidad del albaricoque, la identificación de genes candidatos y la validación biológica de estos QTL a través del análisis de expresión génica mediante el uso de qRT-PCR. En el análisis QTL, los resultados más relevantes muestran QTLs muy significativos ligados al color de la piel del fruto en GL3 y a la fecha de maduración en GL4. Es destacable la co-localización NAC cerca del QTL de fecha de maduración en el GL4; y un gen que codifica un factor de transcripción MYB10 cerca del QTL de color de la piel en el GL3. El análisis de ambos genes mediante el uso de qRT-PCR valida estos análisis QTLs. En una segunda etapa, los transcriptomas de dos genotipos de albaricoque de la misma población segregante F1 con características fenotípicas divergentes fueron secuenciados (RNA-Seq) en tres etapas de desarrollo durante la maduración del fruto. Varios genes son propuestos como genes candidatos implicados en las rutas de biosíntesis de fenilpropanoides, flavonoides, antocianinas y carotenoides; el metabolismo del almidón y la sacarosa; los transportadores de metabolitos secundarios; la degradación de la pared celular y la pérdida de firmeza; el metabolismo del etileno; la degradación de las clorofilas; y los factores de transcripción y los reguladores del crecimiento que intervienen en la regulación del proceso de maduración. De este análisis, los genes candidatos DIOXIGENASA DE CAROTENOIDES 4 y una SACAROSA SINTASA han sido validados como genes clave en el color amarillo claro/blanco del fruto y el alto contenido de sólidos solubles. Finalmente, fue analizada la dinámica de expresión de los genes candidatos obtenidos a partir de los resultados de QTLs y RNA-Seq fue analizada durante el proceso de maduración del fruto en nueve variedades de referencia de albaricoquero que reúnen una gran variabilidad en el color de piel y pulpa, fecha de maduración, acidez y firmeza del fruto. La construcción de modelos de regresión lineal múltiple (MLR) para el contenido de antocianinas y carotenoides permitió la evaluación de los genes que tenian una mayor influencia dentro del modelo, siendo estos genes candidatos clave durante la biosíntesis de los metabolitos estudiados o la regulación del proceso de maduración. Como resultado, se ha obtenido un modelo con un alto porcentaje de explicación y ajuste adecuado para la biosíntesis de carotenoides. Los genes CHALCONA SINTASA y 4-CUMARATO-COA LIGASA, implicados en la biosíntesis de antocianinas, se describen como genes clave en el contenido de antocianinas; mientras que la DIOXIGENASA DE CAROTENOIDES 4, responsable de la degradación de los carotenoides y cuya expresión está ligada al color amarillo claro del fruto, junto con la ZETA-CAROTENO DESATURASA, se validan como genes clave para el contenido de carotenoides y el color del fruto. En relación con el proceso de maduración, la LIPOXIGENASA 2 y el factor de transcripción MADS-BOX se proponen como genes candidatos para el seguimiento de la progresión del proceso de maduración en el albaricoque. A partir de los resultados obtenidos en este análisis genómico-transcriptómico integrado, el siguiente paso será identificar polimorfismos genéticos en estos genes candidatos vinculados a polimorfismos fenotípicos, con el fin de desarrollar marcadores de ADN específicos para su uso en la selección asistida por marcadores moleculares (marker-assisted selection, MAS), y así aumentar la eficiencia de los programas de mejora de albaricoquero mediante la selección precoz de genotipos con alta calidad del fruto.
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    Caracterización molecular y prevalencia de las variantes genéticas en BRCA1/2 en el síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario en la Región
    (2014-11-11) Gabaldó Barrios, Xavier; Alonso Romero, José Luis; Ruiz Espejo, Francisco; Sarabia Meseguer, Mª Desamparados; Facultad de Medicina
    PALABRAS CLAVE: BRCA1, BRCA2, BRCAX, Síndrome de Cáncer de Mama y Ovario Hereditario, variante patogénica, variante de significado clínico desconocido, variante de efecto fundador. RESUMEN: El cáncer de mama es la principal causa de mortalidad por cáncer en las mujeres en todo el mundo, con una estimación de 1,68 millones de nuevos casos y más de 521.000 muertes sólo en 2012. Las mujeres con una historia familiar de cáncer de mama tienen de 1,5 a 3,9 veces más probabilidades de desarrollar cáncer de mama que las mujeres sin antecedentes familiares, en función del número y grado de parentesco de los miembros de la familia afectados. Aunque esta asociación podría surgir a causa del entorno compartido y estilo de vida, también puede ser debido a la susceptibilidad genética heredada. Los genes con mayor penetrancia y prevalencia en el Síndrome de Cáncer de Mama y Ovario Hereditario (CMOH) son BRCA1 y BRCA2, los cuales explican el 20% de este síndrome. Se ha realizado una caracterización molecular y un análisis de prevalencia de las variantes encontradas de BRCA1 y BRCA2 en 396 familias de riesgo de CMOH de la Región de Murcia. Para la secuenciación de exones y zonas colindantes de BRCA1 y BRCA2 hemos empleado el método de modificación de Sanger por secuenciación automática de electroforesis capilar y la pirosecuenciación (Gs Junior 454, Roche Diagnostics). El screening de los reordenamientos genéticos se realizó por tecnología MLPA. Para la comprobación de los reordenamientos detectados utilizamos la tecnología de PCR a tiempo real y para demostrar el efecto fundador de las variantes patogénicas de nueva descripción con más de una familia no relacionada se realizó análisis de microsatélites. El 17,7% de las familias es portadora de alguna variante patogénica en BRCA1/2 y el 11,49% fueron variantes de significado clínico desconocido. Siete variantes patogénicas fueron de nueva descripción, de las cuales c.1918C>T (BRCA1) proviene de un ancestro común en nuestra Región. Se han identificado variantes de efecto clínico desconocido de mayor probabilidad patógena según estudios in silico. Las variantes de efecto clínico desconocido missense de mayor probabilidad patógena han resultado ser c.946A>G (BRCA1), c.3032C>G (BRCA2), c.7559G>T (BRCA2) y c.9875C>T (BRCA2); mientras que las variantes splicing de mayor probabilidad patógena han sido c.68-7T>A (BRCA2), c.7008-14delT (BRCA2) y c.4501+3A>T (BRCA2). Los pacientes portadores de una variante patogénica en BRCA1/2 tienen mayor riesgo de tener un cáncer bilateral de mama y cáncer de mama en varón que en el resto de pacientes BRCAX. Existe asociación entre los pacientes BRCA1+ y los cánceres de mama triple negativo, con mayor presentación del tipo histológico medular. Los cánceres de ovario BRCA1/2+ suelen ser de tipo histológico seroso y existe una mayor prevalencia de este tipo de cáncer en BRCA1 con respecto a BRCA2 en nuestro estudio (33% vs. 16,7%, respectivamente). ABSTRACT: Breast cancer is the leading cause of cancer death in women worldwide, with an estimated 1.68 million new cases and 521,000 deaths in 2012. Women with a family history of breast cancer are 1.5 to 3.9-fold more likely to develop breast cancer than women without a family history, depending on the number and degree of kinship of the affected family members. Although this association could arise because of the shared environment and lifestyle, it can also be due to inherited genetic susceptibility. BRCA1 and BRCA2 are genes with greater penetrance and prevalence in Hereditary Breast and Ovarian Cancer (HBOC), but account 20% of these cancers. In this study we performed a molecular characterization and analysis of prevalence of BRCA1 and BRCA2 mutations in 396 families at risk of HBOC in the Region of Murcia. For sequencing of exons and adjacent areas of BRCA1 and BRCA2 genes, we used the method of modification of Sanger sequencing by automated capillary electrophoresis and pyrosequencing (Junior Gs 454, Roche Diagnostics). The screening of gene rearrangements was performed by MLPA technology. For the verification of detected rearrangements we used real-time PCR and to demonstrate founder effect of novel pathogenic variants with more than one unrelated family, microsatellite analysis was performed. The 17.7% of families are carriers of a pathogenic variant in BRCA1/2 and 11.49% are unknown variants. Seven pathogenic variants were novel, which c.1918C> T (BRCA1) comes from a common ancestor in our region. Have been identified unknown variants of increased pathogenic probability according to in silico tools. Missense variants of unknown clinical effect likely pathogenic were c.946A>G (BRCA1), c.3032C>G (BRCA2), c.7559G>T (BRCA2) and c.9875C>T (BRCA2); while splicing variants likely pathogenic were c.68-7T>A (BRCA2), c.7008-14delT (BRCA2) and c.4501+3A>T (BRCA2). BRCA1/2 carriers are at increased risk of having a bilateral breast cancer and male breast cancer than patients BRCAX. There is an association between BRCA1+ patients and triple negative breast cancers with medullary histological type overpresentation. Ovarian cancer BRCA1/2+ are usually serous histological type and there is a higher prevalence of this type of cancer in BRCA1 regarding BRCA2 (33% versus 16.7%, respectively).
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    Control ambiental de la división y diferenciación celular en levaduras con fisión
    (Universidad de Murcia, 2022-02-21) Gómez Gil, Elisa; Cansado Vizoso, José; Madrid Mateo, María Isabel; Escuela Internacional de Doctorado
    Las rutas de señalización intracelular mediadas por las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs), juegan un papel fundamental en las células eucariotas durante la respuesta adaptativa frente a cambios ambientales y condiciones adversas. El citoesqueleto de actina constituye una compleja red de polímeros que desempeñan un papel esencial durante la ejecución de procesos fundamentales para la célula como son la motilidad, la endocitosis, el crecimiento polarizado y la citocinesis. El correcto ensamblaje y organización de los polímeros de actina depende en gran medida de la activación y/o inhibición coordinada de un elevado número de proteínas evolutivamente muy conservadas que participan en diferentes cascadas de señalización, incluyendo las rutas de señalización mediadas por MAPKs. La levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe constituye un excelente modelo para el estudio de los mecanismos que activan dichas rutas, así como de los procesos que estas regulan, pues su genoma está evolutivamente muy conservado en relación con el de eucariotas superiores, y además presenta una gran versatilidad para la realización de estudios genómicos, bioquímicos, y celulares. Sin embargo, aunque tradicionalmente se ha empleado a S. pombe como organismo modelo en investigación, en los últimos años también está adquiriendo gran relevancia Schizosaccharomyces japonicus, otra de las cuatro especies que componen este género. S. japonicus fue la primera especie en distanciarse evolutivamente de las demás especies del género, y, a pesar de no ser patógeno, es un organismo dimórfico que puede crecer como levadura o diferenciarse para formar hifas en respuesta a distintas señales ambientales. S. pombe y S. japonicus también muestran diferencias notables en procesos biológicos tales como la remodelación de la envuelta nuclear durante la mitosis, el posicionamiento del plano de división, o la regulación de la polaridad celular. En base a estas y otras diferencias, ambas especies de levadura constituyen modelos óptimos para la realización de estudios evolutivos en el campo de la biología celular. Así, la presente Tesis Doctoral se ha focalizado en la caracterización funcional de las rutas de MAPKs de respuesta a estrés (SAPK) y de integridad celular (CIP) en las levaduras de fisión desde un punto de vista evolutivo, y su posible papel como reguladores de la morfogénesis. Para ello he planteado el abordaje de dos objetivos fundamentales: 1. Conservación evolutiva de las rutas de MAP quinasas activadas por estrés y de integridad celular en el género Schizosaccharomyces, y su papel como reguladores del dimorfismo en S. japonicus. 2. El estudio de las MAPKs activadas por estrés como reguladoras de la integridad del citoesqueleto de actina y la citocinesis en levaduras del género Schizosaccharomyces. Para la consecución de los objetivos anteriormente descritos se han empleado tanto cepas silvestres como distintos mutantes de S. pombe y S. japonicus obtenidos mediante manipulación genética o procedentes de otras fuentes (grupos de investigación y colecciones de cepas), así como diferentes técnicas experimentales. Estas incluyen: i- la construcción de cepas mutantes de levadura mediante manipulación genética (deleciones; mutagénesis dirigida; fusión de genes a epítopos específicos), ii- técnicas de biología molecular (PCR; qPCR; análisis RNAseq), iii- análisis de proteínas (marcaje y purificación de proteínas; SDS-PAGE; detección del estado de fosforilación y de los niveles de proteína mediante Western blot; inmunoprecipitación; ensayos de fosforilación in vivo/in vitro; tecnología PhosTag), y iv- técnicas de microscopía (microscopía time-lapse de fluorescencia de tipo confocal y wide-field). Los resultados obtenidos durante la realización de esta Tesis has permitido extraer las siguientes conclusiones: - La arquitectura del módulo de MAPKs de integridad celular se encuentra fuertemente conservada en S. pombe y S. japonicus, mientras que los activadores aguas arriba del módulo, los ortólogos de PKC Pck1 y Pck2, regulan antagónicamente la transición dimórfica en S. japonicus mediante el control preciso de la actividad de la MAPK Pmk1. Además, en S. japonicus Pmk1 posee una estructura secundaria única evolutivamente diferente que permite que la señalización mediada por la ruta CIP cumpla con los requisitos específicos de desarrollo de esta especie de levadura de fisión. - S. japonicus presenta un mecanismo de percepción del quórum dependiente de la densidad celular mediado por la liberación de alcoholes aromáticos que, junto con la ruta de MAPKs activada por estrés (SAPK), modula negativamente la transición dimórfica levadura-hifa en respuesta a estímulos ambientales. - La ruta de MAPKs activada por estrés (SAPK) regula negativamente el ensamblaje del anillo contráctil de actomiosina (CAR) en S. pombe mediante la reducción de los niveles de proteína de la formina For3 en respuesta a daños en el citoesqueleto de actina inducidos con Latrunculina A. Por el contrario, esta ruta modula de forma positiva el ensamblaje del CAR en S. japonicus, reflejando así la adaptación evolutiva que dicha cascada de señalización ha experimentado en respuesta a las marcadas diferencias que existen entre ambas levaduras de fisión en cuanto a la ejecución de la citocinesis.
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    Development of new therapies based on the non-canonical functions of the RNA component of telomerase
    (Universidad de Murcia, 2021-02-05) Martínez Balsalobre, Elena; Mulero Méndez, Victoriano Francisco; Sepulcre Cortés, María Pilar; Cayuela Fuentes, María Luisa; Escuela Internacional de Doctorado
    La telomerasa es un complejo ribonucleoproteico compuesto principalmente por una subunidad catalítica con actividad retrotranscriptasa (telomerase reverse transcriptase, TERT) y un componente de RNA (telomerase RNA component, TERC), encargado del mantenimiento de los telómeros. Sin embargo, diversos estudios sostienen que ambos componentes realizan diversas funciones más allá del mantenimiento telomérico. En concreto, nuestro laboratorio ha descubierto que TERC regula la mielopoyesis, tanto en pez cebra como en humano. Los objetivos de este trabajo son: 1. Caracterización molecular de los dominios TERC responsables de su función hematopoyética. 2. Desarrollo de aptámeros derivados de TERC para tratar enfermedades hematológicas. 3. Identificación del interactoma de TERC. Metodología, resultados y conclusiones: Durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral se han aprovechado las incuestionables ventajas del pez cebra para estudiar el papel de terc en la mielopoyesis, caracterizando la implicación funcional de cada uno de sus dominios en este proceso. Para investigar la función de cada dominio, se reprodujeron diferentes mutaciones que se encuentran con frecuencia en pacientes con disqueratosis congénita (DC) y se observó que solo las mutaciones que afectan al dominio CR4/CR5 alteran la mielopoyesis. Aprovechando el conocimiento funcional del dominio CR4/CR5 de TERC en la mielopoyesis, se desarrollaron varios aptámeros (pequeños oligonucleótidos sintéticos, capaces de reconocer específicamente y con gran afinidad moléculas diana). Dos de los aptámeros, CR4CR5 y AA, fueron capaces de estimular la mielopoyesis aumentando el número de neutrófilos y macrófagos, sin afectar el número de eritrocitos, e independientemente de la expresión de terc o la actividad de la telomerasa. Además, funcionaban como terc; es decir, interactuaron con la RNA polimerasa II y con las secuencias de unión a terc presentes en el promotor de los genes clave en la mielopoyesis, mejorando su expresión de manera dependiente del sitio de unión de terc. Es importante destacar que los aptámeros que albergan mutaciones en CR4/CR5, que se encuentran en pacientes con DC, no lograron realizar todas estas funciones. Además, los modelos preclínicos de pez cebra de DC (deficiencia de terc) y poiquilodermia con neutropenia (deficiencia de usb1) demostraron el potencial terapéutico de los aptámeros desarrollados para tratar la neutropenia. Finalmente, los aptámeros humanos correspondientes también aumentaron la expresión del gen mieloide promoviendo la mielopoyesis en células madre pluripotentes inducidas de humano. Por lo tanto, en este estudio se han desarrollado dos agentes terapéuticos potenciales para DC y otras enfermedades neutropénicas. Aunque profundizamos en las características estructurales y funcionales de TERC durante esta tesis, decidimos que aún era posible explorar su potencial más allá de su papel en la biología telomérica y su papel no canónico en la mielopoyesis. Por esta razón, se desarrolló un enfoque proteómico para aprovechar al máximo el potencial de TERC. De esta manera, se ha descubierto que TERC interactúa potencialmente con una multitud de proteínas, involucradas en varios procesos celulares, como el plegamiento, degradación (ubiquitinación) y traducción de proteínas, metabolismo de carbono y lípidos, desintegración de RNAm mediada por mutaciones de pérdida de sentido, biogénesis mitocondrial y ciclo celular. Por otro lado, terc con las mutaciones en el dominio CR4/CR5 encontradas en pacientes con DC mostró un interactoma similar a terc control, a pesar de que estas mutaciones alteran tanto la actividad de la telomerasa, como la regulación de la mielopoyesis dependiente de TERC. Este estudio es el primer paso hacia futuros estudios funcionales destinados a la caracterización de las funciones no canónicas de terc, que podrían ayudar a mejorar el diagnóstico y el tratamiento de pacientes con mutaciones TERC.
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    Edición de genes de tomate que codifican potenciales factores provirales para el virus del mosaico del pepino dulce
    (Universidad de Murcia, 2020-12-03) Rodríguez Sepúlveda, Pascual; Aranda Regules, Miguel Ángel; Donaire Segarra, Livia; Hernando Saiz, Yolanda; Escuela Internacional de Doctorado
    El virus del mosaico del pepino dulce (PepMV; especie Pepino mosaic virus, género Potexvirus; familia Alphaflexiviridae) es un virus de ARN de cadena sencilla y polaridad positiva que causa una de las principales enfermedades que afectan a los cultivos de tomate de todo el mundo, provocando importantes pérdidas económicas. En la actualidad, no se dispone de variedades de tomate comerciales resistentes a PepMV y las fuentes de resistencia descritas son poco apropiadas para su uso en programas de mejora. Así, la identificación de dianas genéticas para conseguir resistencia a este virus tiene un gran interés aplicado. Por otra parte, el sistema experimental PepMV/tomate está adquiriendo una importancia creciente, por lo que profundizar en el conocimiento de los aspectos moleculares de la interacción PepMV/tomate tiene, en sí mismo, un importante interés de tipo fundamental. En el primer capítulo de esta tesis, se describe la identificación de 21 proteínas de tomate que interaccionan con alguna de las proteínas de PepMV mediante un escrutinio en levadura, utilizando una genoteca de ADNc normalizado de plantas de tomate sanas e infectadas. El silenciamiento génico inducido por virus (virus induced gene silencing, VIGS) de los genes que codificaban estas proteínas no resultó en signos fenotípicos diferentes al de las plantas de genotipo silvestre (wild type, WT) en la mayoría de los casos. Las plantas silenciadas en los genes que codifican las proteínas RdRp-IP5, TGB1-IP12 y TGB2-IP18 mostraron una disminución de la acumulación de PepMV además de conservar un fenotipo similar al de las plantas WT. TGB2-IP12 estaba anotada funcionalmente como una serina/treonina quinasa, pero las otras dos proteínas no estaban anotadas. El análisis bioinformático de RdRp-IP5 sugiere que pertenece a la superfamilia de proteínas NTF2 con un posible papel en la respuesta a estreses bióticos, mientras que para TGB2-IP18 no encontró una posible función, aunque tiene un gen ortólogo en Arabidopsis thaliana anotado como parte del complejo citocromo b6f. La localización subcelular de estas proteínas fusionadas a proteínas fluorescentes mediante microscopía de barrido láser confocal en células sanas e infectadas de Nicotiana benthamiana resultó en la colocalización de RdRp-IP5 y TGB1-IP12 en estructuras similares a los complejos de replicación viral (viral replication complexes, VRCs) descritos previamente. Sin embargo, la proteína TGB2-IP18, mantuvo su localización en los cloroplastos de las células infectadas. Por último, se generaron mutantes de tomate knockout homocigóticos para los genes que codifican RdRp-IP5 y TGB1-IP12 respectivamente, y un mutante heterocigótico con un solo alelo editado para el gen que codifica TGB2-IP18 utilizando el sistema CRISPR/Cas9. En las plantas mutantes rdrp-ip5 y tgb2-ip18 no se alteró la acumulación de PepMV. Sin embargo, las plantas mutantes tgb1-ip12 infectadas mostraron un aumento de la acumulación del virus, lo que sugiriere que TGB1-IP12 pueda tener un papel durante la infección de PepMV en tomate. En el trabajo que se describe en el segundo capítulo, se obtuvieron 7 mutantes de tomate cv. Micro-Tom para los genes que codifican las proteínas interactoras de la TGB2 (TGB2-IP14-21) para analizar si alguna de estas proteínas tiene un papel durante la infección por PepMV. En los mutantes tgb2-ip19 y tgb2-ip21 infectados aumentó la acumulación del virus significativamente. TGB2-IP19 es una metiltransferasa tipo 11 dependiente de S-adenosilmetionina, mientras que TGB2-IP21 está anotada como proteína de función desconocida. El estudio in silico llevado a cabo sugiere la localización de TGB2-IP19 en el núcleo y el citoplasma y una posible implicación en la respuesta a estreses bióticos, mientras que para TGB2-IP21 se predijo una localización anclada a las membranas del retículo endoplásmico (RE) o mitocondriales y que puede que esté relacionada con algún proceso implicado en la respuesta a estrés biótico, aunque no se pudo predecir una función. En el trabajo descrito en el tercer capítulo, se expresó la TGB2 de PepMV fusionada a proteínas fluorescentes en N. benthamiana. Un análisis mediante microscopía de barrido láser confocal mostró una señal fluorescente que colocalizaba con un marcador específico de RE. La expresión de TGB2 fusionada a mRFP en plantas de N. benthamiana infectadas con PepGFPm2 resultó en la relocalización de la señal fluorescente de TGB2 al interior de los VRCs. Además, la coexpresión de TGB2 con su interactor TGB2-IP19 mostró una colocalización de la señal fluorescente en el núcleo y el citoplasma en plantas no infectadas, y una relocalización de la señal fluorescente de ambas proteínas a los VRCs en plantas infectadas con PepGFPm2
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    Estudio de biomarcadores predictores de miocardiopatías en pacientes genotipados
    (Universidad de Murcia, 2021-07-14) Díaz Muñoz, Julio Alberto; Ruiz Espejo, Francisco; Gimeno Blanes, Juan Ramón; Sabater Molina, María; Escuela Internacional de Doctorado
    HIPÓTESIS Las miocardiopatías son enfermedades del músculo cardiaco que presentan como características clínicas más comunes la dilatación ventricular, hipertrofia y arritmia cardiaca, sufriendo a menudo fallo cardíaco y muerte súbita cardiaca. En general, para las miocardiopatías es fundamental un diagnóstico diferencial temprano, pero, en individuos sanos portadores de mutaciones patogénicas, es crítico un seguimiento clínico periódico. Hasta ahora, la anamnesis, la evaluación clínica y las técnicas de imagen han sido las herramientas fundamentales para pronosticar el desarrollo de la enfermedad, pero están muy limitadas a la hora de adelantarse al inicio clínico de la misma. Las nuevas técnicas diagnósticas como los biomarcadores séricos podrían proporcionar una información adicional fundamental para estados presintomáticos de las miocardiopatías, ayudando a diagnosticarlas y estratificarlas de forma rápida y fiable. No obstante, en la actualidad no hay ningún biomarcador que cumpla estas características. OBJETIVOS 1) Estudiar los valores de los biomarcadores analizados, comparando sus valores en pacientes portadores afectados, portadores no afectados y un grupo control de no portadores sanos para cada una de las tres miocardiopatías. 2) Analizar el uso de los biomarcadores estudiados para identificar enfermedad subclínica en portadores de mutaciones patogénicas no afectados en las tres patologías. 3) Determinar la severidad de la enfermedad en base a las concentraciones de los distintos biomarcadores. 4) Relacionar la concentración de los distintos biomarcadores con la capacidad funcional, según la escala NYHA en cada una de las tres patologías. 5) Estudiar la posible asociación de los biomarcadores con las variables clínicas de las miocardiopatías. METODOLOGÍA Se ha realizado un estudio observacional transversal incluyendo pacientes evaluados prospectivamente en la consulta de cardiopatías hereditarias del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca (Murcia) desde 2005 hasta 2013 con diagnóstico de miocardiopatía familiar. Las muestras fueron procesadas en el Laboratorio de Diagnóstico Genético del Servicio de Análisis Clínicos del HCUVA, Murcia. CONCLUSIONES 1) Existe una asociación entre los diferentes estados clínicos (afectado, portador no afectado y sano) en las miocardiopatías de origen genético y los biomarcadores de inflamación, fibrosis, estrés parietal y de daño celular 2) En la miocardiopatía arritmogénica, los biomarcadores con valor diagnóstico en estados preclínicos son los marcadores de inflamación IL-6, CT-1 y la ratio CT-1/SOCS3. 3) En la miocardiopatía dilatada, el biomarcador con valor diagnóstico en estados preclínicos es el marcador de daño celular TnThs. 4) En la miocardiopatía hipertrófica, los biomarcadores con valor diagnóstico en estados preclínicos son, como marcador de inflamación SOCS3 y como daño celular TnThs. 5) En la miocardiopatía arritmogénica, los biomarcadores relacionados con severidad son, como marcadores de inflamación IL-6, SOCS3 y la ratio CT-1/SOCS3, como marcadores de estrés parietal NT-proBNP y ST2, como marcador de daño celular TnThs y como marcadores de fibrosis CICP, PINP y la ratio CICP/NTX. 6) En la miocardiopatía dilatada, los biomarcadores relacionados con severidad son como marcador de inflamación IL-6, como marcador de estrés parietal NT-proBNP, como marcador de daño celular TnThs y como marcador de fibrosis la ratio CICP/NTX. 7) En la miocardiopatía hipertrófica, los biomarcadores relacionados con severidad son como marcadores de inflamación IL-6 y la ratio CT-1/SOCS3, como marcador de estrés parietal NT-proBNP y como marcador de daño celular TnThs. 8) En la miocardiopatía dilatada, el biomarcador relacionado con peor capacidad funcional según la escala NYHA es el marcador de daño celular TnThs. 9) En la miocardiopatía hipertrófica, los biomarcadores relacionados con peor capacidad funcional según la escala NYHA son el marcador de estrés parietal NT-proBNP y el marcador de daño celular TnThs. 10) El biomarcador de estrés parietal NT-proBNP es el biomarcador que se asocian a un mayor número de variables clínicas en miocardiopatía arritmogénica, dilatada e hipertrófica.
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    Estudio de la expresión génica y polimorfismos relacionados con la espermatogénesis y la infertilidad
    (Universidad de Murcia, 2022-11-22) Cots Rodríguez, Paula; Avilés Sánchez, Manuel; Gómez Sánchez, Emilio; Escuela Internacional de Doctorado
    Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), la infertilidad es un problema de salud global que afecta a millones de personas en todo el mundo. La infertilidad se define como la incapacidad de concebir tras 12 meses de relaciones regulares sin protección. La prevalencia puede alcanzar el 10,5% de la población española, afectando a unas 900.000 parejas en dicho país. Objetivos Esta tesis se divide en dos diferenciados capítulos, que tienen como objetivo común aumentar el conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en la reproducción y, por tanto, mejorar el diagnóstico de la infertilidad y las tasas de reproducción asistida. En el primer capítulo se analiza la expresión génica de testículo para comprender los procesos moleculares implicados en el desarrollo del espermatozoide. Para ello, utilizamos un modelo de primate no humano, el babuino (Papio anubis). El segundo capítulo pretende mejorar los métodos de selección embrionaria, basándose en los polimorfismos presentes en genes potencialmente implicados en la implantación y desarrollo embrionario temprano. De esta forma se pretende aumentar las posibilidades de éxito en las transferencias de embriones. Metodología Para abordar el primer capítulo, se utilizaron 8 muestras testiculares, 4 de babuinos inmaduros y 4 de maduros. El estado de madurez se corroboró mediante características anatómicas e histológicas. El ARN de cada muestra se analizó mediante la tecnología RNA-seq. Los resultados obtenidos se procesaron mediante un análisis bioinformático, donde las secuencias se pseudoalinearon con los transcriptomas de referencia (Panubis1.0 y hg38) y se compararon entre los grupos (maduros e inmaduros). Los genes expresados diferencialmente (logFC≥|2| y FDR<0,01) se utilizaron para evaluar su posible papel en la espermatogénesis. En el segundo capítulo, se utilizaron muestras de ADN de 131 embriones, que habían sido sometidos a una biopsia. Por un lado, se diseñó un panel Ampliseq, eligiendo 33 genes relacionados con la implantación y desarrollo gestacional temprano. Con este panel se analizaron todos los embriones y se evaluaron los polimorfismos detectados en función del tipo de mutación, genotipo, localización en el gen, posible fenotipo patogénico y su prevalencia en la población. Por otro lado, se utilizó la tecnología KASP para evaluar los polimorfismos c.677C>T y c.1298A>C del gen MTHFR de todos los embriones transferidos. Los resultados de estos análisis genéticos se compararon con los resultados clínicos tras la transferencia embrionaria. Resultados y conclusiones El análisis transcriptómico RNA-seq de los testículos de babuino anotó un total de 15.297 genes distintos del genoma Papio anubis. El análisis de expresión diferencial entre testículos maduros e inmaduros detectó 2029 genes sobreexpresados y 555 subexpresados en los testículos maduros. Algunos de los nuevos genes que aparecieron en este estudio son SPATA18, SPATC1, TMEM262, ARRDC5, SPATA31D1, TMEM239, LEMD1, FAM187B, C3orf22, C11orf42, TMEM31, TSPAN16, CT83, C7orf61 y SLC9C2. Se detectaron un total de 1897 genes no codificantes, donde destacan SPACA6, LINC00303 y LINC01121. Tras la evaluación de los polimorfismos genéticos de los embriones humanos (panel Ampliseq), se destacaron ARHGAP21, ENG, STAT3, PMM2 y GATA4 como posibles genes implicados en la implantación y desarrollo embrionario temprano, pudiendo ser utilizados como marcadores de selección embrionaria. Se ha detectado un posible efecto deletéreo de las variantes polimórficas homocigóticas chr17:40481601 C>T (STAT3) y chr16:8904956 G>A (PMM2). Además, se ha detectado un posible efecto deletéreo en otras mutaciones no detectadas hasta ahora en la población, incluso en heterocigosis, como chr10:24909241 C>T, chr10:24909164 G>A y chr10:249090 TC>T (ARHGAP21), o chr9:130578295 CAG>C (ENG). No se pudo confirmar la relación entre los polimorfismos del gen MTHFR y el resultado clínico tras la transferencia embrionaria. Sin embargo, se ha descrito por primera vez un embrión portador de la combinación polimórfica c.677TT y c.1298AC del gen MTHFR, que no implantó.
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    Estudio molecular del sindrome X frágil / Guillermo Glover López ; director J.A.Lozano.
    (Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Genética y Microbiología,, 1992) Glover Lopéz, Guillermo
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    Identificación y estudio funcional de una proteína de choque térmico implicada en el mecanismo no canónico de silenciamiento génico de Mucor lusitanicus
    (Universidad de Murcia, 2021-10-27) Pérez Ruiz, José Antonio; Garre Mula, Victoriano; Navarro Ros, Eusebio; Escuela Internacional de Doctorado
    El silenciamiento génico fue descubierto en plantas en 1990. Posteriormente se observó su presencia en animales y en hongos. Desde entonces el silenciamiento génico se ha convertido en el protagonista de numerosos estudios científicos, generando la diversidad de rutas de silenciamiento génico existentes en la naturaleza un enorme interés. Las moléculas de RNA de doble cadena son las encargadas de desencadenar el mecanismo de silenciamiento génico o RNAi (interferencia de RNA), pudiendo tener un origen endógeno o exógeno. Este mecanismo es el encargado de reconocer los RNA diana complementarios a las cadenas guía generadas a partir del RNA de doble cadena. De este modo, la maquinaria de silenciamiento es capaz de degradar esos RNA diana. En Mucor lusitanicus existen dos rutas de silenciamiento, una ruta canónica y una ruta no canónica llamada NCRIP. R3B2 es la ribonucleasa protagonista de esta última, siendo una proteína con características poco comunes en la naturaleza, presente en Mucorales y que degrada RNA de una cadena. En este trabajo se ha identificado el interactoma de R3B2, que podría incluir a proteínas participantes en la ruta NCRIP. Realizando un ensayo de doble híbrido con una genoteca de cDNA, obtenida a partir del transcriptoma de M. lusitanicus, se identificó a una proteína Hsp70 que interacciona con R3B2. Esta proteína de choque térmico pertenece a la subfamilia más atípica de Hsp70, las HspA12. Esta familia presenta grandes diferencias a nivel de dominios con las demás familias de Hsp70 y, a partir de análisis filogenéticos, se ha observado la conservación y la expansión que se han producido de estas en determinadas especies, como M. lusitanicus. Además de identificar las regiones responsables de esta interacción, también se ha comprobado, mediante un ensayo de doble híbrido en levadura, que HspA12a no interacciona con otras proteínas del silenciamiento génico de M. lusitanicus. Se generaron mutantes carentes del gen hspA12a mediante recombinación homóloga. Estos mutantes crecían de manera deficiente a una temperatura de 30 ºC, 4 ºC por encima de su temperatura óptima de crecimiento (26 ºC), aunque un pequeño porcentaje de individuos (inferior al 1 %) era capaz de crecer a esa temperatura. Estos individuos transmitían esta capacidad de supervivencia a un 30 % de sus esporas. Este fenotipo de supervivencia desaparecía tras varios pases a 26 ºC, lo que hace pensar en una regulación de tipo epigenético. Durante estos ensayos aparecieron dos individuos capaces de crecer a 30 ºC de forma permanente, a los que se secuenció el genoma y se realizó una búsqueda de variantes génicas, encontrando varios candidatos causantes de ese crecimiento. Se ha comprobado que la expresión del gen hspA12a depende de la temperatura y aumenta cuando esta lo hace. Para comprobar si HspA12a está implicada en la ruta NCRIP, se analizó la expresión de genes regulados por esta ruta, mostrándose una participación esencial a 30 ºC, pero no a 26 ºC. Las pruebas realizadas indican que este gen no parece participar en la ruta canónica del silenciamiento, y que la región de HspA12a responsable de la interacción con R3B2 no afecta por si sola a la actividad ribonucleasa de R3B2. Los ensayos de virulencia en ratón, los mutantes en el gen hspA12a mostraron diferencias con el control virulento, con resultados más cercanos a los obtenidos para la estirpe avirulenta. A modo de conclusión, se ha identificado una nueva proteína del silenciamiento génico de M. lusitanicus que podría actuar estabilizando a la proteína R3B2 en condiciones de estrés, relacionada con la resistencia a altas temperaturas y que podría estar involucrada en la capacidad virulenta de este hongo.
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    Insects with forensic and agri-food implications : Fannia pusio (Diptera: Fanniidae) and Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae)
    (Universidad de Murcia, 2021-09-06) Bravo Pena, Yolanda; Galián Albaladejo, José; Romera Lozano, Elena; Escuela Internacional de Doctorado
    La información reunida en esta tesis aumenta el conocimiento de dos especies con objetivos diferentes en entomología aplicada. Los resultados obtenidos en la Parte I aportan información que pone de manifiesto la utilidad potencial de Fannia pusio (Wiedemann, 1830) en entomología forense, mientras que los resultados de la Parte II abarcan información sobre Tenebrio molitor (Linnaeus, 1758), una especie recientemente aprobada para fines alimentarios. Esta información permitirá ampliar el conocimiento de la biología, ecología y etología de los insectos para su aplicación. Fannia es un género de dípteros perteneciente a la familia Fanniidae con aproximadamente 300 especies; son atraídos por la materia orgánica en descomposición presentando hábitos necrófagos, lo que arroja luz sobre cuestiones criminológicas. Además de la importancia jurídica, tienen interés médico y económico, ya que son capaces de causar miasis en animales domésticos y en el ser humano. Por estas razones, debe realizarse una correcta identificación a nivel de especie donde los análisis moleculares se complementan con estudios morfológicos. El código de barras de ADN emplea un fragmento de 658 pb del genoma mitocondrial (cox1), pero en ocasiones las secuencias de este fragmento pueden estar contaminadas con restos de ADN externos; como alternativa está el uso de regiones cortas e internas (mini-barcode). En este trabajo mostramos cómo un fragmento de 240 pb es capaz de identificar correctamente las especies del género Fannia que se recolectaron a través de un muestreo por toda la Península Ibérica. La identificación molecular mostró a F. pusio como la especie más abundante presentando mutaciones particulares que permiten diferenciar los haplotipos de los individuos del noreste y del sureste. Las secuencias disponibles en las bases de datos analizadas junto con los resultados de este trabajo sugieren que la especie es originaria de América y que posteriormente se introdujo en la Península Ibérica a través de Portugal, sufriendo una continua expansión de su área de distribución. La variación en la forma de una selección de caracteres corporales es evaluada mediante la Morfometría Geométrica empleando la cabeza como estructura innovadora. El sexo debe tenerse en cuenta como una covariable clave en este tipo de estudios, ya que Fannia, como muchos otros dípteros, tiene una estructura de cabeza sexualmente dimórfica, con machos holópticos y hembras dicópticas. Nuestros análisis proporcionan información morfológica significativa donde F. pusio muestra una clara variación morfométrica intraespecífica a lo largo de un eje este-oeste en toda la Península Ibérica. Un patrón similar se obtuvo de una colonia criada en laboratorio frente a muestras silvestres. Las peculiaridades de comportamiento que presentan los insectos pueden aportar información adicional para futuras investigaciones. La aplicación de la entomología en el ámbito forense se ha centrado especialmente en los primeros taxones colonizadores de cadáveres en la fase inicial de descomposición. Sin embargo, las especies que aparecen en fases más avanzadas pueden contribuir a ampliar los conocimientos, como es el caso de F. pusio. Además, tiene la capacidad de colonizar cadáveres enterrados, condición en la que los dípteros de mayor tamaño son incapaces de hacerlo. En este trabajo se estudia su comportamiento en un rango de temperatura desde los 5 ºC hasta los 40 ºC, y las longitudes de los diferentes estadios para calcular el intervalo post-mortem (PMI) mediante los diagramas de isomorfen e isomegalen. Los resultados mostrados ayudan, junto con la bibliografía existente de otras especies, a ampliar el conocimiento de la entomofauna que se da en las investigaciones forenses. Por otro lado, el gusano amarillo de la harina, o T. molitor, es un escarabajo de la familia Tenebrionidae que ha sido recientemente aceptado por La Agencia Europea de Seguridad Alimentaria como especie segura para alimentación. El incremento de la población y el uso de proteína en piensos de animales, hace que los insectos se conviertan en los principales candidatos como alternativa prometedora sostenible por su alto contenido en proteína, grasas saludables y fibra, y su bajo coste de producción en comparación con el ganado convencional. En este trabajo presentamos una propuesta de una granja de T. molitor donde se analizan las condiciones óptimas de cría, el manejo, el cálculo de la producción anual en las instalaciones y la viabilidad económica para conocer la rentabilidad del proyecto. Con el auge de las granjas de insectos, las anomalías antes desconocidas son cada vez más frecuentes. En nuestras instalaciones se ha observado un desarrollo incompleto de la metamorfosis dando lugar a adultos con malformaciones en abdomen y élitros. Tres de los genes implicados en la vía metabólica de la esclerotización y melanización (TH, AANAT1 y Lac2) se analizan mediante RT-qPCR, utilizando un gen de referencia previamente validado (Rps3), para determinar el nivel de expresión de estos genes. Se eligieron individuos anómalos con la misma malformación e individuos normales y se utilizaron como controles y se observaron diferencias significativas.
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    Modo de acción molecular de CarH, el prototipo de una nueva familia de fotorreceptores dependientes de la vitamina B12 : plasticidad en su oligomerización, unión al DNA y diseño de su operador
    (Universidad de Murcia, 2018-12-07) Fernández Zapata, Jesús; Elías Arnanz, Montserrat; Padmanabhan Iyer, Subramanian; Escuela Internacional de Doctorado
    Para responder a la luz los organismos emplean proteínas fotorreceptoras. Se ha descubierto una familia de fotorreceptores bacterianos que utilizan como cromóforo un derivado de vitamina B12, la 5'-desoxiadenosilcobalamina (AdoCbl), un descubrimiento que reveló una nueva faceta biológica de esta vitamina como sensor de luz. El prototipo de dicha familia, CarH, es un represor transcripcional que generalmente regula la expresión fotoinducible de su propio gen, y de aquellos involucrados en la síntesis de carotenoides para mitigar el daño fotooxidativo. El mecanismo de acción más estudiado es el del homólogo de Thermus thermophilus, TtCarH. En oscuridad, ApoTtCarH es un monómero que, cuando se une a AdoCbl, forma un tetrámero capaz de unirse al DNA operador y reprimir la transcripción. La fotólisis de AdoCbl provoca el desensamblaje del tetrámero a monómeros incapaces de unirse al operador. Las estructuras del tetrámero de TtCarH, libre y unido al DNA, y del monómero expuesto a luz han proporcionado información a nivel atómico sobre su arquitectura y modo de acción, que ha sido corroborada por extensos análisis mutacionales e in vitro. Las proteínas CarH están formadas por un dominio autónomo N-terminal de unión a DNA (DBD) tipo hélice-“alada”, similar al de las proteínas MerR, conectado mediante un linker flexible a un dominio sensor de luz C-terminal también autónomo, de unión a cobalamina y responsable de la oligomerización que contiene dos subdominios: un haz de cuatro hélices α y un subdominio de plegamiento tipo Rossmann. Aunque el dominio sensor de luz de CarH es similar al módulo de unión a metilcobalamina de la sintetasa de metionina, CarH se une a AdoCbl, y esto depende de un motivo W-x(9)-EH que está conservado en los homólogos de CarH. En oscuridad, dos dominios C-terminal unidos a AdoCbl se agrupan con una disposición inusual cabeza-cola para formar un dímero, y dos dímeros se ensamblan como un tetrámero, posicionándose los cuatro DBDs en la superficie de la proteína. Esto resulta en un modo único de unión al DNA, donde el tetrámero de TtCarH utiliza tres de sus cuatro DBDs para unirse a tres repeticiones directas en tándem de 11 pares de bases (DRs) con una secuencia consenso 5’-nAnnTnnACAn-3’. La repetición central solapa con el elemento -35 del promotor reconocido por la RNA polimerasa asociada al factor A mayoritario. La pérdida del grupo 5'-desoxiadenosilo por la fotólisis de AdoCbl conlleva un desplazamiento del haz de hélices α respecto al plegamiento tipo Rossmann, lo que provoca la disociación del tetrámero y la pérdida de unión al DNA. En este trabajo también se describe un segundo homólogo de CarH, BmCarH, de la bacteria Gram-positiva Bacillus megaterium. ApoBmCarH es un glóbulo fundido que no es capaz de unirse al DNA. La unión de AdoCbl en la oscuridad, que depende del motivo conservado W-x(9)-EH, genera un tetrámero plegado correctamente que se une al DNA. En luz, el tetrámero se disocia a dímeros, y no a monómeros. El análisis de la unión al DNA de BmCarH-DNA reveló un diseño de operador similar al de TtCarH, que solapa con el elemento promotor -35 o -10, pero más grande por presentar una DR adicional. Curiosamente, BmCarH puede unirse al operador de TtCarH con tres repeticiones y TtCarH a tres DRs contiguas de un operador de BmCarH con cuatro repeticiones. La flexibilidad de unión al DNA exhibida por BmCarH puede estar relacionada con su linker más largo. En conjunto, los resultados revelan una plasticidad insospechada en el modo de oligomerización, arquitectura del operador y unión al DNA en los fotorreceptores de la familia CarH que tiene relevancia tanto en su función biológica como en su uso como herramienta en optogenética.
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    New mechanisms for regulating the response to photooxidative and oxidative stress in the bacterium Myxococcus xanthus and their evolutionary conservation
    (Universidad de Murcia, 2024-05-20) Bastida Martínez, Eva; Elías Arnanz, Montserrat; Padmanabhan Iyer, Subramanian; Escuela Internacional de Doctorado
    Estudios recientes han demostrado que la proteína transmembranal CarF es necesaria para la respuesta a la luz de la bacteria de suelo Gram negativa Myxococcus xanthus por su función como plasmaniletanolamina desaturasa (PEDS1), enzima que genera el enlace vinil-éter en los plasmalógenos (unos glicerofosfolípidos especiales que señalizan en estrés fotooxidativo en M. xanthus). El primer objetivo ha consistido en demostrar que los homólogos animales de CarF, conocidos como TMEM189, corresponden a la ampliamente buscada PEDS1 de mamíferos, y explorar el papel de estos lípidos en células humanas y dos animales modelo. Las células TMEM189-knockout mostraron una ausencia total de plasmalógenos, acompañada de una acumulación de sus precursores y de las especies minoritarias C14-Cer y C14-CerP con funciones señalizadoras, confirmando así que TMEM189 es la única PEDS en humanos. Además, la proteína de fusión EGFP-TMEM189 se localizó en el retículo endoplasmático (ER) y complementó la falta de TMEM189, mientras que los plasmalógenos posiblemente contribuyeron al transporte de proteínas ancladas a GPI desde el ER al Golgi. En el modelo invertebrado C. elegans, TMEM189 se localizó en la pared intestinal y dos posibles neuronas sensoriales, indicando un papel sensorial para los plasmalógenos, que no parecen tener una función antioxidante en C. elegans. En el modelo vertebrado pez cebra, la deficiencia de plasmalógenos retrasó el desarrollo, aumentó la inflamación basal y desencadenó la apoptosis de células mieloides. El segundo objetivo surgió de observar que FAD4, el homólogo vegetal de CarF, requiere una peroxirredoxina para su actividad. Por tanto, comprobamos si AhpC, la única peroxirredoxina conservada en M. xanthus y humanos, afecta a la actividad de CarF, y si participa en la respuesta al estrés inducido por peróxidos en la bacteria. La deleción de ahpC no afectó a la biosíntesis de plasmalógenos, pero produjo efectos pleiotrópicos, incluyendo defectos en crecimiento y siembra, y una mayor tolerancia a H2O2. Los análisis transcriptómicos revelaron la regulación positiva de la catalasa KatB, alteraciones en la homeostasis de hierro y azufre y en los sistemas de reparación de DNA y proteínas. Solo la complementación con ahpC bajo el control de su propio promotor restauró el fenotipo silvestre, mientras que los defectos de siembra fueron contrarrestados por piruvato sódico, que neutraliza específicamente H2O2. Puesto que M. xanthus carece de OxyR, que normalmente regula la expresión de catalasas y ahpC en bacterias Gram negativas, nos propusimos hallar qué factor induce katB en células deficientes en ahpC. Esto condujo al descubrimiento de PexR (peroxide regulation), que determina una proteína de tipo bEBP (bacterial enhancer-binding protein) que activa la expresión de promotores dependientes de σ54. En condiciones de estrés oxidativo, PexR activó la expresión de katB y ahpC al unirse a repeticiones (pseudo)palindrómicas aguas arriba de sus promotores dependientes de σ54. Sin embargo, PexR reprimió parcialmente la expresión de ahpC dependiente de σ70 bajo condiciones normales de crecimiento. Curiosamente, la eliminación conjunta de ahpC y katB o pexR resultó en letalidad sintética, resaltando el papel crucial de la inducción de katB mediada por PexR para la viabilidad de células deficientes en AhpC. La eliminación del dominio sensor GAF de PexR generó una forma constitutivamente activa (PexR∆GAF), contrarrestada por la expresión del dominio GAF en trans, lo que sugiere un rol inhibitorio para este dominio. Mutaciones en residuos conservados, que potencialmente forman un centro de hierro no hemo, también favorecieron cierta actividad constitutiva. Análisis transcriptómicos y de interacción proteína-DNA con PexR y PexR∆GAF purificadas mostraron que la acción reguladora de PexR se limita a katB y ahpC. En resumen, este trabajo revela un mecanismo novedoso de regulación de la respuesta al estrés por peróxido en bacterias, crucial para la supervivencia de M. xanthus.
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    Nuevos aspectos moleculares de la transducción de la señal luminosa en la bacteria Myxococcus xanthus
    (Universidad de Murcia, 2020-12-21) Pajares Martínez, Elena; Elías Arnanz, Montserrat; Iniesta Martínez, Antonio Ángel; Escuela Internacional de Doctorado
    La bacteria Myxococcus xanthus dispone de dos mecanismos para regular la síntesis de carotenoides, unos pigmentos que protegen a las células del estrés foto-oxidativo derivado de la producción de oxígeno singlete (1O2) en la luz: uno dependiente de B12 y otro independiente de B12. La transducción de la señal luminosa en la ruta de regulación independiente de B12 depende de la proteína CarF y la pareja de factores σ-ECF (extracytoplasmic function)/anti-σ CarQ/CarR. CarF, el elemento proteico que actúa más temprano en dicha ruta, no se asemeja a ningún fotorreceptor de luz azul conocido. Curiosamente, presenta similitud de secuencia con las proteínas eucarióticas de función desconocida denominadas TMEM189 o Kua (también presentes en humanos). Se desconoce cómo CarF contribuye a la detección de la presencia de 1O2 y de qué manera transduce dicha señal a CarR para provocar su inactivación (quizá mediante proteólisis dependiente de luz) y la liberación de CarQ. La similitud, aunque baja, entre CarF y algunas hidroxilasas y desaturasas de ácidos grasos sugiere que su papel en la carotenogénesis podría estar relacionado con algún cambio en la composición de ácidos grasos de la membrana. Además, dado que CarF interacciona con CarR y CarR con CarQ, las tres proteínas podrían constituir un complejo multiproteico de señalización en la membrana que podría estar asociado a los denominados microdominios funcionales de membrana (FMMs) (análogos a las balsas lipídicas de eucariotas) y que se caracterizan por la presencia de unas proteínas, las flotilinas, que les confieren consistencia y estabilidad. Se desconoce si, aparte de la respuesta carotenogénica, M. xanthus pone en marcha otros mecanismos para paliar el estrés provocado por la luz, que conlleven cambios en la expresión génica, más allá de los ya conocidos. En este trabajo se ha demostrado que CarF presenta una localización membranal en M. xanthus y que se requiere en la respuesta a la luz a través de la síntesis de unos fosfolípidos particulares, los plasmalógenos. Concretamente, CarF es la desaturasa, buscada durante décadas, encargada de generar el enlace vinil éter de los plasmalógenos, que son esenciales en la respuesta a la luz (a diferencia de sus precursores con enlace éter). Además, se ha profundizado en el estudio de otras proteínas (ElbD y MXAN_1676), previamente relacionadas con la síntesis de lípidos éter, demostrando que también están implicadas en la respuesta a la luz, participando en los pasos previos a la generación del enlace vinil éter. El análisis de la localización subcelular y mecanismo de inactivación de CarR ha revelado que dicha proteína se encuentra en la membrana tanto en oscuridad como en luz, y que su inactivación no parece llevarse a cabo mediante un proceso de proteólisis dependiente de luz. El estudio de la presencia de FMMs en M. xanthus y su posible relación con la respuesta a la luz ha puesto de manifiesto que M. xanthus presenta dos posibles flotilinas, con los dominios característicos de estas proteínas y una distribución subcelular similar a otras flotilinas, como las de Bacillus subtilis, formando “parches proteicos” en la membrana. Además, los resultados de este trabajo muestran que CarR se localiza preferentemente en la fracción membranal que suele estar enriquecida en FMMs. Por otro lado, los estudios de expresión global (microarrays y RNA-seq) han permitido identificar nuevos genes (dependientes e independientes de CarQ) implicados en la respuesta a la luz en M. xanthus, que forman parte de mecanismos relacionados con la defensa y regulación frente al 1O2 producido por el estrés foto-oxidativo. Esto sugiere que existen otras vías de percepción y respuesta a la luz, probablemente derivadas del estrés oxidativo generado tras la exposición continuada a la luz.
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    Regulación de la expresión de acetilcolinesterasa de células Caco-2 de adenocarcinoma colorrectal humano por el sistema colinérgico
    (Universidad de Murcia, 2018-02-09) Serrano Sánchez, Mª Isabel; Campoy Menéndez, Francisco Javier; Vidal Moreno, Cecilio Jesús; Facultad de Biología
    Las colinesterasas, acetilcolinesterasa (AChE) y butirilcolinesterasa (BuChE), hidrolizan la acetilcolina (ACh) y ejercen acciones no catalíticas, estando implicadas en los procesos de proliferación, diferenciación, morfogénesis, hematopoyesis, apoptosis y tumorogénesis. En estudios previos habíamos observado un gran aumento de la actividad AChE en las células Caco-2 al ser tratadas con un inhibidor reversible y específico de AChE, el BW284c51, lo que podría reflejar la existencia de un mecanismo regulador de los niveles de AChE activa. Así, el objetivo general de esta Tesis Doctoral fue obtener información sobre el posible mecanismo regulador de la actividad AChE mediado por los receptores de acetilcolina en las células de colon. La metodología incluye el empleo de cultivos de células Caco-2 y SW480 con agonistas y antagonistas colinérgicos, los ensayos colorimétricos para la medida de actividad AChE y los ensayos de reducción del MTT para la medida de la viabilidad celular. La cuantificación relativa de los mensajeros de los componentes del sistema colinérgico se llevó a cabo mediante RT PCR a tiempo real. Se realizaron análisis de sedimentación para determinar el contenido de formas moleculares de AChE y ensayos de Western blot para la detección de proteínas. Además se realizaron tinciones de Hoechst para la detección de células apoptóticas y tinciones histocitoquímicas de AChE. Los resultados de estos estudios revelaron la existencia de un mecanismo regulador de la AChE de las células de colon por el que aumenta la actividad AChE, en respuesta a una exposición prolongada de los receptores de acetilcolina a agonistas colinérgicos como el carbacol. Mediante el uso de cicloheximida se vio que el mecanismo de acción del carbacol requería la síntesis de nueva proteína AChE, además en los ensayos de Western blot se observó un aumento en el contenido de proteína AChE en células Caco-2 tratadas con BW. La variante 3’ del mensajero de AChE más abundante fue la de tipo H; además se observaron variantes 5’ con los exones E1c y E1e. Los cambios que producen carbacol y BW en la expresión del gen ACHE no explican el aumento observado en la actividad AChE. El patrón de formas moleculares de AChE en las células Caco-2 tampoco se vio modificado por el tratamiento con carbacol o con BW, siendo las formas moleculares predominantes en estas células las de tipos G1A y G2A. Por su parte, la tinción con Hoechst mostró que el carbacol no induce apoptosis en las células Caco-2. Además, el teñido histocitoquímico indicó que el aumento de actividad AChE por carbacol se produce de forma similar en todas las células tratadas, descartando que la sobrerregulación de AChE se deba a la inducción de apoptosis. Los tratamientos con quelantes de calcio demostraron un papel del calcio intracelular en el mecanismo de acción del carbacol que da lugar a su efecto sobrerregulador de AChE. Por último, los estudios con agonistas (acetilcolina, carbacol, nicotina, colina, oxotremorina M) mostraron que la activación tanto de los mAChR como de los nAChR produce un aumento de la actividad AChE, lo que sugiere que acetilcolina y carbacol ejercen su acción sobrerreguladora de AChE actuando sobre ambos tipos de receptores, tanto en las células Caco-2 como en las SW480. Los resultados de los ensayos de RT-PCR sugieren que en ambas líneas podrían formarse receptores nicotínicos de tipos homomérico α7 y muscular, junto a posibles heterómeros α3β4α5, α3β2β4α5 y α4β2α5, además de mAChR M3; aunque serán necesarios más estudios para caracterizar los distintos tipos de receptores implicados en este mecanismo sobrerregulador de AChE y las distintas etapas del proceso. Cholinesterases, acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BuChE), hydrolyze acetylcholine (ACh) and exert non-catalytic actions, being involved in processes of proliferation, differentiation, morphogenesis, hematopoiesis, apoptosis and tumorogenesis. In previous studies we had observed a large increase in AChE activity in Caco-2 cells when treated with a reversible and specific AChE inhibitor, BW284c51, which could reflect the existence of a mechanism regulating active AChE levels. Thus, the general objective of this Doctoral Thesis was to obtain information on the possible regulatory mechanism of AChE activity mediated by acetylcholine receptors in intestine cells. The methodology includes culturing Caco-2 and SW480 cells with cholinergic agonists and antagonists, colorimetric assays for measuring AChE activity and MTT reduction assays for measuring cell viability. The relative quantification of the mRNA of the cholinergic system components was carried out by real-time RT-PCR. Sedimentation analyzes were performed to determine the content of AChE molecular forms and Western blotting assays for protein detection. In addition, Hoechst dye was used for detection of apoptotic cells, and histocytochemical AChE staining assays were also performed. These studies revealed the existence of a regulatory mechanism of AChE activity levels in intestine cells, by which AChE activity increases in response to prolonged exposure of acetylcholine receptors to cholinergic agonists such as carbachol. By using cycloheximide, it was found that the mechanism of action of carbachol requires the synthesis of new AChE protein. In Western blotting assays, an increase in AChE protein content was observed in Caco-2 cells treated with BW. The most abundant 3' variant of AChE mRNA was type H; 5' variants with exons E1c and E1e were also observed. The changes produced by carbachol and BW in ACHE gene expression do not explain the increase in AChE activity. The pattern of AChE molecular forms in Caco-2 cells was not modified by carbachol or BW treatments, the G1A and G2A molecules being the predominant molecular forms in these cells. On the other hand, Hoechst staining showed that carbachol does not induce apoptosis in Caco-2 cells. In addition, histocytochemical staining indicated that the increase in AChE activity after carbachol treatment is shown similarly by all treated cells, discarding that the upregulation of AChE is due to the induction of apoptosis. Calcium chelator treatments demonstrated a role of intracellular calcium in the mechanism of action of carbachol for AChE upregulation. Finally, studies with agonists (acetylcholine, carbachol, nicotine, choline, oxotremorine M) showed that activation of either muscarinic or nicotinic ACh receptors results in an increase in AChE activity. This suggests that acetylcholine and carbachol exert their upregulatory action on AChE by acting on both types of receptors in Caco 2 and SW480 cells. The results of the RT-PCR assays indicate that homomeric α7 as well as muscle type nicotinic receptors may form in both lines, together with possible α3β4α5, α3β2β4α5 and α4β2α5 heteromers, along with M3 mAChR. More studies will be needed to characterize the different types of receptors involved in this AChE upregulatory mechanism and the different steps of the process.