Browsing by Subject "Fisiología veterinaria"

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    Advances in biomarkers for welfare evaluation : oxytocin and corticoids
    (Universidad de Murcia, 2021-12-23) López Arjona, Marina; Cerón Madrigal, José Joaquín; Martínez Subiela, Silvia; Escuela Internacional de Doctorado
    El objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue avanzar en el desarrollo de nuevos ensayos para determinar de forma precisa las concentraciones de oxitocina en saliva, pelo, y otras muestras de varias especies, como la porcina, bovina, canina y humana, así como de métodos que puedan evaluar la concentración de cortisol, cortisona y la actividad de la isoenzima 11β- hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 2 en pelo de la especie porcina. Todo ello con el objetivo global de proporcionar nuevas herramientas analíticas que permitan evaluar el estrés y bienestar en estas especies de forma no invasiva. Los objetivos específicos fueron: (1) Desarrollar y validar inmunoensayos para la determinación de oxitocina en saliva de la especie porcina y aplicarlos en diferentes situaciones de estrés y experiencias positivas, y desarrollar un inmunoensayo para la medición de oxitocina en plasma seminal de la especie porcina, así como una revisión bibliográfica sobre los ensayos para la medición de oxitocina. (2) Desarrollar y validar inmunoensayos para la determinación de oxitocina en saliva de las especies canina, bovina, y humana, y aplicarlos en diferentes situaciones de estrés o positivas. (3) Desarrollar y validar un inmunoensayo para la determinación de oxitocina en pelo de la especie porcina. (4) Desarrollar y validar inmunoensayos para la determinación de cortisol y cortisona como biomarcadores de estrés en pelo de la especie porcina. Para el primer objetivo, se desarrollaron y validaron dos nuevos inmunoensayos basados en la tecnología de AlphaLISA para la determinación de oxitocina en saliva de cerdo y su evaluación en diferentes situaciones como el parto y la lactación, extracción de semen, y el transporte y estancia en matadero. También se evaluó la influencia del procedimiento de extracción y el tratamiento de reducción y alquilación sobre las muestras de saliva. Además, se desarrolló un método para determinación de oxitocina en plasma seminal de la especie porcina y se evaluó su relación con parámetros reproductivos. Para el segundo objetivo, se desarrollaron y validaron dos nuevos inmunoensayos basados en la tecnología de AlphaLISA, para la determinación de oxitocina en saliva de las especies bovina, canina, y humana para evaluar los cambios después de situaciones de estrés o positivas, así como la evaluación del tratamiento de reducción y alquilación sobre las muestras. Para el tercer objetivo, se desarrolló y validó un inmunoensayo basado en la tecnología de AlphaLISA para determinar oxitocina en pelo de la especie porcina y evaluar los cambios durante el ciclo reproductivo. Para el cuarto objetivo, se desarrollaron y validaron dos inmunoensayos basados en la tecnología de AlphaLISA, uno de ellos para determinar cortisona y el otro para cortisol en pelo de la especie porcina y evaluar los cambios durante el ciclo reproductivo, y así evaluar la actividad de la isoenzima 11β- hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 2. En conclusión y de forma global, todos los métodos desarrollados en esta Tesis demostraron ser adecuados desde el punto analítico y permitieron detectar (1) oxitocina en saliva de las especies porcina, canina, bovina, y humana sin necesidad de tratamiento previo de las muestras, y en el plasma seminal y pelo del cerdo y (2) cortisol, cortisona y actividad de la isoenzima 11β- hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 2 en pelo de la especie porcina, mediante el ratio cortisona/cortisol. Además, todos los métodos pudieron detectar las variaciones de los analitos en diferentes situationes de estrés y bienestar
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    Estudio funcional de los espermatozoides que responden a los quimioatrayentes fluido folicular, fluido oviductal, medio condicionado y progesterona en la especie porcina
    (Universidad de Murcia, 2021-02-04) Diana, Alessia; Vieira y, Luis Alberto; Matas Parra, Carmen; Escuela Internacional de Doctorado
    En mamíferos, el encuentro espermatozoide–ovocito no es un evento que ocurra al azar, sino que los espermatozoides deben ser guiados hasta el gameto femenino (Eisenbach & Giojalas, 2006). La quimiotaxis, el movimiento del espermatozoide hacia el ovocito guiado por un gradiente de concentración de atrayentes químicos, es una técnica que se viene utilizando cada vez más en estudios de espermatozoides in vitro. El uso de biofluidos procedentes de la hembra como quimioatrayentes, es una buena alternativa para seleccionar y estudiar espermatozoides aptos para la fecundación. Las hipótesis que nos planteamos en este trabajo fueron que los biofluidos reproductivos [fluido folicular (FF), fluido oviductal (FO), medio condicionado (MC) y progesterona (P4)] en la especie porcina tienen efectos quimiotácticos y son dependientes de la concentración. Además, la selección de espermatozoides por parte de los biofluidos modifica las características bioquímicas y funcionales de los espermatozoides, por lo que mejoran la calidad embrionaria tras la fecundación in vitro (FIV). Los principales objetivos de esta tesis fueron i) Determinar la capacidad quimiotáctica y concentración optima de los biofluidos (FF, FO, MC) sobre espermatozoides porcinos. ii) Realizar un estudio comparativo de las características funcionales y bioquímicas de los espermatozoides que responden o no a factores quimiotácticos. iii) Analizar componentes en los biofluidos responsables de la actividad quimiotáctica y iv) Determinar si existe relación entre la calidad embrionaria y los espermatozoides que respondieron al quimioatrayente FF. En la primera experiencia se determinó la concentración optima de los biofluidos reproductivos (FF, FO, MC) que mayor número de espermatozoides seleccionaban después 20 min de quimiotaxis estableciendo una curva de dilución en forma de campana. Las concentraciones empleadas (v/v) para establecer la curva de dilución con los diferentes biofluidos fueron: FF: 0,13%, 0,25%, 0,5%, 1% y 1,5%; FO: 0,13%, 0,25%, 0,5%, 1% y 1,5%; y MC: 0,033%, 0,065%, 0,13%, 0,25% y 0,5%. Las concentraciones de P4 empleadas como quimioatrayente control, fueron: 1, 2,5, 5, 7,5 y 10 pM. Además, se incluyó un grupo (Σ) compuesto por la suma de los tres biofluidos (FF + FO + MC) para comprobar si había o no algún efecto sinérgico entre estos compuestos. Se estudió el efecto del inhibidor NNC 55-0396, el cual bloquea los canales CatSper y reprime la entrada de calcio (Ca2+) en el espermatozoide. Además, se estudió la composición de los biofluidos reproductivos mediante la técnica de HPLC-MS/MS para determinar la presencia de algunas sustancias relacionadas con la quimiotaxis. En la segunda experiencia realizamos un estudio comparativo de la calidad seminal. Para ello, analizamos la integridad acrosomal, motilidad, test hipoosmótico, fosforilación en tirosina, FIV y fragmentación de ADN. En la tercera experiencia nos planteamos analizar la posible relación entre la selección espermática con el FF y la calidad embrionaria, analizando la producción de embriones desde la división embrionaria a las 48h hasta el estadio de blastocisto expandido a las 168h. Los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral muestran que los biofluidos reproductivos (FF, FO y MC) en la especie porcina, tienen efectos quimiotácticos y son dependientes de la concentración, presentan mejores características funcionales cuando se someten a una condición hipoosmótica. Además, únicamente los espermatozoides seleccionados con el FF incrementan la tasa de penetración y mejora la velocidad de desarrollo del embrión así como la calidad embrionaria.
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    Validation of automated assays for the assessment of stress and welfare in saliva
    (Universidad de Murcia, 2021-04-22) Contreras Aguilar, María Dolores; Tecles Vicente, Fernando; Escribano Tortosa, Damián; Escuela Internacional de Doctorado
    Las situaciones de estrés o que producen un bajo grado de bienestar dan lugar a comportamientos y estados fisiológicos inapropiados en los animales, que en las especies ganaderas se traduce en un descenso en la producción. Pero la correcta evaluación del estrés para intentar evitar sus causas y consecuencias es uno de los principales retos en el ámbito del estudio del bienestar animal debido a la imposibilidad de los animales de expresarlo verbalmente. Tradicionalmente el cortisol se ha usado para evaluar los cambios psicológicos que ocurren por estrés. Sin embargo, hay otros mecanismos fisiológicos envueltos en la reacción de estrés que también pueden directa o indirectamente interactuar e inducir cambios, por ejemplo, en el sistema inmune o en el estado oxidativo. Sin embargo, hay muy pocos estudios que hayan evaluado marcadores de estrés diferentes al cortisol en saliva en las diferentes especies veterinarias. Además, no hay trabajos en los que se aplique un perfil analítico en saliva que, desde un punto de vista integrador, pudiera evaluar el estrés mediante sus diferentes vías de activación e interacción. Por tanto, los objetivos de la actual Tesis doctoral fueron: 1) avanzar en el estudio de la alfa-amilasa salival (sAA, por sus siglas en inglés, salivary alpha-amylase), una enzima evaluadora del sistema nervioso simpático, en las diferentes especies domésticas y en humana como modelo experimental de comparación; 2) mejorar el conocimiento sobre otros posibles biomarcadores de estrés y bienestar que puedan determinarse en saliva mediante técnicas de medición automatizadas; y 3) evaluar los posibles factores que pudieran afectar a la interpretación de los resultados de los biomarcadores salivales evaluados. Además, mediante la publicación de un capítulo de libro, se profundizó en el conocimiento de la anatomía y fisiología de las glándulas salivales para un apropiado conocimiento sobre cómo se forma la saliva y cómo ésta contiene los analitos que pueden ser medidos para la evaluación de estrés. Para el primer objetivo, se realizaron estudios en los que se evaluó cuál sería la mejor forma de expresar los resultados de la sAA, se investigaron los posibles cambios de sus proteoformas en diferentes situaciones estresantes, y se validaron ensayos en las especies canina, equina y porcina. Para el segundo, se validaron ensayos automatizados en saliva de la especie equina, porcina, ovina y bovina para la medición de biomarcadores de estrés y bienestar diferentes a la sAA, y se estudiaron cómo estos biomarcadores se comportan en diferentes situaciones relacionadas con estresores psicológicos, físicos e inflamatorios. Y para el tercer objetivo, se midieron esos biomarcadores de estrés en saliva de la especie equina limpias y contaminadas con alimento u obtenidas con esponja o algodón, además de valorarse posibles variaciones debido al ritmo circadiano, con el fin de evaluar posibles diferencias en sus resultados debido a estos factores. En conclusión, se observó que la actividad sAA es más sensible que la medida de su concentración para detectar cambios inducidos por estrés o dolor en las especies humana, equina y porcina; la sAA existe en la saliva de la especie canina, y su actividad puede incrementar tras una estimulación simpática; la enzima sAA tiene diferentes proteoformas que muestran diferentes cambios según el modelo de estrés aplicado; lipasa, TEA, BChE, ADA, TP, gGT, CK, urea, bilirrubina total, fósforo y lactato pueden medirse en saliva a través de ensayos automatizados de una forma rápida y fiable, y podrían considerarse biomarcadores de estrés; y el grado de contaminación de la saliva con comida, el método de recolección de la misma y el ritmo circadiano pueden modificar los valores de algunos de los analitos evaluados en la presente Tesis.