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    Aproximación fisiológica para la optimización del sistema de producción de embriones in vitro en la especie porcina
    (Universidad de Murcia, 2019-09-19) García Martínez, Soledad; Coy Fuster, Pilar; Romar Andrés, Raquel; Bernabò, Nicola; Escuela Internacional de Doctorado
    El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es la aproximación de las condiciones de IVF y EC a las registradas en el tracto reproductor de la cerda para la mejora de la producción in vitro de embriones en la especie porcina. Con este fin, se realizaron cuatro experimentos. Los dos primeros consistieron en la modificación de los medios de cultivo utilizados durante la IVF y el EC mediante la adición de proteínas específicas o fluidos naturales presentes en el oviducto y el útero de la cerda. Los dos últimos experimentos consistieron en obtener in vivo los valores de referencia para parámetros físico-químicos como el oxígeno y temperatura del interior de los órganos reproductores de la cerda, y transferirlos a las condiciones in vitro. En el primer experimento, ovocitos porcinos madurados in vitro fueron incubados en un medio con heparina, ezrin, HSP-70-1A o HSP-90α a excepción del grupo control. Estos mismos grupos fueron utilizados durante la IVF. Los resultados mostraron que heparina y cada una de las proteínas por sí mismas eran capaces de endurecer la zona pelúcida de los ovocitos porcinos, es decir, aumentar los tiempos de digestión para la zona pelúcida. La combinación de heparina con cada una de las proteínas aumentó esos tiempos, excepto para HSP-90α donde disminuyó. Aunque prometedores, ya que el efecto de heparina y cada una de las proteínas añadidas al medio de IVF redujeron las tasas de polispermia, los resultados también mostraron bajas tasas de penetración cuando estas moléculas fueron añadidas a los medios, de manera que no se consiguió la mejora de la técnica de IVF con este enfoque. En el segundo experimento se compararon dos métodos de selección espermática. Uno de los métodos más utilizados para la especie porcina, centrifugación a través de un gradiente de densidad, se comparó con un nuevo procedimiento que hizo que los espermatozoides nadaran en un tubo que contenía un medio de cultivo con o sin fluido oviductal porcino (POF) con la intención de imitar los cambios sufridos por los espermatozoides en su ascenso por el tracto reproductor femenino. Por otro lado, se compararon dos sistemas de producción de embriones. Un nuevo sistema de cultivo, donde se añadió de forma secuencial POF al medio de IVF, y POF y fluido uterino porcino (PUF) a los medios de EC, frente a un sistema de producción de embriones donde no se añadió estos fluidos a los medios. Los resultados indicaron que la utilización de swim-up como método de selección espermática para la producción de embriones porcinos alcanzó el 40 % de rendimiento, indicando una mejora con respecto a los mejores resultados previos registrados en cerdos (30 -35 %). Además, ese valor incrementó un 5 % cuando los fluidos reproductivos fueron añadidos a los distintos medios de cultivo, superando incluso el valor de rendimiento dado para la especie bovina. Igualmente, la adición de los fluidos a los medios mejoró la calidad de los embriones obtenidos, alcanzando un número medio de células similar al de embriones obtenidos in vivo. En el tercer y cuarto experimento se realizaron una serie de mediciones de oxígeno y temperatura en el tracto reproductivo de cerdas adultas y cerdas pre-púberes, en distintas fases del ciclo estral, usando técnicas de cirugía y sondas mínimamente invasivas. A continuación, los valores obtenidos se transfirieron a las técnicas de IVF y EC, con el propósito de mejorar la producción de embriones porcinos in vitro. El tercer experimento reveló por primera vez la cantidad de oxígeno dentro de los órganos reproductivos de la cerda adulta (7 %), siendo este valor mayor (10 %) para cerdas pre-púberes tratadas con hormonas. Se observaron dos perfiles para las medidas de oxígeno: perfil plano, donde la variación de oxígeno fue mínima respecto al promedio, y un perfil ondulado que presentó pequeñas variaciones (±2) respecto al promedio. El perfil ondulado fue asociado al útero. El uso de condiciones de hipoxia (7 % oxígeno) durante la IVF seguido del EC mejoró la producción de embriones porcinos y la calidad de los blastocistos obtenidos. En el cuarto experimento se demostró la existencia de un gradiente de temperatura entre oviducto (37.0 ºC) y útero (38.7 ºC) por primera vez. La transferencia de ese gradiente durante las técnicas de IVF y EC mejoró la producción de embriones in vitro en la especie porcina a través de la reducción de los ratios de polispermia. El uso de una temperatura elevada (39.5 ºC) durante la IVF ejerció el efecto contrario al uso de una temperatura baja (37.0 ºC), ya que aumentó los ratios de polispermia y se pudo intuir una mayor fragmentación de los embriones producidos a esa temperatura. La obtención de la temperatura de transición para espermatozoides capacitados de verraco (37.0 ºC), así como la incubación de esos espermatozoides a distintas temperaturas (37.0 ºC, 38.5 ºC y 39.5 ºC) determinó un papel relevante de ésta en la remodelación de los lípidos de la membrana plasmática del espermatozoide y su implicación en la IVF. The objectives of this PhD Thesis are approaching the IVF and CE conditions to those recorded in the sow's reproductive tract for the improvement of the in vitro production of porcine embryos. To this end, four experiments have been carried out. The first two consisted of the modifications in the culture media used during IVF and CE by adding either specific proteins or natural fluids present in the oviduct and uterus of sows. The last two experiments consisted of obtaining in vivo, inside the reproductive organs of the female pig, the reference values for physical-chemical parameters such as oxygen and temperature, and transfer them to in vitro conditions. In the first experiment, porcine oocytes matured in vitro were incubated in a medium with heparin, ezrin, HSP-70-1A or HSP-90α. These same groups were used during IVF since heparin or proteins were added to the IVF medium with the oocytes and spermatozoa. In the control groups, gametes were incubated in a medium without heparin nor proteins. The results showed that heparin and each of the tested proteins hardened the ZP of the porcine oocytes, by increasing its resistance to enzymatic digestion. The combination of heparin with each of the proteins increased such hardening effect, except for HSP-90α, where the the ZP´s resistance was reduced. While promising, since the effect of heparin and each of the proteins added into the IVF medium drafted the polyspermy rates, IVF outcome was not improved because of the reduction in the penetration rates. In the second experiment, two sperm selection methods were compared. One of the widely used procedures in swine, the density gradient centrifugation, was compared with a new procedure, which made the sperm swam up in a tube containing culture media with or without porcine oviductal fluid (POF). On the other hand, two IVEP systems were compared. A new system containing POF and porcine uterine fluid (PUF) within the culture media during IVF and EC was compared with a system where those biofluids were not added to the culture media. The results indicated that the use of swim-up as sperm selection procedure for the production of porcine embryos reached a 40% yield, indicating an improvement with regard to the best results obtained in pigs up to date (30-35%). Furthermore, that value increased in a 5% when the reproductive fluids were added to the different culture media, even surpassing the value of the yield given for the bovine species. Likewise, the addition of the fluids to the media improved the quality of the porcine in vitro embryos produced, which achieved a mean number of cells similar to porcine embryos collected in vivo. In the third and fourth experiments, a series of measurements of oxygen and temperature were made in the reproductive tract of sows and gilts at different phases of the estrous cycle, using minimally invasive surgery techniques and new probes. The values obtained were then transferred to IVF and CE procedures, with the purpose of improving the production of porcine embryos in vitro. The third experiment revealed the amount of oxygen within the reproductive organs of sow (7%), being higher in gilts treated with hormones (10%). Two profiles for oxygen measurements were observed: a flat profile, where the oxygen variations were minimal with respect to the average, and a wavy profile, which showed small variations (± 2) with respect to the average. The wavy profile was associated with the uterus. The use of hypoxia conditions (7% oxygen) during IVF followed by EC improved porcine IVEP outcome and the quality of the porcine blastocysts obtained. In the fourth experiment was demonstrated the existence of a temperature gradient between the oviduct (37.0 ºC) and uterus (38.7 ºC) for the first time. Transferring this gradient during IVF and CE improved the production of in vitro embryos in the porcine species through the reduction of the polyspermy rates. In addition, the use of a high temperature (39.5 ºC) during IVF exerted the opposite effect to the use of a low temperature (37.0 ºC), since its use increased the polyspermy rates, and a greater fragmentation of the embryos obtained at high temperature was observed. On the other hand, obtaining the transition temperature for capacitated boar sperm (37.0 ºC), as well as the incubation of these spermatozoa at different temperatures (37.0 ºC, 38.5 ºC and 39.5 ºC), indicated an important role of temperature in the remodelling of the lipids contained in the sperm membrane and its implication in IVF.
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    Bases del metabolismo anaerobio en anfibios anuros / Pilar Mendiola López.
    (Murcia : Universidad,, 1987) Mendiola López, Pilar
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    Cambio climático, nicho térmico y conservación de la biodiversidad subterránea
    (Universidad de Murcia, 2023-05-18) Colado Manero, Raquel; Sánchez Fernández, David; Pallarés Párraga, Susana; Facultades, Departamentos, Servicios y Escuelas::Escuelas::Escuela Internacional de Doctorado
    Predecir los efectos del cambio climático y diseñar estrategias efectivas de conservación de la biodiversidad son dos de los grandes retos actuales para la comunidad científica. El medio subterráneo es uno de los pocos ecosistemas donde, por sus condiciones ambientales constantes, se pueden obtener predicciones precisas de la respuesta de sus especies al cambio climático. Además, está directamente conectado a la superficie, viéndose afectado por diversas amenazas humanas que han desencadenado procesos de alteración que están provocando la pérdida de biodiversidad subterránea. Por lo tanto, es urgente evaluar si las redes de espacios protegidos actuales son efectivas para la protección de la biodiversidad subterránea. Los objetivos generales de esta tesis son: i) predecir la vulnerabilidad de la biodiversidad subterránea frente al cambio climático, combinando información sobre la fisiología térmica, ecología y relaciones evolutivas de diferentes especies de invertebrados subterráneos de varios grupos y de distintas áreas geográficas, y ii) evaluar la efectividad de las redes de espacios protegidos para conservar la biodiversidad subterránea. La tesis se estructura en 4 objetivos específicos: En el objetivo 1, se estimó el límite térmico superior de un pseudoescorpión subterráneo utilizando dos metodologías diferentes: i) a partir de las condiciones climáticas de sus localidades actuales y ii) a partir de experimentos fisiológicos. Los resultados del primer método muestran que, el riesgo de extinción local podría ser alto para al menos la mitad de las poblaciones de la especie estudiada. Este mensaje alarmante puede atenuarse al considerar los resultados de los experimentos fisiológicos, mostrando que enfoques complementarios para estimar la tolerancia térmica proporcionan predicciones más precisas de la capacidad de las especies de afrontar el cambio climático. En el objetivo 2, se determinó la plasticidad del límite térmico superior de 3 escarabajos con diferente grado de especialización al medio subterráneo sometidos a distintos tratamientos de aclimatación. Se demostró que las especies más especializadas al medio subterráneo profundo carecen de capacidad de aclimatación. Sin embargo, la especie menos especializada es capaz de aumentar los límites térmicos superiores tras unos días expuesta a mayor temperatura. En el objetivo 3, se estimó el límite térmico superior de 16 escarabajos subterráneos, se caracterizó su grado especialización al medio subterráneo utilizando rasgos morfológicos y ecológicos, y se obtuvieron datos de la temperatura del hábitat de cada especie. Los resultados muestran que las especies altamente especializadas tienen menor tolerancia al calor, independientemente de la temperatura media de su hábitat. Por lo tanto, la vulnerabilidad de las especies subterráneas frente al cambio climático dependerá en gran medida de su grado de especialización al medio subterráneo profundo. En el objetivo 4, se generó una base de datos de distribución de especies subterráneas de dos grupos taxonómicos (escarabajos y arañas) en dos puntos calientes de biodiversidad subterránea (Pirineos y Alpes), se identificaron áreas prioritarias para su conservación, y por último se evaluó hasta qué punto están incluidas en las redes de áreas protegidas superficiales. Más del 70 y el 90% de las áreas prioritarias para la conservación de la biodiversidad subterránea (y el 40 y el 22% de las especies) no están efectivamente cubiertas por zonas protegidas en los Pirineos y los Alpes, respectivamente. Además, se identificaron 49 cuencas más en los Pirineos y 22 en los Alpes que sería necesario proteger para cubrir a todas las especies que actualmente se encuentran fuera de espacios protegidos. Estos resultados ponen de manifiesto la urgente necesidad de desarrollar un plan coherente de conservación de la biodiversidad subterránea.
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    Caracterización del papel de los receptores de TNF en inflamación usando el pez cebra como modelo= Modelling the impact of TNF receptors in inflammation using the zebrafish.
    (2013-10-08) Candel Camacho, Sergio; Mulero Méndez, Victoriano Francisco; Sepulcre Cortés, María Pilar; Meseguer Peñalver, José; Facultad de Biología
    INTRODUCTION: La psoriasis es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel que afecta a millones de personas. Aunque en ratón no existen modelos de psoriasis, la facilidad para obtener muestras de piel de pacientes ha facilitado el estudio de las vías de señalización implicadas en la enfermedad, mostrando la importancia del sistema inmune en su desarrollo. Algunas terapias que utilizan anticuerpos específicos contra varias citoquinas, incluyendo TNFα, IL-23 y IL-17, son prometedoras, pero son caras y presentan efectos secundarios. Numerosos estudios han mostrado la aparición de nuevos casos de psoriasis después del tratamiento con antagonistas del TNFα en pacientes con Inflammatory Bowel Disease. Aunque esos datos indican un papel ambiguo del TNFα en psoriasis, su papel, y especialmente la contribución de sus receptores, en la regulación de la inflamación en piel han sido escasamente estudiados. OBJECTIVES: (1) Caracterización del papel de Tnfa y sus receptores (Tnfr1 y Tnfr2) en la función y distribución de los neutrófilos en larvas de pez cebra; (2) Caracterización de las vías de señalización de Tnfr1 y Tnfr2 involucradas en la homeostasis de la piel en larvas de pez cebra; (3) Caracterización del papel de Tnfa y sus receptores en inflamación crónica en piel en larvas de pez cebra; (4) Evaluación de las larvas de pez cebra como posible modelo para estudiar enfermedades inflamatorias crónicas humanas. METHODOLOGY: Líneas transgénicas de pez cebra y las ventajas de trabajar con sus embriones en in vivo imaging y cell tracking han sido utilizadas para estudiar los patrones de distribución de los neutrófilos. Además, la inflamación en la piel causada por la depleción de Tnfa o Tnfr2, pero no Tnfr1, ha sido estudiada mediante la inhibición genética (morpholinos y formas dominantes negativas) y farmacológica (DPI) de Duox1. La expresión de moléculas pro-inflamatorias ha sido medida mediante RT-qPCR, Neutrófilos y queratinocitos han sido aislados de larvas control y deficientes en Tnfr2 usando FACS-sorting. Sondas específicas para H2O2 han sido usadas para detectar su producción. RESULTS AND CONCLUSIONS: La depleción de Tnfa o Tnfr2, pero no de Tnfr1, causa inflamación en la piel a través de la activación de un bucle inflamatorio de retroalimentación positiva que implica a H2O2/NF-κB/Duox1. Tanto la inhibición genética como farmacológica de Duox1 revierten completamente la inflamación en piel, situando al H2O2 derivado de Duox1 aguas arriba de la activación de NF-κB. Extraemos las siguientes conclusiones: (1) La inhibición genética de Tnfa o Tnfr2, pero no de Tnfr1, resulta en la movilización de los neutrófilos desde la CHT hasta la piel; (2) El silenciamiento de Tnfa o Tnfr2 provoca la inducción en la piel de la expresión de genes que codifican para moléculas pro-inflamatorias; (3) La ausencia de señalización de Tnfa a través del receptor Tnfr2 desencadena la producción local de H2O2 por la enzima Duox1 en la piel; (4) La inhibición genética de Tnfa o Tnfr2 resultada en la activación del regulador maestro de la inflamación NF-кB en la piel, aguas abajo de la producción de H2O2; (5) La señalización de Tnfa a través del receptor Tnfr2 es indispensable para el mantenimiento de la homeostasis de la piel; (6) La inducción de DUOX1 y/o la consiguiente producción de H2O2 en la piel de pacientes con psoriasis, podrían ser nuevas dianas para terapias farmacológicas y genéticas para el tratamiento de la psoriasis. Estas nuevas estrategias podrían ser también aplicables para otras enfermedades inflamatorias crónicas; (7) El pez cebra puede utilizarse como organismo modelo para estudiar la psoriasis y otras enfermedades inflamatorias crónicas. INTRODUCTION: Psoriasis is a chronic, debilitating skin disease that affects millions of people worldwide. Although there is no mouse model that accurately reproduces all facets of the psoriasis, the accessibility of skin tissue from patients has facilitated the elucidation of some pathways involved in the pathogenesis of psoriasis and highlighted the importance of the immune system in the disease. Recently developed antibodies that selectively target several cytokines, including TNFα, IL-23 and IL-17, have shown promising results in early-phase clinical trials. However, these treatments are extremely expensive and show important side effects. Importantly, numerous studies have reported new-onset psoriasis following TNFα antagonist therapy in adult inflammatory bowel disease patients. Despite these clinical data pointing to an ambiguous function of TNFα in psoriasis, the role of TNFα, and in particular the contribution of each TNFR, in the regulation of skin inflammation has scarcely been studied. OBJECTIVES: Taking that into consideration, the objectives of the present work are: (1) Characterization of the role played by Tnfa and its receptors (Tnfr1 and Tnfr2) in the neutrophil function and distribution patterns in zebrafish larvae; (2) Characterization of the Tnfr1 and Tnfr2 signaling pathways involved in skin homeostasis in zebrafish larvae; (3) Characterization of the role played by Tnfa and its receptors in chronic inflammation in the skin in zebrafish larvae; (4) Evaluation of the zebrafish larvae as a potential model for the study of human chronic inflammatory diseases. METHODOLOGY: Some zebrafish transgenic lines and the unique advantage of the zebrafish embryo for in vivo imaging and cell tracking have been used for the study of the neutrophil distribution patterns. Furthermore, the skin inflammation caused by the depletion of Tnfa or Tnfr2, but not of Tnfr1, has been studied using both genetic (morpholinos and dominant negative forms) and pharmacological (DPI) inhibition of Duox1. The expression of pro-inflammatory molecules has been measured by RT-qPCR, while neutrophils and keratinocytes have been FACS-sorted from controls and Tnfr2-deficient larvae. H2O2-specific probes have been used in order to detect the production of that compound. RESULTS AND CONCLUSIONS: We found that depletion of Tnfa or Tnfr2, but not of Tnfr1, caused skin inflammation through the activation of an H2O2/NF-κB/Duox1 positive feedback inflammatory loop. Moreover, both genetic and pharmacological inhibition of Duox1 completely abrogated skin inflammation, placing Duox1-derived H2O2 upstream of the positive feedback inflammatory loop. Thus, these results lead us to the next conclusions: (1) Genetic inhibition of Tnfa or Tnfr2, but not of Tnfr1, results in neutrophil mobilization from the CHT to the skin, where they get infiltrated; (2) Target gene silencing of Tnfa or Tnfr2 results in the induction of the expression of genes encoding pro-inflammatory mediators in the skin; (3) The absence of Tnfa signaling through Tnfr2 triggers the local production of H2O2 by Duox1; (4) Genetic inhibition of Tnfa or Tnfr2 results in the activation of the master regulator of inflammation NF-кB in the skin, downstream the production of H2O2; (5) Tnfa signaling through Tnfr2 is critically required for skin homeostasis; (6) DUOX1 induction and/or the subsequent production of H2O2 in the skin of psoriasis patients, may be new targets for pharmacologic and genetic therapies for the treatment of psoriasis. These new strategies could be applicable to other chronic inflammatory diseases as well; (7) Zebrafish can be used as a model organism for the study of psoriasis and other inflammatory chronic diseases.
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    Caracterización filogenética, molecular y funcional de nuevos miembros de la familia de la interluquina-1 de peces teleósteos= Phylogenetic, molecular and functional characterization of new interleukin-1 family members in teleost fish.
    (2013-06-13) Angosto Bazarra, Diego; Mulero Méndez, Victoriano Francisco; Facultad de Biología
    1. PALABRAS CLAVE Inmunidad, interleuquina-1, inflamasoma, piroptosis, actividad caspasa-1, Salmonella typhimurium, evolución, filogenia, sintenia, dorada, pez cebra, peces, teleósteos. 2. RESUMEN En la presente tesis doctoral se ha estudiado la evolución de las funciones del inflamasoma en peces, llegando a la conclusión de que tanto el inflamasoma como la caspasa-1 desencadenan muerte celular conocida como piroptosis, pero no son necesarios para el procesamiento de la IL-1. Además se ha desarrollado un modelo de infección en pez cebra para el estudio del papel del inflamasoma en la eliminación de bacterias intracelulares, como Salmonella. Por último, se ha descrito un nuevo miembro de la familia de la IL-1, IL-1Fm2, perteneciente exclusivamente a los peces teleósteos más avanzados evolutivamente. La identificación de este nuevo miembro de la familia de la IL-1, IL-1Fm2, ayuda a entender la evolución de esta familia de citoquinas en vertebrados e indica su gran complejidad. 3. SUMMARY In the present thesis, we have studied the evolution of the inflammasome functions in fish. We observed that inflammasome and caspase-1 trigger pyroptotic cell death but they are not involved in the processing of IL-1. In addition, we have developed a zebrafish-Salmonella infection model to study the role of the inflammasome in the clearance of intracellular bacteria. Finally, we have identified and characterized a new member of the IL-1 family, IL-1Fm2, which is exclusively present in most evolutionarily advanced teleosts. The identification of this new IL-1 family member helps to understand the evolution of this family of cytokines in vertebrates and point out to its complexity.
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    Caracterización funcional de los receptores de TNF de pez cebra : Functional characterization of TNF receptors in cebrafish.
    (2013-11-22) Espín Palazón, Raquel; Mulero Méndez, Victoriano Francisco; Meseguer Peñalver, José; Facultad de Biología
    OBJETIVOS 1. Caracterización de los receptores de Tnf (Tnfr1 y Tnfr2) en la homeostasis vascular durante el desarrollo en pez cebra. 2. Caracterización de las rutas de señalización de Tnfr1 y Tnfr2 involucradas en el desarrollo de las células endoteliales y su homeostasis. 3. Caracterización del papel que juegan Tnfrs y sus ligandos (Tnfa y Lta) en la ola primitiva de hematopoyesis en el pez cebra. 4. Caracterización de los Tnfrs y sus ligandos (Tnfa y Lta) en la especificación y mantenimiento de las HSCs en el embrión de pez cebra. METODOLOGÍA Para la presente tesis doctoral, se ha utilizado el pez cebra (Danio rerio) como modelo de experimentación animal. Además, para la experimentación in vitro se han usado varias líneas celulares y técnicas de cultivo celulares. En cuanto a las técnicas de biología molecular, podemos destacar la microinyección en estadio de huevo de RNAm, morfolinos y DNA; RT-qPCR e hibridación in situ. También se han usado técnicas de microscopía tales como la microscopía confocal y de fluorescencia; técnicas inmunohistoquímicas y TUNEL para la detección de apoptosis; y técnicas de citometría y aislamiento físico de células mediante fluorescencia (FACS). RESULTADOS Durante la presente tesis doctoral, hemos caracterizado el papel que desempeñan el factor de necrosis tumoral (Tnfa) y sus receptores (receptores del factor de necrosis tumoral, Tnfrs) en el desarrollo de las células endoteliales y del sistema hematopoyético. Para ello hemos usado el pez cebra (Danio rerio), como modelo animal de vertebrados. Por un lado, nuestros resultados nos han llevado a concluir que la deficiencia en el gen de tnfr2 en embriones de pez cebra conlleva la inducción en células endoteliales de un programa apoptótico que depende de caspasa-8, caspasa-2 y P53, pero no caspasa-3. Además, la deficiencia simultánea de Tnfr1 o la activación de NF-ĸB, rescata la apoptosis de las células endoteliales, lo que indica que debe haber un equilibrio entre los dos receptores de Tnf para la correcta homeostasis vascular de este tipo celular. De forma similar, el Tnfa promueve la apoptosis de las células endoteliales humanas a través de Tnfr1, desencadenando la activación de caspasa-2 y P53. Por otro lado, en este trabajo demostramos que la señalización de Tnfa a través de Tnfr2 se necesita de forma intrínseca por las células madre hematopoyéticas (HSCs) para su mantenimiento y expansión. La deficiencia genética de Tnfa o Tnfr2, pero no de linfotoxina (Lta) o Tnfr1, conlleva la apoptosis de las HSCs cuando se especifican en el embrión. CONCLUSIONES 1. El silenciamiento génico dirigido contra Tnfr2 resulta en la inducción de un programa apoptótico dependiente de caspasa-8 en células endoteliales. Esta apoptosis se rescata mediante la eliminación de Tnfr1, lo que indica que se requiere un balance adecuado entre los Tnfrs para la integridad de las células endoteliales y la homeostasis vascular. 2. En las células endoteliales, el Tnfr1 señaliza apoptosis a través de la formación del complejo II y la consecuente activación de caspasa-8 y caspasa-2, mientras que Tnfr2 señaliza supervivencia mediante el comple I y la activación de NF-ĸB. 3. El programa apoptótico inducido por Tnfr1, en el cual participa caspasa-8, caspasa-2 y P53, se encuentra conservado evolutivamente en células endoteliales humanas. 4. La señalización de Tnfrs es dispensable para la hematopoyesis primitiva en el embrión de pez cebra. 5. La inhibición génica de Tnfa o Tnfr2, pero no Tnfr1 o Lta, resulta en la apoptosis de las HSCs cuando éstas emergen de la aorta dorsal. 6. La señalización Tnfa/Tnfr2 se requiere de forma intrínseca para la supervivencia de las HSCs a partir del endotelio hemogénico. OBJECTIVES 1. Characterization of Tnfa receptors (Tnfr1 and Tnfr2) in vascular homeostasis during the zebrafish embryo development. 2. Characterization of the Tnfr1 and Tnfr2 signaling pathways involved in endothelial cell development and homeostasis. 3. Characterization of the role played by Tnfrs and their ligands (Tnfa and Lta) in the primitive wave of hematopoiesis in the zebrafish embryo. 4. Characterization of Tnfrs and their ligands (Tnfa and Lta) in HSCs specification and maintenance in the zebrafish embryo. METHODOLOGY In this Doctoral Thesis, zebrafish (Danio rerio) has been utilized as research animal model. In addition, several cell lines and tissue culture techniques have been used for the in vitro experimentation. Related to the molecular biology techniques utilized, the injection at one-cell stage with mRNA, morpholinos and DNA; RT-qPCR and in situ hybridization can be emphasized. Moreover, other techniques used have been used such as confocal microscopy and fluorescence microscopy; immunohystochemistry techniques and TUNEL for apoptosis detection; as well as cytometry-related assays as fluorescence activated cell sorting (FACS). RESULTS During this Doctoral Thesis, we have characterized the role of Tnfa and Tnf receptors (Tnfrs) during endothelial and hematopoiesis development in the embryo using zebrafish (Danio rerio) as a vertebrate model. Targeted gene knockdown of Tnfr2 in zebrafish embryos results in the induction of a caspase-8, caspase-2 and P53-dependent apoptotic program in endothelial cells that bypasses caspase-3. Furthermore, the simultaneous depletion of Tnfr1 or the activation of NF-ĸB rescue endothelial cell apoptosis, indicating that a signaling balance between both TNFRs is required for endothelial cell integrity. Similarly, Tnfa promotes the apoptosis of human endothelial cells through Tnfr1 and triggers caspase-2 and P53 activation. On the other hand, we show that Tnfa signaling through Tnfr2 is intrinsically required for hematopoietic stem cells (HSCs) maintenance and expansion. The genetic inhibition of Tnfa or Tnfr2, but not of lymphotoxin α (Lta) or Tnfr1, results in the apoptosis of HSCs soon after their emergence. CONCLUSIONS 1. Target gene silencing of Tnfr2 results in the induction of a caspase-8-dependent apoptotic program in endothelial cells. This apoptosis can be rescued by depletion of Tnfr1, indicating that an appropriate signaling balance between both Tnfrs is required for endothelial cell integrity and vascular homeostasis. 2. In endothelial cells, Tnfr1 signals apoptosis through complex II formation and caspase-8 and caspase-2 activation, while Tnfr2 signals survival via complex I and NF-ĸB activation. 3. The apoptotic program induced by Tnfr1, which involves caspase-8, caspase-2 and P53, is evolutionary conserved in human endothelial cells. 4. Tnfrs signaling is dispensable for primitive hematopoiesis in the zebrafish embryo. 5. Genetic inhibition of Tnfa or Tnfr2, but not of Tnfr1 or Lta, results in HSC apoptosis soon after their emergence from the floor of the dorsal aorta. 6. Tnfa/Tnfr2 signaling is intrinsically required for HSC survival after their emergence from the hemogenic endothelium.
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    Caracterización molecular y funcional de la interleuquina-1 B de dorada (Sparus aurata L.) / Pablo Pelegrín Vivancos ; dirección José Meseguer Peñalver, Victoriano Mulero Méndez.
    (Murcia : Universidad de Murcia, Facultad de Biología, Departamento de Biología Celular,, 2003) Pelegrín Vivancos, Pablo
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    Daily rhythms of physiological processes in fish : synchronization to light and feeding cycles and effects on the molecular clock, epigenetics and welfare
    (Universidad de Murcia, 2024-09-06) Samorì, Elisa; López Olmeda, José Fernando; Sánchez Vázquez, Francisco Javier; Bertolucci, Cristiano; Escuela Internacional de Doctorado
    Objetivos del Estudio 1. Investigar la presencia de un ritmo diario en la respuesta al estrés en la lubina europea y cómo la temporada del año modula la respuesta. 2. Explorar la presencia de un ritmo diario en los genes involucrados en la regulación de la alimentación y la digestión en la lubina europea. 3. Estudiar la presencia de un ritmo diario en los mecanismos epigenéticos y su conexión con los genes del reloj biológico en la lubina europea. 4. Comprender cómo la combinación de diferentes factores estresantes (privación de alimento y densidad) puede afectar los genes del reloj biológico y los genes relacionados con los mecanismos epigenéticos en la lubina europea. 5. Investigar el ritmo diario de la respuesta al estrés del pez cebra knockout para el receptor de glucocorticoides (gr-/-) y la influencia del momento de la alimentación. Metodología 1. Los peces se han mantenido en condiciones naturales antes del muestreo. Durante el muestreo, los peces de control se han muestreado directamente, mientras que los peces tratados han sido expuestos al aire durante 1 minuto y muestreados 1 hora después. El muestreo se ha realizado en un ciclo de 24 horas con 7 puntos de muestreo donde se han recolectado muestras de plasma e hígado, y los experimentos se han repetido en diciembre y junio. 2. Los peces se han mantenido en condiciones naturales y se les ha alimentado en dos momentos diferentes del día. Se han recolectado hipotálamo e hígado en un muestreo de 24 horas en 7 puntos de muestreo diferentes para analizar los factores que regulan el apetito y la digestión. 3. Los peces se han mantenido en condiciones naturales y se les ha alimentado en dos momentos diferentes del día. Se han recolectado hígado e hipotálamo en un muestreo de 24 horas en 7 puntos de muestreo diferentes para verificar la presencia de un ritmo diario en los genes del reloj biológico o factores involucrados en procesos epigenéticos. 4. Los peces se han mantenido en condiciones naturales y se han dividido en 4 grupos con diferentes condiciones de densidad y alimentación. Para probar el efecto crónico del estrés, los muestreamos en diferentes días durante el día o durante la noche. Se recolectaron muestras de hígado para probar la respuesta de los genes del reloj biológico y genes epigenéticos. 5. Los peces mutantes y de tipo salvaje se han alimentado respectivamente en ML o MD y después de un mes se muestrearon en un ciclo de 24 horas para recolectar cerebro. Se realizó un análisis de Q-PCR para analizar el ritmo de los genes del reloj biológico y los genes epigenéticos. Conclusiones 1. La lubina europea es particularmente sensible al estrés, pero la respuesta cambia no solo durante el día sino también durante el año. 2. El momento de la alimentación es un fuerte sincronizador y es importante que coincida con la fase de actividad del animal. Alimentar a la lubina europea en un momento que altera su fase de descanso ha llevado en la mayoría de los casos a una pérdida del ritmo. 3. Los genes del reloj biológico y los genes epigenéticos se expresan rítmicamente en el cerebro y el hígado de la lubina europea, y el momento de la alimentación tuvo un efecto mayor en el hígado, promoviendo la pérdida del ritmo de los genes epigenéticos cuando los peces se alimentaron durante la fase de descanso. 4. La densidad y la restricción calórica pueden afectar de manera diferente los genes del reloj biológico y los genes epigenéticos en la lubina europea, pero los procesos de metilación son los más afectados. 5. El sistema de glucocorticoides y el momento de la alimentación ejercen un fuerte efecto sobre los genes del segundo bucle de los genes del reloj biológico en el cerebro del pez cebra. Por el contrario, el efecto sobre los genes epigenéticos fue menor.
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    Ecological and evolutionary pysiology of aquatic beetles : coping with multiple stressors in inland saline waters
    (Universidad de Murcia, 2017-12-27) Pallarés Párraga, Susana; Velasco García, Josefa; Arribas Blázquez, Paula; Millán Sánchez, Andrés; Facultades, Departamentos, Servicios y Escuelas::Facultades de la UMU::Facultad de Biología
    Las características del hábitat definen los rasgos de las especies que lo ocupan y determinan su evolución. En los ecosistemas acuáticos continentales, la distinta estabilidad de los ambientes lóticos (aguas corrientes) y leníticos (aguas estancas) y el grado de estrés abiótico del hábitat, definido principalmente por la temperatura, salinidad y temporalidad, tienen una influencia muy importante en los rasgos biológicos de los insectos acuáticos. Entre estos ecosistemas, destacan por su singularidad ecológica y biológica los medios salinos. Los coleópteros son uno de los pocos órdenes de insectos que han colonizado con éxito estos ambientes, pero los mecanismos y procesos evolutivos por los que este grupo ha adquirido tolerancia a la salinidad se desconocen. Metodología: Se utilizaron adultos de especies congenéricas de escarabajos acuáticos con distintas preferencias de hábitat (lótico/lenítico y a lo largo del gradiente de salinidad) para explorar experimentalmente: 1) diversos componentes de la capacidad de colonización (tolerancia ambiental) en relación con la inestabilidad y estrés del hábitat y 2) los mecanismos de osmoregulación por los que se ha adquirido tolerancia a la salinidad, sus interacciones con otros factores de estrés y su origen evolutivo. Para ello, se realizaron distintos estudios ecofisiológicos estructurados en cinco capítulos. Resultados: Capítulo 1. Especies con distinta preferencia salina, de dos linajes de escarabajos acuáticos, muestran estrategias de osmoregulación similares. La ocupación de hábitat en el gradiente de salinidad está mediada en parte por la capacidad de osmoregulación máxima en los dos géneros estudiados. Capítulo 2. Especies lóticas de distintos géneros son más sensibles a un estrés agudo térmico y salino que especies congenéricas leníticas, excepto en uno de los géneros estudiados. Dicho patrón se observa tanto en la supervivencia como en respuestas de comportamiento (emersión y vuelo). Capítulo 3. Especies meso e hipersalinas son más resistentes a la desecación que especies congenéricas de agua dulce o hiposalina. A nivel intraespecífico, la variación en las tasas de pérdida de agua entre individuos está positivamente relacionada con el contenido inicial de agua. Capítulo 4. En dos especies meso-hipersalinas de distintos géneros, una exposición a una salinidad subletal disminuye la pérdida de agua durante una desecación posterior, observándose una mayor supervivencia (tolerancia cruzada) en una de las especies. En cambio, una exposición a condiciones subletales de desecación disminuye la supervivencia frente a un estrés salino posterior. Capítulo 5. La reconstrucción ancestral de la resistencia a la desecación y capacidad de hiporegulación en un linaje de escarabajos acuáticos sugiere que una alta resistencia a la desecación y cierta capacidad de hiporegulación son características ancestrales del mismo. Todas las especies con alta capacidad de hiporegulación son resistentes a la desecación, pero no viceversa. Aumentos significativos y acelerados en la capacidad de hiporegulación son paralelos a incrementos moderados en la resistencia a la desecación y están asociados a la colonización de los medios meso e hipersalinos durante periodos de aridificación global. Conclusiones: La especialización en ambientes lóticos y leníticos en escarabajos acuáticos está asociada con diferencias en la tolerancia a estrés térmico o la combinación de estrés térmico y salino entre las especies, siendo las lóticas en general más sensibles. Otros rasgos como la capacidad de osmoregulación y la resistencia a la desecación están estrechamente asociados al estrés del hábitat impuesto por la salinidad y su interacción con otros factores. Los mecanismos de osmoregulación en el medio salino y de control de la pérdida de agua frente a la desecación están fisiológica y evolutivamente relacionados. En algunos linajes de escarabajos acuáticos, la evolución de mecanismos de resistencia a la desecación parece haber proporcionado la base fisiológica para el desarrollo de la capacidad de hiporegulación, permitiendo a algunas especies colonizar los ambientes meso e hipersalinos. SUMMARY Introduction: Habitat characteristics constrain the traits of the species inhabiting them, shaping their evolution. In inland aquatic ecosystems, the contrasting stability between lotic (running waters) and lentic habitats (standing waters) and the degree of abiotic stress (determined mainly by temperature, salinity and temporality), strongly influence the biological traits of aquatic insects. Among these systems, saline waters stand out for their high ecological and biological singularity. Coleopters are one of the few insect orders that has successfully colonised saline waters. However, the mechanisms and evolutionary processes by which salinity tolerance was acquired in this group remain unknown. Methodology: Adults of congeneric species of aquatic beetles with clear habitat preferences (lotic/lentic, and along a salinity gradient) were used to experimentally explore: 1) several colonisation capacity components (physiological tolerance) in relation to habitat’s stability and stress level and 2) the osmoregulatory mechanisms by which salinity tolerance was acquired, their interactions with other stress factors and their evolutionary origin. For this, several ecophysiological studies were conducted, which are arranged in five chapters. Results: Chapter 1. Species with different salinity preferences across two water beetle genera show similar osmoregulatory strategies. Habitat occupation along the salinity gradient is mediated partly by the species’ maximum osmoregulatory capacity in both studied genera. Chapter 2. Lotic species are more sensitive to acute heat and osmotic stress than lentic congeners in distinct beetle genera, except for one of the studied genera. This pattern is found in both survivorship and behavioural responses (emersion and flight). Chapter 3. Meso- and hypersaline species are more desiccation-resistant than congeneric freshwater-hyposaline species across one beetle genus. At the intraspecific level, inter-individual variation in water loss rates positively relates with the initial water content. Chapter 4. In two meso-hypersaline species of distinct genera, exposure to sublethal salinity reduces the water loss rate under subsequent desiccation and results in higher survival (cross-tolerance) in one of the studied species. In contrast, exposure to sublethal desiccation reduces performance under subsequent salinity stress. Chapter 5. The ancestral reconstruction of desiccation resistance and hyporegulation capacity in a lineage of aquatic beetles suggests that a high desiccation resistance and moderate hyporegulation capacity were ancestral traits for that group. All the species with good hyporegulation capacity are also desiccation-resistant, but not vice versa. Significant and accelerated changes in hyporegulation capacity were parallel to weak increases in desiccation resistance across the phylogeny, being associated with the colonisation of meso- and hypersaline waters, generally during global aridification periods. Conclusions: Specialisation in lotic or lentic habitats in aquatic beetles is associated with differences in tolerance to acute heat stress or the heat+salinity stress combination of thermal and salinity stress between species, being lotic ones generally more sensitive. Other traits such as osmoregulatory capacity and desiccation resistance are related mainly with the osmotic stress imposed by salinity and its interaction with other stressors. Mechanisms for osmoregulation in saline media, and those involved in controlling water loss under desiccation conditions, are physiologically and evolutionarily linked. In some water beetle lineages, evolution of desiccation resistance mechanisms could have provided the physiological basis for development of hyporegulation capacity, promoting colonisation of meso- and hypersaline waters by some species.
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    Efecto del fluido oviductal, α-L-fucosidasa y óxido nítrico sobre la interacción de gametos en la especie porcina = Effect of oviductal fluid,α-L-fucosidase and nitric oxide on porcine gamete interaction
    (2015-03-03) Romero Aguirregomezcorta, Jon; Coy Fuster, Pilar; Matas Parra, Carmen; Facultad de Veterinaria
    La especie porcina es considerada el modelo animal idóneo para el estudio y desarrollo de terapias contra enfermedades humanas debido a sus similitudes genéticas, anatómicas y fisiológicas con el hombre. Sin embargo, la eficiencia de la producción in vitro (PIV) de embriones porcinos para utilizarlos con este fin sigue siendo muy baja, pues aun persisten los problemas de la fecundación polispérmica y las condiciones de cultivo subóptimas. Por estos motivos, se pretende profundizar en el conocimiento de los diferentes factores relacionados con el oviducto porcino que pudieran ser utilizados para modular el proceso de la fecundación in vitro (FIV) y contribuir a la mejora de los sistemas de PIV de embriones. La presente tesis aborda tres posibles vías de mejora diferentes en cuanto a complejidad e implicaciones fisiológicas consistentes en la adición al medio de cultivo de tres tipos de compuestos: fluido oviductal (FO), α-L-fucosidasa y óxido nítrico (NO). El objetivo del primer estudio fue determinar las condiciones óptimas de inclusión del FO en los protocolos de FIV. Para ello, se preincubaron ovocitos madurados in vitro con FO pre o postovulatorio y se realizó FIV. Se midieron las concentraciones de E2 y P4 en el FO. Finalmente se comparó la eficiencia de la FIV al utilizar semen fresco o congelado con ovocitos preincubados en FO preovulatorio. La eficiencia de la FIV porcina mejoró con la preincubación en FO preovulatorio. Cuando se utilizó semen congelado su capacidad de penetración aumentó comparando con semen fresco. La concentración de E2 en el FO preovulatorio fue mayor que la determinada en sangre para la misma fase del ciclo estral y la adición de E2 al medio de FIV a la concentración detectada en el oviducto produjo un efecto similar al de la adición de FO. Concluimos que la preincubación de los ovocitos en FO preovulatorio o la adición de E2 pueden considerarse protocolos adecuados para aumentar la eficiencia de la FIV porcina con semen fresco. En el segundo estudio se investigó el papel de la α-L-fucosidasa durante la FIV porcina. Para ello se añadió la enzima al medio de FIV y se observó un incremento en la penetración y en la unión de espermatozoides a la zona pelúcida (ZP). Se realizó inmunofluorescencia indirecta para detectar la α-L-fucosidasa espermática y finalmente se realizaron estudios de capacitación espermática, demostrándose que la α-L-fucosidasa aumenta los niveles de [Ca2+] intracelular y la fosforilación de tirosina. Por lo que concluímos que la α-L-fucosidasa estimula eventos relacionados con la capacitación en espermatozoides porcinos, dando lugar a una mayor capacidad de unión a la ZP y de penetración al ovocito. En el tercer estudio se investigó el papel del NO durante la maduración in vitro (MIV) porcina. Para ello se suplementó el medio de MIV con tres inhibidores distintos de la óxido nítrico sintasa (NOS) y con un donante de NO. Se estudió la expansión de las células del cúmulus y la reanudación de la meiosis, la resistencia de la ZP a la digestión enzimática y parámetros relacionados con la FIV. Los resultados mostraron que los tres inhibidores ejercían un efecto sobre la expansión de las células del cúmulus y que la reanudación de la meiosis solamente se vio detenida al añadir el inhibidor aminoguanidina. Posteriormente, se planteó la posibilidad de que la inhibición de las NOS afectara a la S-nitrosilación de proteínas del ovocito. Para ello se realizó nitrosilación in situ cuantificándose la intensidad de fluorescencia. De este modo, se demostró que la S-nitrosilación de proteínas es una de las vías por la que el NO ejerce su efecto en el ovocito, revelando la importancia del NO en la MIV. The porcine species, owing to their genetic, anatomic, and physiologic similarities with humans, is considered as the ideal animal model for studying and developing novel therapies against human diseases. However, the efficiency of porcine embryo in vitro production (IVP) is nowadays still unacceptably low, because the problem of polyspermic fertilization has still not been adequately worked out and the embryo in vitro culture conditions are still considered to be suboptimal. For these reasons, the present doctoral thesis aims to deepen the understanding of the different factors related to the physiology of the pig oviduct that could be used to modulate the in vitro fertilization (IVF) process and contribute to improve pig embryo IVP systems. Therefore, we investigate three different ways of improvement, in terms of complexity and physiological implications, such as: 1) the oviductal fluid (OF), 2) α-l-fucosidase, 3) nitric oxide (NO). The aim of the first study was to determine the optimal conditions for the OF inclusion in the IVF protocols. For this purpose, in vitro matured oocytes were pre-incubated in OF collected before or after ovulation and subsequently used for IVF. Steroids concentrations in OF were measured and used in IVF experiments. Finally the IVF efficiency was compared between fresh or frozen semen with oocytes preincubated in preovulatory OF. Results showed that pig IVF efficiency improved with preincubation in preovulatory OF. When frozen-thawed semen was used with preovulatory OF incubated oocytes, penetration ability and polyspermy increased. The estradiol (E2) concentration in preovulatory OF was greater than that determined in blood serum at the same phase of the estrous cycle. We conclude that preincubation of oocytes in preovulatory OF or the addition of E2 can be considered suitable tools to increase the efficiency of IVF, only with fresh semen, in the pig. In the second study the role of α-L-fucosidase in pig IVF was investigated. Therefore, the enzyme was added to the IVF medium and a significant increase in sperm binding to the zona pellucida (ZP) and penetration was observed. Thereafter, the sperm-associated α-L-fucosidase was detected by indirect immunofluorescence. In this case, neither the intensity of fluorescence nor the patterns of sperm-associated α-L-fucosidase distribution were affected. Finally, experiments focused on the study of the capacitation events were conducted. The results showed that the addition of exogenous α-L-fucosidase increased the sperm intracellular [Ca 2+] and P-tyrosine phosphorylation, suggesting a role in promoting capacitation and at the same time protecting the sperm cells from premature acrosome reaction. This sequence of events would, in turn, explain the increased ability of this population of treated spermatozoa to bind ZP and penetrate the oocyte. The third study arose to determine the effect of NO during pig oocyte maturation. In vitro maturation (IVM) medium was supplemented with three NOS inhibitors, and a NO donor. The effects on cumulus cells expansion, meiotic resumption, ZP resistance to enzymatic digestion and various parameters related to IVF were studied. The results showed that after IVM, the three NOS inhibitors exerted an inhibitory effect on cumulus cells expansion, while meiotic resumption was suppressed only when the inhibitor aminoguanidine was added. Subsequently, to determine whether the NOS inhibition affect the S-nitrosylation of oocyte proteins, we performed in situ S-nitrosylation and the fluorescence intensity was quantified. Thus, it was shown for the first time that the S-nitrosylation of proteins is one of the ways by which NO exerts its effect on porcine maturation, revealing the importance of NO in both IVM and subsequent fertilization.
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    Effects of environmental cycles (light and temperature) on daily rhythms and its application to fish aquaculture
    (Universidad de Murcia, 2024-12-18) Conti, Francesca; Sánchez-Vázquez, Francisco Javier; López-Olmeda, José Fernando; Bertolucci, Cristiano; Escuela Internacional de Doctorado
    Objetivos, Metodología y Resultados: 1. Diseñar y testar una solución de registro automatizado, bajo coste y fácil manejo para estudiar las preferencias térmicas y la actividad locomotora en peces de interés comercial, tanto diurnos como nocturnos, e investigar si esta preferencia térmica diaria está impulsada o no por relojes circadianos endógenos (Capítulos Exp 1.1 y 1.2). Para ello, se mantuvo a los peces durante un periodo de 28 días en un tanque multicámara personalizado en el que se creó un gradiente térmico. Durante estos 28 días, se sometió a los peces a tres condiciones fóticas diferentes (LD, DL y DD) y se grabó en vídeo su comportamiento. El análisis de vídeo mostró que todas las especies investigadas (diurnas y nocturnas) exhibían un ritmo diario de preferencia térmica que persiste incluso en condiciones DD constante y que, por tanto, está regulado endógenamente por el reloj circadiano. 2. Evaluar la posible preferencia térmica diaria en especies de peces cueva ciegos señalando las variaciones de temperatura como un Zeitgeber factible para estos animales que han evolucionado en ambientes de condiciones constantes y si estos ritmos son endógenos o no (Capítulo Exp 1.2). La metodología aplicada ya se describió en la sección 1. Las dos especies cavernícolas analizadas mostraron un ritmo diario de preferencia térmica, pero éste no persistió en condiciones DD. 3. Delinear si los peces pueden exhibir ritmos diarios de selección de luz y determinar si estos ritmos son endógenos, se probaron diferentes longitudes de onda (blanca y roja) en el modelo experimental de pez cebra (Capítulo Exp 2.1). Para ello, los peces fueron libres de elegir un compartimento (iluminado u oscuro) durante un periodo de 7 días, tras la aclimatación, probando tanto la luz blanca como la roja. Bajo la condición de luz blanca, los peces exhibieron un ritmo endógeno circadiano significativo, eligiendo el compartimento iluminado durante las horas subjetivas del día y el compartimento oscuro durante las horas subjetivas de la noche. 4. Determinar y caracterizar la sincronización fótica a largo plazo de la actividad locomotora y la ritmicidad circadiana endógena en el tetra ciego Mexicano e investigar una posible expresión relativa diaria de genes seleccionados de opsinas no visuales en el cerebro de esta especie (Capítulo Exp 2.2). Se registró la actividad locomotora de los peces a largo plazo y se les mantuvo en diferentes condiciones fóticas (LD, cambio de 6 horas de LD, DD y LLdim). Se tomaron muestras del cerebro de los peces durante 24 horas (cada 4 horas) y posteriormente se procesaron (extracción de ARN y retrotranscripción de ADNc) para estudiar la expresión génica de las opsinas no visuales mediante qPCR en tiempo real. Astyanax mexicanus mostró una significativa sincronización fótica diaria de la actividad locomotora. La persistencia de este ritmo en DD y LLdim confirma su naturaleza endógena y que está controlado por el reloj circadiano. 3 de 6 genes de opsinas no visuales mostraron un ritmo diario de expresión. 5. Describir los posibles efectos en la fisiología de los peces de las dietas con ingredientes emergentes, centrándose en los mecanismos centrales que regulan la ingesta de alimentos en la tilapia del Nilo y la dorada (Capítulo Exp 3). Se alimentó a los peces con tres dietas diferentes (una de control y dos experimentales que contenían ingredientes alternativos al aceite y la harina de pescado) durante 60 días. Al final del ensayo, se tomaron muestras de los cerebros y se procesaron posteriormente para estudiar la expresión de los genes cerebrales de control de la ingesta de alimentos. La tilapia del Nilo aceptó negativamente una dieta experimental (con altos niveles de inclusión de espirulina y quinoa) mientras que la dorada aceptó positivamente las tres dietas probadas. 6. Determinar una posible aplicación de los tratamientos con extractos de microalgas en la cría de peces en cautividad, investigando in vitro la proliferación celular y la actividad migratoria del pez cebra, implicadas en el proceso de cicatrización, y ensayar si estos tratamientos pueden ser dependientes del tiempo (día o noche) en el proceso de cicatrización (Capítulo Exp 4). Para ello, se realizó la técnica de cicatrización de heridas en una línea celular de fibroblastos de aleta caudal de pez cebra y se ensayó un extracto de microalgas (diferentes diluciones y durante diferentes tiempos). La herida tratada durante 30 minutos con una dosis de 1:32 se cerró significativamente antes.
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    Estudio de la expresión génica y de la composición proteica del oviducto. Efectos del fluido oviductal sobre la resistencia de la zona pelúcida a la digestión enzimática en diferentes mamíferos
    (Universidad de Murcia, 2012-07-02) Mondéjar Corbalán, Irene; Coy Fuster, Pilar; Avilés Sánchez, Manuel; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Fisiología
    La fecundación en mamíferos consiste básicamente en la fusión de los gametos masculino y femenino para formar un zigoto capaz de dar lugar a un nuevo individuo. Hasta ahora, la mayoría de las investigaciones encaminadas al esclarecimiento de este proceso se han centrado en el estudio de la biología de ambos gametos como células aisladas, o bien en el estudio de los diversos mecanismos que tienen lugar durante la interacción de ambos. Sin embargo, se ha dejado un poco de lado a otro elemento fundamental y sin el cual el resto de estudios pueden resultar incompletos: el microambiente en el que tiene lugar el encuentro entre los gametos, es decir, el fluido y las células oviductales que secretan ciertos componentes de dicho fluido. La fase folicular tardía o etapa inmediatamente preovulatoria, es el momento en el que el oviducto se encuentra preparado para el encuentro de los gametos y para que se produzca la fecundación. Debido a la importancia de los factor es implicados en la unión de gametos que han de estar presentes en este momento preciso del ciclo estral y a la escasez de información acerca de los mismos, centramos nuestro estudio en esta fase. Para ello, se abordó el análisis de los componentes oviductales y sus características fundamentalmente desde cuatro perspectivas: (1) efecto del fluido oviductal (FO) sobre la resistencia a la digestión enzimática de la zona pelúcida en 9 especies, (2) fraccionamiento del FO bovino en base a su capacidad de unión a heparina, (3) análisis proteómico del FO y (4) análisis de la expresión génica del oviducto porcino. Fertilization in mammals is basically the merging of male and female gametes to form a zygote that can give rise to a new individual. So far, most research aimed at clarifying this process have focused either on the study of the biology of the spermatozoon and the oocyte as isolated cells or in the study of the various mechanisms that occur during the interaction of both. However, it has been partially left to one side to another key element without which the other studies may be incomplete: the microenvironment in which the meeting takes place between the gametes, ie the fluid and the oviductal cells that secrete some components of such a fluid. The late follicular phase or immediately pre-ovulatory phase is the time when the oviduct is prepared for the meeting of gametes and fertilization occurs. Due to the importance of the factors involved in the gametes interaction which must be present at this precise moment of the estrous cycle and the scarcity of information about them, we focused our study on this phase. To do so, it was addressed the analysis of oviductal components and features mainly from four perspectives: (1) effect of oviductal fluid (OF) on the resistance to enzymatic digestion of the zona pellucida in 9 species, (2) fractionation of the bovine oviductal fluid based on their ability to bind to heparin, (3) proteomic analysis of OF and (4) gene expression analysis of pig oviduct.
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    Estudio de la función de la hormona estimuladora del folículo de lubina: su implicación en la espermatogénesis y sus rutas de señalización intracelular
    (2014-12-15) Mazón Moya, Mª José; Zanuy Doste, Silvia; Gómez Peris, Ana; Departamento de Biología Celular e Histología
    El proceso reproductivo en peces, al igual que en el resto de vertebrados, está regulado por una cascada hormonal en la que están implicados el cerebro, la hipófisis y las gónadas, conocido como eje CHG. Dos de las principales hormonas implicadas en el control de la reproducción son las gonadotrofinas FSH (hormona estimuladora del folículo) y LH (hormona luteinizante), ambas producidas en la hipófisis y liberadas tras el estímulo con las hormonas liberadoras de gonadotrofinas (GnRH) y con acción a nivel gonadal. Desde la perspectiva de la producción animal en general, y de la acuicultura en particular, es esencial conocer en la especie a domesticar los mecanismos básicos de control endocrino. Este conocimiento básico es de gran utilidad para poder manipular la reproducción a conveniencia y al mismo tiempo poder desarrollar estrategias terapéuticas para solventar problemas de fertilidad que en ocasiones presentan los stocks de reproductores. Sin embargo, como consecuencia de la limitación en la disponibilidad de herramientas para su estudio, para una gran mayoría de las especies cultivables de peces se desconocen los mecanismos particulares que controlan su reproducción. En esta Tesis se optimiza una alternativa nueva de administración de gonadotrofinas recombinantes, la tecnología conocida como transferencia génica somática. En los capítulos 3 y 4 se inyectaron adultos y juveniles de lubina con construcciones de DNA codificante de las gonadotrofinas de cadena única Lh y Fsh, respectivamente, y se evaluó el incremento de estas hormonas en el torrente sanguíneo. En ambos experimentos las inyecciones de DNA se compararon con la inyección directa de la gonadotrofina recombinante correspondiente. Estos capítulos muestran que las construcciones de DNA se incorporan a las células musculares en el lugar de inyección, y las hormonas codificadas son sintetizadas y liberadas al torrente sanguíneo. Los capítulos 3 y 4 confirman que la transferencia génica somática es una herramienta poderosa para realizar estudios funcionales in vivo con gonadotrofinas, siendo además útil como terapia hormonal en peces, presentándose como alternativa a los tratamientos tradicionales con hCG o GnRH. La funcionalidad de las hormonas recombinantes sintetizadas por las células musculares de lubina tras la incorporación del DNA, se determinó estudiando su efecto en el desarrollo de los testículos. En los capítulos 4 y 5 se evaluó como la acción de la Fsh es esencial para iniciar el proceso de espermatogénesis, promoviendo la proliferación de las espermatogonias, siendo necesaria la acción posterior de la Lh para culminar la espermiación. Los individuos inyectados sólo con el plásmido de Fsh presentaron una espermatogénesis parcial, sin indicios de espermiación, estado que sólo alcanzaron aquellos animales que se inyectaron de manera secuencial con los plásmidos de Fsh y Lh. Estos experimentos también demuestran que la Lh por si sola no es capaz de promover la maduración testicular. Además en los análisis de expresión génica se observó que los tratamientos con Fsh incrementaron la expresión de marcadores de células germinales como piwi, pcna y scp3, mientras que el efecto de la Lh se detectó en enzimas esteroidogénicas como cyp17a1 y cyp17a2. En esta Tesis también se describe cómo una de las acciones más directas de la Fsh es la estimulación de la producción de 11KT. Con el fin de analizar más en detalle la acción específica de la Fsh en la activación de la esteroidogénesis, y de definir mecanismos de regulación conservados entre diferentes especies de peces, se estudió in vitro la acción de la Fsh en cultivo primario de testículo y ovario de lubina y pez cebra. En el capítulo 6 se describe cómo la Fsh emplea principalmente la ruta del AMPc/PKA para transmitir su señal una vez activado su receptor, no siendo ésta la única vía, ya que también es importante la actividad de las MAPK. Haciendo uso de inhibidores y estimuladores de ambas rutas se ha perfilado un escenario en el que la Fsh utiliza de manera independiente las rutas del AMPc/PKA o las MAPK para estimular la transcripción de genes implicados en la esteroidogénesis, como star o cyp19a1a ABSTRACT The reproductive process in fish, as in all vertebrate species, is tightly regulated by a hormonal axis, called BPG, involving the brain, pituitary and gonads. Two major hormones that control reproduction are the gonadotropins FSH (follicle-stimulating hormone) and LH (luteinizing hormone) are both produced at the pituitary level, released to the bloodstream after the stimulus of the GnRH (gonadotropin release hormone), and with action at the gonad level. From a fish farming perspective, it is essential to fully understand the endocrine mechanism underlying reproductive performance. This knowledge is important to manipulate reproductive behaviour and for the development of therapeutic strategies aiming to solve fertility issues frequently present in the broodstocks. However, due to the limited tools available for the vast majority of the cultivable species, the mechanisms controlling their reproduction are not well characterized. This thesis describes an alternative administration of recombinant gonadotropins using the technique of somatic gene transfer. In Chapters 3 and 4, adult and juvenile sea bass were injected with a plasmid DNA encoding Lh and Fsh gonadotropin sequences in a single chain form, and the levels of either GtHs were analysed in the bloodstream. In both experiments the plasma levels of GtHs attained by plasmid DNA injected fish were compared with plasma levels of fish injected with the equivalent recombinant GtH. Both Chapters clearly show that plasmid DNA was efficiently incorporated by the cell muscle, and the encoded hormones were synthetized and released to the bloodstream. These results confirm that somatic gene transfer can be a powerful tool for in vivo functional studies of gonadotropin. In addition, this technique can be used for hormone therapy in fish, and can offer a useful alternative to classic treatments with hCG or GnRH. The functionality of the recombinant hormones synthetized by cell muscles after plasmid DNA injection was evaluated by studying the development of testes. Chapters 4 and 5 describe the crucial role of Fsh in starting the process of spermatogenesis, promoting the proliferation of spermatogonia cells, and its requirements for Lh to reach the spermiation process. Fish receiving only Fsh plasmid injections showed partial spermatogenesis, with no evidence for spermiation. Only the fish injected with Fsh and Lh plasmid sequentially reached this late step of the spermatogenesis process. Fish receiving Lh plasmid alone showed that GtH cannot trigger testis maturation alone. Furthermore, gene expression analysis highlighted the action of Fsh on promoting cell proliferation by increasing the expression of germ cell markers such as piwi, pcna piwi, pcna and scp3. By contrast, the effect of Lh was more obvious in transcript levels of steroidogenic enzymes such as cyp17a1 and cyp17a2. This thesis additionally describes a direct action of Fsh on the stimulation of 11KT production. In order to analyse the specific activity of Fsh on the steroidogenesis process in detail, and to define regulatory mechanisms conserved across fish species, the action of Fsh in vitro was studied using primary gonad tissue culture from sea bass and zebrafish. Chapter 6 describes the use of the signalling pathway cAMP/PKA by Fsh to transduce the signal after the activation of its receptor not clear. Importantly, cAMP/PKA is not the only pathway used by Fsh, the MAPk route is also involved in Fsh signal transduction. The use of cAMP/PKA and MAPk inhibitors and stimulators suggest the possibility that Fsh can use both routes independently to activate the transcription of some steroidogenic genes such as star and cyp19a1a
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    Estudio histoquímico, inmunocitoquímico y ultraestructural de la mucosa digestiva de testudo graeca (Chelonia) / Ricardo Enrique Pérez Tomás ; director José Fco. Ballesta Germán.
    (Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Biología Celular, Histología y Embriología General,, 1987) Pérez Tomás, Ricardo Enrique
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