DigitalUM :: Browsing by Subject "Enzimas"

Browsing by Subject "Enzimas"

Now showing 1 - 20 of 54

Open Access
Activación por lípidos de proteínas quinasas C
(2014-02-07) Egea Jiménez, Antonio Luis; Gómez Fernández, Juan Carmelo; Corbalán García, María Senena; Facultad de Veterinaria
1. OBJETIVOS  Determinación de la función del dominio regulador C2 de la PKCα en la activación provocada por Ca2+, PtdSer y PIP2.  Caracterizar la interacción entre los dominios C1B de las PKC nuevas y fosfolípidos negativos, su especificidad y su dependencia de DOG y PtdOH.  Caracterizar los residuos aminoácidos involucrados en la interacción entre el dominio C1Bε y fosfolípidos negativos (PtdSer, PtdOH y cardiolipina). 2. METODOLOGÍA  Clonación de los dominios C1Bs de las isoenzimas de PKC nuevas (Ɵ, η, δ, ε) y clásica (γ) en vector de expresión de células de mamíferos (pECFP) para estudiar las interacciones lípido-proteína existentes entre ellos a diferentes concentraciones de fosfolípidos negativos, diacilglicerol y forbol-12-miristato acetato a través de la técnica de transferencia de energía por resonancia (FRET).  Purificación de la proteína PKCα silvestre y del mutante del clúster rico en lisinas de esa misma isoenzima utilizando el sistema de expresión de baculovirus para la realización de ensayos de actividad quinasa en presencia de fosfato radiactivo (ATP-32γ) a diferentes concentraciones de calcio, diacilglicerol, fosfatidilserina y PIP2. 3. RESULTADOS DE LA TESIS DOCTORAL 3.1. El phosphatidilinositol 4,5-Bifosfato disminuye la concentración de Ca2+, fosfatidilserina y diacilglricerol requerida para la activación de la PKCα. Los resultados obtenidos en este trabajo son compatibles con el mecanismo secuencial previamente propuesto en nuestro grupo y posteriormente confirmado in vivo. Básicamente, el incremento intracelular en la concentración de Ca2+ es el desencadenante de la translocación de la PKCα a la membrana plasmática. Una vez se llega a este punto, se pueden presentar dos situaciones: en microdominios enriquicidos únicamente con fosfatidilserina, el docking del dominio C2 no es suficiente para liberar el el dominio catalítico del sitio de unión a substrato, como ha sido visto en la estructura 3D recientemente resuelta, el dominio C1B permanecería bloqueando el dominio catalítico. Por todo ello, la presencia de diacilglicerol en las vesículas permite el acoplamiento de al menos el dominio C1A, permitiendo a la enzima su total activación. Una segunda situación puede ser dada cuando los microdominios están enriquecidos con fosfatidilserina y PIP2 en la membrana plasmática. En este caso el dominio C2 se acopla con una diferente orientación ya que se ancla en dos diferentes puntos: Ca2+/PS y PIP2, lo que podría inducir a un cambio conformacional que libera el dominio C1 de la conformación de bloqueo y permite que el substrato tenga acceso al sitio catalítico de la enzima, con la consecuente activación completa de la enzima. 3.2. Los dominios C1B de las PKC nuevos ε Y η tienen una mayor afinidad de unión a membranas que las PKC nuevas θ Y δ. Nuestros resultados muestran que los dominios C1B de las PKCs nuevas tienen diferentes afinidades de unión por membranas modelos, dependiendo de la presencia o no de diacilglicerol y de específicos fosfolípidos negativos. Esto es también observado en células RBL-2H3, en las cuales se han expresado los diferentes dominios C1B. Con todo ello podemos hacer dos grupos de dominios C1B de PKCs nuevas de acuerdo a sus afinidades en unión a membranas: por un lado los dominios C1B de las PKCε y PKCη con una gran afinidad de unión a membranas y aquellos con una baja afinidad, los dominios. 3.3.- Rol de los residuos con carga positiva localizados en el dominio C1Bε y su implicación en la unión de membranas. Los aminoácidos con carga positiva presentes en la parte superior del dominio C1Bε están involucrados en la interacción membrana-proteína Concretamente la lisina K251 y las argininas 268, 282 y 283, y R283, y así ha quedado de manifiesto cuando la substitución de estos residuos por alanina reduce de manera significante la afinidad de unión en los mutantes simples, incrementando en los dobles, hasta anularse por completo en los mutantes triples, incluso en presencia de diacilglicerol. Title: ACTIVATION BY LIPIDS OF PROTEIN KINASE C 1. OBJECTIVES  Determination of the importance of PIP2 in the activation of PKCα through its C2 domain in presence of different lipids and concentrations of calcium ion.  Characterization of the different binding affinities of C1B domains of novel PKCs, their specificity and dependence by DOG and negatively charged phospholipids.  Identification of the amino acidic residues involved in the interaction of C1Bε domain with negatively charged phospholipids. 2. METHODOLOGY  Recombinant DNA cloning of C1B domains and sub cloning to expression vector (pECFP-N). Using the FRET method, the binding of C1B domains to small unilamellar vesicles containing different lipid compositions was studied.  Baculovirus expression system for PKCα production and purifcation by FPLC. The wild type PKCα and the mutant of the lysine-rich cluster were used in assays of kinase activity using radioactive isotopes. 3. RESULTS 3.1. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate decreases the concentration of Ca2+, phosphatidylserine and diacylglycerol required for protein kinase C α to reach maximum activity. The results obtained in this work are compatible with the sequential mechanism previously described in our laboratory. Basically, intracytosolic Ca2+ elevations are the trigger to translocate PKCα to the plasma membrane. Once there, two situations can be found: in microdomains enriched only with phosphatidylserine, the docking of the C2 domain is not enough to liberate the catalytic domain for substrate access, and as seen in the 3D structure recently solved, the C1B domain might still keep blocking the catalytic domain. Due to this, the presence of DAG in the lipid vesicles by docking at least the C1A domain enables the enzyme to gain its full activation. A second situation can be found when the microdomains are enriched in phosphatidylserine and PIP2 at the plasma membrane. In this case, the C2 domain docks in a different orientation since it has to anchor through two different points, i.e. the CBR (Ca2+/PS) and the lysine rich cluster (PIP2), this might induce a conformational change that unleash the C1 domain from the blocking conformation and enables the catalytic domain to access the substrate and consequently full activation of the enzyme. 3.2. The C1B domains of novel PKCε and PKCη have a higher membrane binding affinity than those of the also novel PKCδ and PKCθ. Our results show that the C1B domains from novel PKCs have different binding affinities for model membranes depending on the presence or not of diacylglycerol and of specific anionic phospholipids, and this is also observed in RBL-2H3 cells in which the different C1B domains were expressed. According to these data, two groups of C1B domains from novel PKCs can be established as a function of their membrane binding affinity: those from PKCε and PKCη with a higher membrane binding affinity and those with PKCδ and PKCθ with a low affinity. 3.3. Role of positive charged amino acid residues in the C1B domain of PKCε on membrane translocation and enzymatic activity. The importance of the C1B domain of PKCε for the translocation to the membrane and activation of the enzyme has been broadly confirmed in this work, and in particular, the presence of 4 positively charged amino acid residues present on the top of the domain. These residues would be able to lead the interaction of the C1B domain to the membranes and the punctual mutations that were generated in them, were important enough to decrease the membrane affinities of the C1B domains in FRET studies and the translocation to plasma membrane of the full-length protein in stimulations of RBL-2H3 cells, as well as its enzymatic activity.
Metadata only
Actividad antimicrobiana y antifúngica de las catequinas del té : inhibición del ciclo del ácido fólico y su conexión con otras rutas metabólicas / María Dolores Navarro Martínez; director, José Neptuno Rodríguez López
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-A,, 2009) Navarro Martínez, María Dolores
Open Access
Análisis y simulación de un reactor de lecho fijo de naringinasa inmovilizada en vidrio poroso
(Universidad de Murcia, 2011-03-22) Bastida Rodríguez, Josefa; Bódalo Santoyo, Antonio; Manjón Rubio, Arturo; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Ingeniería Química
Se presenta un modelo matemático para el diseño y simulación de un reactor de lecho fijo con enzimas inmovilizadas en partículas esféricas porosas. La ecuación de diseño del reactor se ha resuelto para el caso de un sistema enzimático, con limitaciones difusionales internas, que obedece a una cinética de Michaelis-Menten reversible. La validez del modelo se ha comprobado con el sistema enzimático naringina/naringinasa, aplicable al proceso de desamargado de zumos cítricos. Abstract A mathematical model for design and simulation of a fixed bed reactor with immobilized enzymes in spherical particles is presented. The reactor design equation is solved for an enzymatic system taking into account internal diffusional limitations. Moreover, the enzyme obeys a reversible Michaelis-Menten kinetic. The validity of the model is checked by using the enzymatic system naringine/naringinase, which is used for fruit juice debbitering processes.
Open Access
Analysis and discrimination between substrates and inhibitors of tyrosinase= Análisis y discriminación entre sustratos e inhibidores de tirosinasa
(2016-07-20) Ortiz Ruiz, Carmen Vanessa; García Cánovas, Francisco; Tudela Serrano, José; Facultad de Biología
OBJETIVOS: Los objetivos fundamentales de esta Tesis Doctoral consisten en la profundización en el mecanismo de actuación e inhibición de la enzima tirosinasa, teniendo en cuenta las actividades monofenolasa y difenolasa, además del establecimiento de una metodología que permita discernir entre moléculas fenólicas inhibidoras y sustratos alternativos de la enzima. También la identificación y caracterización cinética como sustratos de algunas de las moléculas descritas como inhibidores de tirosinasa y usadas como tales en la industria cosmética y / o alimentaria. METODOLOGÍA: Ensayos espectrofotométricos, para realizar medidas de actividad monofenolasa y difenolasa de tirosinasa y estudiar su inhibición; ensayos oximétricos, para realizar medidas de actividad de tirosinasa siguiendo el consumo de oxígeno, cosustrato de la enzima; ensayos de RMN, para determinar los valores de desplazamiento químico los átomos de carbono de las moléculas de interés; ensayos de simulación, para comprobar la validez de los resultados obtenidos experimentalmente; docking computacional, para entender los modos de unión de tirosinasa a distintos ligandos; cromatografía de proteínas en FPLC, para la purificación de la tirosinasa comercial; análisis por regresión lineal y no lineal. CONCLUSIONES: Se ha establecido un diseño experimental que permite discernir entre moléculas fenólicas inhibidoras y sustratos alternativos de tirosinasa, teniendo en cuenta las actividades monofenolasa y difenolasa de la enzima. Las medidas de actividad monofenolasa se deben realizar añadiendo al medio de reacción la cantidad de o-difenol necesaria para suprimir el periodo de retardo que aparece al inicio de los registros de actividad. Siguiendo esta metodología, se han identificado los compuestos alcohol p-hidroxibencílico, tirosol, floretina y floricina como sustratos alternativos de tirosinasa. Se han identificado como sustratos de la enzima a los compuestos 4-hexilresorcinol, descrito como inhibidor y usado en la industria cosmética y alimentaria como despigmentante y antipardeante, y oxiresveratrol, propuesto para los mismos fines debido a su ya descrito efecto inhibidor sobre esta enzima. Estas moléculas son hidroxiladas por la enzima y posteriormente oxidadas a una o-quinona que rápidamente isomeriza a una p-quinona, más estable. Además, estos sustratos han sido caracterizados cinéticamente, llegando a la obtención de los parámetros cinéticos KM (constante de Michaelis) y kcat (constante catalítica). Mediante métodos espectrofotométricos se ha identificado como sustrato de tirosinasa al ácido elágico, compuesto descrito como inhibidor y usado como despigmentante en la industria cosmética. Se ha llevado a cabo su caracterización cinética como sustrato, llegando a la obtención de los valores de KM y kcat. Se ha determinado que el ácido elágico inhibe la ruta de biosíntesis de melaninas por su efecto antioxidante, reaccionando con el anión superóxido, las o-quinonas y semiquinonas producidas durante el proceso. Se investigó el mecanismo de actuación de inhibidores análogos a sustratos fenólicos de tirosinasa, llegando a la conclusión de que aquellos que producen el mismo grado de inhibición en las actividades monofenolasa y difenolasa, se unen a las mismas especies enzimáticas en ambas actividades, siendo el tipo y las constantes de inhibición aparentes también similares. Se estableció una metodología para el estudio de inhibidores de tirosinasa y se observó que los valores de muestran una ligera dependencia de la naturaleza del sustrato, a través de las constantes k2 y k6. Finalmente, se estudió el efecto del pH en la catálisis de tirosinasa. Se propuso que un grupo con un pKa de 4.63 ± 0.04 podría ser el responsable de dicho efecto. Este grupo podría corresponder al ácido glutámico E322, que controlaría el acceso de los sustratos al sitio activo según su estado de protonación. Los protones actúan como inhibidores competitivos, uniéndose a las formas metatirosinasa y oxitirosinasa. El pKa de los hidroxilos fenólicos y la carga de grupo R también son importantes. ABSTRACT OBJECTIVES: The main objectives of this report are (1) to investigate further the mechanisms of action and inhibition of tyrosinase enzyme, considering the monophenolase and diphenolase activities, (2) to establish a methodology in order to distinguish phenolic inhibiting molecules from alternative substrates of the enzyme, and finally, (3) to identify and kinetically characterize as substrates some molecules described as inhibitors in the scientific literature and used as such in the cosmetic and food industries. METHODOLOGY: Spectrophotometric assays, to measure the monophenolase and diphenolase activities of tyrosinase and study its inhibition; oxymetric assays, to measure tyrosinase activity by following the oxygen consumption (oxygen is a cosubstrate of the enzyme); RMN assays, to determine carbon atom chemical shift values of the molecule of interest; simulation assays, to test the validity of the experimental results; computational docking, to understand the binding modes of tyrosinase with different ligands; protein chromatography in FPLC equipment, to purify commercial tyrosinase; lineal and non-lineal regression. CONCLUSIONS: An experimental design has been established which permits to distinguish inhibiting phenolic molecules from alternative substrates of tyrosinase, considering the monophenolase and diphenolase activities of the enzyme. The measurements of the monophenolase activity should be made by adding the quantity of o-diphenol, needed to abolish the lag period at the beginning of the activity recordings, to the reaction medium. The compounds p-hydroxybenzyl alcohol, tyrosol, phloretin and phloridzin have been identified as alternative substrates of tyrosinase, by following this methodology. The compounds 4-hexylresorcinol, described as inhibitor and used in the cosmetic and food industries as a depigmenting and anti-browning agent, and oxyresveratrol, proposed for the same purposes due to the described inhibitory effect on this enzyme, have been identified as tyrosinase substrates. These molecules are hydroxylated by the enzyme and subsequently oxidized to an o-quinone, which rapidly isomerizes to a more stable p-quinone. Moreover, these substrates have been kinetically characterized, obtaining the kinetic parameters KM (Michaelis constant) and kcat (catalytic constant). Ellagic acid, a compound described as inhibitor and used as a depigmenting agent in the cosmetic industry, has been identified as a tyrosinase substrate by spectrophotometric methods. Its kinetic characterization as a substrate has been carried out, obtaining the KM and kcat values. It has been determined that ellagic acid inhibits the melanin biosynthesis pathway due to its antioxidative effect, by reacting with superoxide anions, o-quinones and semiquinones produced during the process. The action mechanism of inhibitors which are analogous to phenolic substrates was studied. We concluded that those inhibitors which produce the same degree of inhibition on the monophenolase and diphenolase activities, bind to the same enzymatic species in the two activities, being the type and the apparent inhibition constants the same too. A methodology was established in order to study tyrosinase inhibitors. It was observed that values show a slight dependence on the substrate nature, through the constants k2 and k6. Finally, the pH effect on the catalysis of tyrosinase was studied. It was proposed that a group with a pKa value of 4.63 ± 0.04 might be responsible for this effect. This group could correspond to the glutamic acid E322, which would control the substrate access to the active site depending on its protonation state. Protons act as competitive inhibitors, binding to the met-tyrosinase and oxy-tyrosinase forms. The pKa value of the phenolic hydroxyl groups and the charge of the R group are important too.
Open Access
Aspectos clínico-biológicos de la patología molecular del factor XI
(2016-11-30) Esteban Medina, Julio Agustín; Vicente García, Vicente; Corral de la Calle, Javier; Escuela Internacional de Doctorado
Introducción Recientes evidencias sustentan la relevancia hemostática del FXI y sugieren nuevos papeles para este factor procoagulante. Su deficiencia, considerada un desorden raro, podría estar subestimada por la escasa clínica hemorrágica y por las limitaciones de los métodos empleados en su diagnóstico. Objetivo El objetivo de este estudio fue caracterizar la deficiencia de FXI en un área de 60.000 habitantes de la Región de Murcia, valorando su incidencia, estudiando la base molecular de la deficiencia en los casos identificados, evaluando los sistemas diagnósticos y analizando sus implicaciones clínicas. Metodología En 20 años (1994-2014) se realizaron 324.764 tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa) en 51.366 pacientes, seleccionando 1.700 que presentaron una ratio prolongada (> 1,3). Estudios de la vía intrínseca en estos casos permitió identificar 44 casos índice no relacionados con deficiencia de FXI (FXI:C< 70%). En 41 casos se realizó un estudio familiar que permitió reclutar un total de 214 casos con deficiencia de FXI. El FXI plasmático se estudió mediante Western-blot. El análisis genético incluyó secuenciación (Sanger y NGS), MLPA y genotipado con sondas taqman. Resultados Identificamos 7 casos con deficiencia de FXI en homocigosis, 3 en heterocigosis compuesta y 204 en heterocigosis. Describimos 4 mutaciones recurrentes: p.Cys56Arg (descrita en población vasco-francesa), p.Cys416Tyr, p.Glu565Lys y p.Pro538Leu identificadas en 23, 7, 6 y 2 casos índices respectivamente. Además, otras 8 mutaciones diferentes se detectaron en 7 casos índices, 4 de ellas no descritas previamente, incluyendo la primera gran inserción descrita a nivel mundial. Dos mutaciones, una de ellas nueva, provocaban deficiencia CRM+ (proteína variante en plasma pero sin actividad funcional). La ratio del TTPa no estaba prolongada en 54/214 casos con deficiencia de FXI (25.2%). La incidencia de sangrado espontáneo fue escasa (13.7%) y el sangrado muy moderado (epistaxis). Únicamente el 5.8% de las 207 intervenciones quirúrgicas y el 4.2% de los 122 partos presentaron complicaciones hemorrágicas, y solo 2 pacientes precisaron transfusiones. La mayor incidencia de hemorragias se produjo en intervenciones que afectaban tejidos con alta actividad fibrinolítica. La tasa de eventos hemorrágicos fue similar independientemente de la administración profiláctica de plasma fresco congelado (PFC) (realizada en 58 ocasiones). Sin embargo, el PFC causó lesión pulmonar aguda asociada transfusión (TRALI) en dos pacientes. Destacamos la ausencia de complicaciones hemorrágicas en 9 pacientes con deficiencia de FXI bajo tratamiento anticoagulante (mayoritariamente por fibrilación auricular) durante un total de 382 meses. Seis casos presentaron infarto agudo de miocardio y 8 ictus isquémico. Sin embargo, solo 2 casos, con motivos locales predisponentes, sufrieron trombosis venosa, a pesar de que 16 pacientes también eran portadores del FV Leiden o Protrombina G20210A. Conclusiones Identificamos una alta prevalencia de deficiencia de FXI con notable variabilidad genética en un área de la Región de Murcia, encontrando 12 mutaciones diferentes, de las cuales 4 no estaban descritas. Estos resultados junto con la elevada incidencia de falsos negativos del TTPa y la escasa clínica hemorrágica de portadores, sugieren que la incidencia de este desorden en población general está subestimada. La deficiencia de FXI no incrementa notablemente el riesgo hemorrágico ni siquiera si se combina con tratamiento anticoagulante oral. La administración de PFC profiláctico no supone beneficio pero puede tener importantes efectos adversos. La deficiencia de FXI, al menos en heterocigosis, no parece proteger de la trombosis arterial, pero podría proteger del desarrollo de trombosis venosa. Estos resultados, compatibles con los modelos animales y ensayos clínicos de silenciamiento de FXI, junto a la potencial alta incidencia de esta deficiencia, apoyan incluir el estudio de este desorden en las pruebas de trombofilia para definir el riesgo trombótico de cada individuo. ABSTRACT Introduction Recent studies show increasing evidences suggesting a relevant hemostatic function for factor XI (FXI) and prove new roles for this procoagulant factor. FXI deficiency, considered as a rare disorder, might be underestimated due to the low bleeding risk of carriers and the limitations of current diagnostic methods. Objective The main objective of this study was to characterize the FXI deficiency in a Region of 60.000 inhabitants from Murcia (South East of Spain). We aim to determine the incidence, to identify the molecular base, as well as to know the clinical consequences of FXI deficiency. Moreover, we want to evaluate the feasibility of current diagnostic methods. Methods During 20 years, (1994-2014) 324.764 activated partial thromboplastin time tests (aPTT) were done in 51.366 patients. 1.700 cases with a prolonged ratio (> 1,3) were selected. Studies of the intrinsic pathway on these cases allowed the identification of 44 unrelated index cases with FXI deficiency (FXI:C< 70%). In 41 cases, a further family study allowed to recruit finally 214 cases with FXI deficiency. Plasma FXI was evaluated by Western-blot. Genetic analysis included sequencing (by Sanger’s method and by Next Generation Sequencing), MLPA and genotyping using Taqman probes. Results We identified 7 cases with FXI deficiency in homozygosis; 3 in compound heterozygosis and 204 in heterozygosis. We described 4 recurrent mutations: p.Cys56Arg (described in French Basques), p.Cys416Tyr, p.Glu565Lys and p.Pro538Leu identified in 23, 7, 6 and 2 index cases, respectively. Other 8 additional and different mutations were detected in 7 index cases, 4 of them not reported previously, including the first gross insertion described worldwide. Two mutations, one new, caused CRM+ deficiency, with variant protein in plasma that has no functional activity. The aPTT ratio was not prolonged in 54 out of 214 cases with FXI deficiency (25.2%). The incidence of spontaneous bleeding was low (13.7%), and mild (epistaxis). Only 5.8% of the 207 surgery interventions, and 4.2% of the 122 deliveries showed bleeding complications, although only 2 required transfusions. Most bleedings were observed when the surgery involved tissues with high fibrinolytic activity. The rate of bleeding events was similar independently of the prophylactic use of fresh frozen plasma (FFP) (used 58 times). However, we point out that FFP caused transfusion associated lung injury (TRALI) in two patients. We also remark the absence of bleeding complications in 9 patients with FXI deficiency who were under oral anticoagulant treatment (mainly by atrial fibrillation) during a period of 382 months. Six cases developed acute myocardial infarction, and 8 ischemic cerebrovascular events. In contrast, only 2 cases, with local risk factors, suffered from venous thrombosis, even though 16 patients with FXI deficiency also carried other prothrombotic polymorphisms (FV Leiden or prothrombin G20210A) Conclusions We identify a high prevalence of FXI deficiency in a population of Murcia, with remarkable genetic variability, finding 12 different mutations, 4 not previously reported in available mutation databases. These results, together with the high incidence of false negatives rendered by aPTT and the low risk of bleeding for carriers strongly support that FXI deficiency may be underestimated in the general population. FXI deficiency does not significantly increase the risk of bleeding, even in combination with oral anticoagulant treatment. The prophylactic administration of FFP in subjects with FXI deficiency does not significant reduce the bleeding complications during surgery, but might increase the risk of severe side effects. FXI deficiency, at least in heterozygosis, does not seem to protect from arterial thrombosis, but could protect against venous thrombosis, even in subjects carrying other prothrombotic genetic risk factors. These results, which are compatible with recent data obtained with animal models and clinical trials, support to include tests for diagnosis of FXI deficiency in thrombophilic patients in order to define the individual risk of thrombosis, aiming to get a personalized medicine.
Open Access
Caracterización cinética de la catálisis, inactivación suicida e inhibición irreversible de tirosinasa
(2012-09-18) Muñoz Muñoz, José Luis; García Cánovas, Francisco; Rodríguez López, José Neptuno; Tudela Serrano, José; Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-A
En esta Tesis Doctoral se ha profundizado en el mecanismo cinético de actuación de tirosinasa sobre distintas parejas monofenol/o-difenol. A partir de los resultados obtenidos, se puso de manifiesto que la afinidad de la enzima por oxigeno es mayor en la ruta favorecida que en la ruta lenta. Se ha demostrando cinéticamente que desoxitirosinasa existe en dos formas: relajada y tensa (mayor distancia entre los átomos de cobre). Gracias a este estudio, se han determinado dos pKas críticos en tirosinasa. En relación a la caracterización de sustratos de tirosinasa, se han desarrollado una serie de métodos de medida que han permitido caracterizar una gran variedad de o-difenoles, trifenoles, flavonoides y compuestos no fenólicos como aminas aromáticas y o-aminofenoles. Por otra parte, se han realizado estudios cinéticos sobre el proceso de inactivación suicida que sufre tirosinasa cuando actúa sobre sus sustratos proponiendo un mecanismo estructural que explica los resultados obtenidos. In this Doctoral Thesis, we have depth on the kinetic mechanism of action of tyrosinase acting on different pairs of monophenol/o-diphenol substrates. The results obtained revealed that the affinity of the enzyme for oxygen is greater in the kinetically preferred pathway than in the slow pathway. It has been demonstrated kinetically that deoxytyrosinase exists in two forms: relaxed and tense (greater distance between copper atoms). Thanks to this study, we have identified two critical pKas in tyrosinase. Relating to the characterization of tyrosinase substrates, we have developed a series of measurement methods that allow the characterization of a variety of o-diphenols, triphenols, flavonoids and non-phenolic compounds such as aromatic amines and o-aminophenols. Furthermore, kinetic studies have been conducted on the suicide inactivation process that tyrosinase suffers when acting on their substrates and a structural mechanism that explain the obtained results has been proposed.
Metadata only
Caracterización cinética del mecanismo de reacción en las actividades enzimáticas monofenolasa y difenolasa de tirosinasa / Mº José Peñalver Jara; directores, Francisco García Canóvas, José Tudela Serrano y José Neptuno Rodríguez López.
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-A,, 2006) Peñalver Jara, María José
Metadata only
Caracterización cinética del mecanismo de reacción y la especificidad de sustrato de peroxidasa / Mª Angeles Gilabert García ; dirección, Francisco García Cánovas, José Tudela Serrano y José Neptuno Rodríguez López.
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-A,, 2004) Gilabert García, María Angeles
Open Access
Caracterización cinetica y aplicaciones biotecnológicas de Lacasa.
(2013-12-03) Martínez Ruiz, Jesús; Tomás Martínez, Virginia; Tudela Serrano, José; Facultad de Biología
Objetivos • Caracterización cinética de la oxidación de diversas fenotiazinas comerciales, catalizada por lacasa, mediante un método espectrofotométrico, útil para posibles ensayos de gestión de la calidad en industrias farmacéuticas. • Desarrollo de un método espectrofotométrico apropiado, para la caracterización cinética de sustratos fenólicos de lacasa, que originan productos cromofóricos inestables. • Optimización de la biodegradación enzimática de clorofenoles recalcitrantes como TCP y PCP, con peróxido de hidrógeno y peroxidasa sin mediadores sintéticos. • Optimización de la biodegradación enzimática de TCP por oxígeno molecular, catalizada por lacasa en presencia de mediadores naturales, sin mediadores sintéticos ni peróxido de hidrógeno. • Determinación enzimática y espectrofotométrica de tioles, y aplicación a ensayos de gestión de la calidad de fármacos tiólicos, superando a otros métodos instrumentales alternativos. • Análisis cuantitativo de ácido ascórbico, en muestras sintéticas y en fármacos, utilizando un nuevo método enzimático y espectrofotométrico, capaz de superar a otros métodos ópticos y electroquímicos. Metodología Ensayos espectrofotométricos Los espectros de absorción fueron registrados con un espectrofotómetro de visible-ultra violeta Perkin-Elmer Lambda 35, otros datos cinéticos o de punto final en la zona del visible fueron obtenidos mediante un lector de microplaca SpectraMax 340PC384. Ensayos de cromatografía líquida líquida de alta resolución (HPLC) Los cromatogramas realizados se llevaron a cabo con un cromatógrafo HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution. Las especies eluídas fueron monitorizadas a diferentes longitudes de onda, tomando el máximo de absorción para cada una de ellas. Ensayos de cromatografía de gases acoplada a detector de espectrometría de masas (GC-MS) Los espectros de masas fueron realizados con un espectrómetro de masas Agilent 5975 acoplado a un cromatógrafo de gases Agilent 7890N. Ensayos espectrofluorométricos Los espectro de fluorescencia fueron registrados con un lector de placas fluorescente GeminiTM XPS. Ensayos oximétricos Las medidas de evolución de consumo de oxígeno fueron medidas con un electro de tipo Clark acoplado a un oxígrafo Hansatech. Caracterización cinética de fenotiazinas y sustratos fenólicos La oxidación de diferentes fenotiazinas y sustratos fenólicos por lacasa procedente de Trametes villosa (TvL), fue seguida por la absorbancia de cada uno de los cationes radical cromofóricos. Parámetros cinéticos como la absorbancia máxima (Amax), o su cuadrado (Amax2) y la velocidad en estado estacionario VSS fueron determinados. Biodegradación enzimática de clorofenoles La biodegradación de contaminantes clorados fue llevada a cabo por dos tipos de enzimas, lacasa (TvL) como enzima principal de estudio, y peroxidasas de sofá y rábano (SBP y HRP, respectivamente), con el fin de contrastar los rendimientos de biodegradación del 2,4,6-triclorofenol y del pentaclorofenol (PCP). Conclusiones • Se ha caracterizado cinéticamente la oxidación de varias fenotiazinas comerciales por lacasa, comprobando los efectos de diversas variables experimentales, sobre la formación enzimática y la destrucción no enzimática, de sus correspondientes radicales cromofóricos. • Se ha conseguido desarrollar un método espectrofotométrico simple, fiable y eficaz para la caracterización cinética de sustratos fenólicos de lacasa que originan productos cromofóricos inestables, superando los inconvenientes de los métodos espectrofotométricos de velocidad inicial. • El uso de peróxido de hidrógeno con peroxidasas de rábano picante (HRP) y de soja (SBP), ha demostrado ser una buena alternativa para la biodegradación enzimática de clorofenoles recalcitrantes, como TCP y PCP. • Se ha conseguido optimizar el proceso, ofreciendo un método rápido, eficaz, sin peróxido de hidrógeno, y medioambientalmente sostenible, superando a otros métodos que utilizan mediadores sintéticos, con alto coste y toxicidad. • La elevada reproducibilidad de los métodos enzimáticos con lacasa para la determinación de tioles y de ácido ascórbico, ha indicado una satisfactoria precisión de los mismos. • La validez de los métodos enzimáticos con lacasa respecto a métodos de referencia, para la determinación de D-penicilamina o de ácido ascórbico en fármacos, ilustra su aplicabilidad para el análisis de muestras reales, especialmente de principios activos reductores como tioles y ácido ascórbico. En consecuencia, se han alcanzado satisfactoriamente, los objetivos propuestos al comienzo de esta Tesis Doctoral. Objectives • Kinetic characterization of the oxidation of several commercial phenothiazines catalyzed by laccase, using a spectrophotometric assay, useful for quality management assays in pharmaceutical industries. • Development of an appropriate spectrophotometric assay, for the kinetic characterization of phenolic substrates, which produce unstable chromophoric products. • Optimization of the enzymatic biodegradation of recalcitrant chlorophenols like TCP and PCP, with hydrogen peroxide and peroxidase in the absence of synthetic mediators. • Optimization of the enzymatic biodegradation of TCP by molecular oxygen, catalysed by laccase in the presence of natural mediators, and without synthetic mediators neither hydrogen peroxide. • Enzymatic and spectrophotometric determination of thiols, and application in quality management assays of thiolic drugs, with improved performance than other instrumental alternative assays. • Quantitative analysis of ascorbic acid, in synthetic samples and drugs, using a new enzymatic and spectrophotometric assay, that offer better specifications than other optical and electrochemical assays. Methodology Spectrophotometric assays Absorption spectra were recorded in a visible-ultraviolet Perkin-Elmer Lambda 35 spectrophotometer and other data adquisition in endpoint or kinetic were recorded with an absorbance microplate reader SpectraMax 340PC384. Liquid chromatography Chromatograms were realized with an HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution chromatograph. The monitoring of the eluted species was performed at different wavelengths, taking the maximum absorbance wavelengths of the different substances. Gas chromatography/Mass spectrometry Mass spectra were realized with a Mass spectrometer Agilent 5975 coupled to a gases chromatograph Agilent 7890N. Spectrofluorometric assays Fluorescence spectra were recorded in a fluorescence microplate reader GeminiTM XPS. Oxymetric assays Oxygen evolution was measured with a Clark-type electrode coupled to a Hansatech Oxygraph. Kinetic characterization of phenothiazines and phenolic substrates The oxidation of different phenothiazines and phenolic substrates by laccase from Trametes villosa (TvL), was monitored recording the absorbance of each chromophoric radical cation. Kinetic parameters as maximum absorbance (Amax), maximum square absorbance (Amax2) and the steady-state rate VSS were determined. Enzymatic biodegration of chlorophenols The biodegradation of chlorophenolic pollutants were carried out with two kind of enzymes, laccase (TvL) as the main research one, and peroxidase (SBP and HRP) to constrast the biodegradation yields of 2,4,6-trichlorophenol (TCP) and pentachlorophenol (PCP). Conclusions • The oxidation of several commercial phenothiazines with laccase has been kinetically characterized, checking the effects of many experimental variables, on the enzymatic formation and non-enzymatic breakdown, of their corresponding chromophoric radicals. • A simple, reliable and effective spectrophotometric method has been developed, for the kinetic characterization of phenolic substrates of laccase that generate unstable chromophoric products, overcoming the drawbacks of the spectrophotometric methods of the initial rate. • The use of hydrogen peroxide with horseradish peroxidase (HRP) and soybean peroxidase (SBP), has demonstrated to be a great alternative for the enzymatic biodegradation of recalcitrant chlorophenols, like TCP and TCP. • The process has been optimized, offering a method that is fast, effective, without hydrogen peroxide, and environmentally sustainable, overcoming other methods that use synthetic mediators, with high cost and toxicity. • The high reproducibility of the enzymatic methods with laccase to determine thiols and ascorbic acid, has shown a successful precision of these methods. • The validity of the enzymatic methods with laccase with respect to reference methods, for the determination of D-penicillamine or ascorbic acid in drugs, show their applicability to analyse real samples, especially reductant active ingredients like thiols and ascorbic acid. In consequence, the proposed objectives at the beginning of this Doctoral Thesis have been successfully reached.
Open Access
Caracterización cinética y aplicaciones biotecnológicas de peroxidasas
(2014-07-22) Parra Carrillo, Magdalena; Tomás Martínez, Virginia; Tudela Serrano, José; Facultad de Biología
Objetivos • Estudio de la bibliografía especializada y realización de ensayos preliminares que permitan la proposición de un mecanismo de reacción sometido a análisis cinético, que aporte expresiones útiles para un diseño experimental , aplicable para comprobar la validez del mecanismo de reacción planteado, así como para la caracterización cinética de los sistemas enzimáticos investigados, superando a otros métodos descritos en la bibliografía. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación enzimática por peroxidasas, de los colorantes Índigo Carmín (IC) y Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR), mediante un método espectrofotométrico. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación de IC, por sistemas enzima-mediador en presencia de mediadores naturales. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación de RBBR por sistemas enzima-mediador en presencia de mediadores naturales. • Caracterización cinética y optimización de la determinación de fenoles con aplicaciones biotecnológicas, mediante un método espectrofotométrico y ultrasensible de bioanálisis enzimático. Metodología Ensayos espectrofotométricos Los espectros de absorción fueron registrados con un espectrofotómetro de visible-ultra violeta Perkin-Elmer Lambda 35, otros datos cinéticos o de punto final en la zona del visible fueron obtenidos mediante un lector de microplaca SpectraMax 340PC384. Ensayos de cromatografía líquida líquida de alta resolución (HPLC) Los cromatogramas realizados se llevaron a cabo con un cromatógrafo HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution. Las especies eluídas fueron monitorizadas a diferentes longitudes de onda, tomando el máximo de absorción para cada una de ellas. Biodegradación de IC con peroxidasas La reacción se realizó en tubos de plástico con una concentración de enzimas HRP y SBP que varió entre 2.5-30 nM , la concentración de contaminante entre 10-120 M y la de peróxido de hidrógeno también entre 10 y 120 M , todo ello a pH óptimo de 10 mM de tampón citrato de pH 5.0 y 4.0 para HRP y SBP respectivamente, a 25 ºC.Se analizaron las reacciones en el espectrofotómetro y en el HPL, determinando los parámetros cinéticos como la absorbancia máxima (Amax), la velocidad en estado estacionario VSS y la constante de biodegradación (). Biodegradación de IC con sistemas lacasa/peroxidasa-mediador Se comparó el estudio a 25 ºC de SBP con el de TvL para la degradación de IC entre con los mediadores MSG, ASG, SGA y SGO con el fin de contrastar los rendimientos de biodegradación del colorante. Biodegradación de RBBR con sistemas lacasa-mediador Se optimizaron las condiciones de reacción para la degradación de RBBR con sistemas EML a temperatura ambiente, eligiendo el sistema mediador más eficaz para dicha reacción. Bioanálisis enzimático de fenoles Se diseña y optimiza un método de análisis enzimático espectrofotométrico para el análisis de distintos tipos de fenoles industriales (fármacos, contaminantes y fitoquímicos). La reacción se realiza en presencia de AA como reductor acoplado y biomolécula detectora, catalizada por HRP. Conclusiones • Se ha caracterizado cinéticamente y optimizado la biodegradación enzimática de IC y RBBR por H2O2, catalizada por las peroxidasas HRP y SBP, mediante un método espectrofotométrico • Se ha conseguido la caracterización cinética y la optimización de la biodegradación enzimática del IC, por varios sistemas enzima-mediador (EMS). En concreto, las enzimas SBP con H2O2 y TvL con O2, en presencia del premediador natural SGO, y de los mediadores naturales, MSG, ASG y SGA. • Se ha estudiado la caracterización cinética y la optimización de la biodegradación enzimática de RBBR por TvL con O2, ante el premediador natural SGO y los mediadores naturales MSG, ASG y SGA. • Se ha desarrollado un método espectrofotométrico y ultrasensible de bioanálisis enzimático, útil para la determinación de concentraciones nanomolares, de diferentes contaminantes, fármacos y fitoquímicos fenólicos de interés biotecnológico. En consecuencia, se han alcanzado satisfactoriamente, los objetivos propuestos al comienzo de esta Tesis Doctoral. Objectives • Kinetic characterization and optimization of a spectrophotometric method, for the enzymatic biodegradation by peroxidases, of the dyes Indigo Carmine (IC) and Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR). • Kinetic characterization and optimization of the IC biodegradation, by enzyme-mediator systems in the presence of natural mediators. • Kinetic characterization and optimization of the RBBR biodegradation, by enzyme-mediator systems with natural mediators. • Kinetic characterization and optimization of the determination of bioactive phenols, by using a spectrophotometric and ultrasensitive method of enzymatic bioanalysis. Methodology Spectrophotometric assays Absorption spectra were recorded in a visible-ultraviolet Perkin-Elmer Lambda 35 spectrophotometer and other data adquisition in endpoint or kinetic were recorded with an absorbance microplate reader SpectraMax 340PC384. Liquid chromatography Chromatograms were realized with an HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution chromatograph. The monitoring of the eluted species was performed at different wavelengths, taking the maximum absorbance wavelengths of the different substances. Biodegradation of the dyes IC and RBBR by POD. This chapter describes a new ecofriendly alternative for removal Remazol Brilliant Blue (RBBR) and Indigo Carmine by soybean (SBP) and horseradish (HRP) peroxidases. Thus, studies for optimization of reaction conditions (pH, concentration of enzymes/substrates/hydrogen peroxide) have been proposed. Biodegradation of IC by enzyme-mediator systems. A reaction mechanism is proposed beside the pH results. This mechanism involves enzymatic and nonenzymatic reactions, in which a premediator (PM), mediator (M) and the mediator radical (MR) are considered. Vss values were determined from enzymes, mediator and IC effects. Thus, the assay conditions for biodegradation of IC, with the enzyme-mediator systems, were optimized. Vss values were determined from enzyme, mediator and RBBR effects. The experimental data obtained confirmed the reliability of the reaction mechanism proposed. Thus, the assay conditions for biodegradation of RBBR, with the enzyme-mediator systems, were optimized. Biodegradation of RBBR by laccase-mediator systems. Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR) biodegradation was carried out by laccase from Trametes villosa (TvL) using the natural mediators ASG, MSG, SGA and SGO Enzymatic bioanalysis of phenols. A number of analytical methods with different sensitivity, complexity, quickness and cost have been proposed The aim of this chapter is the possible determination of phenols of biotechnological interest, in nanomolar concentrations, by using an enzymatic and spectrophotometric method of bioanalysis, easy, quick and with low cost. Conclusions • It has characterized kinetically and optimized the enzymatic biodegradation of IC and RBBR by H2O2, catalyzed by the peroxidases HRP and SBP, with a spectrophotometric method. • It has reached the kinetic characterization and the optimization of the enzymatic biodegradation of IC, by several systems enzyme-mediator (EMS). In particular, the enzyme SBP with H2O2 and TvL with O2, in presence of the natural premediator SGO and the natural mediators MSG, ASG and SGA. • It has been studied the kinetic characterization and the optimization of the enzymatic biodegradation of RBBR by TvL and O2, with the natural premediator SGO and the natural mediators MSG, ASG and SGA. • It has carried out a spectrophotometric and ultrasensible method of enzymatic biodegradation, useful for the determination of nanomolar concentrations of different phenolic contaminants, drugs and phytochemicals of biotechnological interest. In consequence, the proposed objectives at the beginning of this Doctoral Thesis have been successfully reached.
Open Access
Caracterización cinética y molecular de nicotin desaminasas y aldolasas mediante enzimas acopladas = Kinetic and molecular characterization of nicotin deamidases and aldolases using couple enzymes.
(2013-04-15) Sánchez Carrón, Guiomar; Sánchez Ferrer, Álvaro; García Carmona, Francisco; Facultad de Biología
El objetivo de esta tesis fue la búsqueda de nuevas aldolasas y nicotin desaminasas bacterianas con características mejoradas para la producción de compuestos con interés farmacéutico y biotecnológico. En primer lugar, se clonó y caracterizó una ácido Nacetilneuramínico aldolasa de Lactobacillus plantarum, que se utilizó como molde para la creación de librerías de evolución dirigida. Se desarrollo un método de ensayo de alto rendimiento para esta librería de evolución dirigida, utilizando una L-lactato deshidrogenasa de Bacillus halodurans como enzima acoplada. 2 nuevas enzimas involucradas en el metabolismo del NAD se clonaron y caracterizaron: una nicotinaminidasa y una nicotinamida mononucleótido (NMN) desaminasa, ambas obtenidas del extremófilo Oceanobacillus iheyensis HTE831. Se desarrollo también un método de cribado de alto rendimiento para nicotinaminidasas, basado en el uso de una glutamato deshidrogenasa clonada de Bacillus halodurans. Además, se describió por primera vez un método de medida espectrofotométrico para la NMN desaminasa. Resumen en Inglés: The main objective was the search for new bacterial aldolases and nicotin deamidases with improved characteristics for the production of compounds with pharmaceutical and biotechnological interest. In first instance, the cloning and characterization of the novel N-acetylneuraminic acid aldolase from Lactobacillus plantarum was achieved and it was used as template for directed evolution experiments. A high-throughput screening method for this directed evolution library was developed using a novel L-lactate dehydrogenase from Bacillus halodurans as coupling enzyme. Two novel enzymes involved in the NAD+ metabolism were also cloned and characterized: a nicotinamidase and a nicotin mononucleotide (NMN) deamidase, both from the extremophile Oceanobacillus iheyensis HTE831. A high-throughput screening method for nicotinamidases was also developed, based on the use of a cloned glutamate dehygrogenase from Bacillus halodurans. Furthermore, a novel spectrophotometric screening method was described for the first time for the enzyme nicotinamide mononucleotide deamidase.
Open Access
Caracterización de la inulinasa e invertasa en Candida utilis
(Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones, 1985) Ros Espín, Rosa María; Argüelles Ordóñez, Juan Carlos; Gacto Fernández, Mariano José; Facultad de Biología
lnvertase (E.C. 3.2.1.26) and inulinase (E.C. 3.2.1. 7) were analyzed in Candida utilis CECT 1061 to determine whether one single enzyme with both activities or two enzymes with different substrate specificities were present in this yeast. The synthesis of both fructofuranosidase activities was under control of catabolite repression by glucose and they were present in whole cell extracts as well as in the extracellular culture fluids. The cell-associated activities appear mostly located in the periplasmic space. The two activities exhíbited an identical optimum pH and similar profiles of thermal denaturation. In addition, a constan! ratio was found between the inulinase and the invertase activities in a variety of culture condítions when extracellular media or cell extracts were assayed. From the results obtained it was concluded that both activities reside in a same protein of molecular weight close to 450,000 dalton which shows a different affiníty for sucrose and inuline, Km values were 14 and 0,62mM. respectively.
Metadata only
Caracterización de nuevas esterasas con interés biotecnológico obtenidas mediante clonación directa y metagenómica /José Navarro Fernández; directores, Alvaro Sánchez Ferrer, Francisco García Carmona.
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-A,, 2010) Navarro Fernández, José Luis
Open Access
Caracterización del estado de acoplamiento de las preparaciones de retículo sarcoplásmico e interacción de la Ca2+.ATPasa con vanadato.
(Universidad, Servicio de Publicaciones, 1984) Ortiz López, Antonio
El estado de acoplamiento (relación Ca transportado/ATP hidrolizado) de las preparaciones de vesículas de retículo sarcoplásmico se puede determinar por medidas de actividad ATPasa dependiente de calcio por medio del uso de un pHmetro. Dicha relación se ha calculado en unos 2 moles Ca^/mol ATP, valor que está de acuerdo con los datos de la bibliografía. Se estudia el efecto del ionóforo de calcio X537A (lasalócido) y del detergente no iónico CuEg sobre las preparaciones de vesículas de retículo sarcoplásmico. Su acción se traduce en un aumento de la actividad ATPasa dependiente de calcio como consecuencia de que inducen un aumento de la permeabilidad de la membrana al Ca+, permaneciendo inalterada la ATPasa basal (independiente de calcio). Se describe un método de desacoplamiento de las preparaciones de vesículas de retículo sarcoplásmico, por tratamiento con EGTA a 37° C. Dicho desacoplamiento produce un significativo aumento de la actividad ATPasa dependiente de calcio no afectando a la actividad ATPasa basal. Se han utilizado preparaciones de ATPasa nativa, desacoplada por tratamiento con EGTA y purificada con detergentes (octilglucósido o colato), para estudiar la interacción de los iones vanadato con el enzima. La constante de disociación del complejo enzima-vanadato depende de la historia previa del enzima y, por lo tanto, se ha visto que son diferentes para las diferentes preparaciones mencionadas anteriormente. Se ha observado que la interacción del vanadato con la Ca^-ATPasa es un proceso lento, presentándose un proceso histerético cuando se ensaya actividad ATPasa, de vesículas preincubadas con vanadato, en presencia de los sustratos Ca^ y ATP.
Open Access
Caracterización funcional de la tiorredoxina Trxo1 de Pisum sativum y Arabidopsis thaliana : estudio en germinación y bajo condiciones inductoras de estrés oxidativo
(2015-05-22) Ortíz Espín, Ana María; Sevilla Valenzuela, Francisca; Jiménez Hurtado, Ana Mª; Camejo López, Daymi Mercedes; Facultad de Biología
Las tiorredoxinas (Trx) son proteínas pequeñas y ubicuas implicadas en la reducción de los enlaces disulfuro de sus proteínas diana. El grupo de las Trxs está organizado en distintas clases. Los animales cuentan con sólo dos tipos, una citoplasmática y otra mitocondrial. En plantas hay, al menos, diez familias de TRXs con más de 40 miembros presentes en casi todos los compartimentos celulares. En mitocondrias vegetales sólo se han descrito dos tipos de Trxs; la Trxh en álamo (Populus) y la Trxo1 en Arabidopsis (A. thaliana) y guisante (Pisum sativum), donde ha sido también co-localizada en el núcleo. En esta Tesis hemos llevado a cabo diferentes aproximaciones experimentales con el fin de estudiar con detalle algunas de las posibles funciones de la Trxo1 en células vegetales. En primer lugar, hemos identificado posibles proteínas diana nucleares de PsTrxo1 a través de la utilización de técnicas de cromatografía de afinidad. La identificación de la proteína PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular) y el componente regulador de rutas de ácido abcísico, el receptor de pirabactina 1 (PYR1) establece nuevas funciones para la PsTrxo1 relacionadas con la síntesis de ADN, ciclo celular, metabolismo hormonal y respuesta al estrés. Otra de las funciones descubiertas para esta Trxo1 durante esta Tesis ha sido su papel durante la germinación de la semilla de Arabidopsis. Ensayos de expresión de AtTrxo1 han señalado un alto nivel durante la germinación, particularmente en el embrión de las semillas sugiriendo un papel para AtTrxo1 durante la movilización de reservas en este proceso. Además, ensayos de germinación mostraron que las semillas del mutante KO AtTrxo1 germinaban antes que las semillas silvestres (Wt) en condiciones salinas, si bien, bajo condiciones estándar de crecimiento, ambos genotipos germinaban y se desarrollaban normalmente sugiriendo la importancia de la Trxo1 en el proceso germinativo y la adaptación a la salinidad. La escasa información relativa a la regulación transcripcional de las Trxs vegetales nos condujo en la búsqueda de elementos cis-trans en el promotor de AtTrxo1. Para ello, se realizaron estudios filogenéticos donde se identificaron seis elementos en cis-funcionalmente relevantes que fueron validados por ensayos de β-glucuronidasa. Posteriormente, los ensayos de un híbrido en levadura nos permitieron identificar más de 30 factores de transcripción pertenecientes a seis familias diferentes como posibles reguladores de la expresión de AtTrxo1. Entre ellos, bZIP9 mostró una fuerte interacción con pAtTrxo1 y se comportó como un posible regulador positivo de AtTrxo1, mientras que AZF2, un factor de dedo de zinc fuertemente relacionado con la respuesta a salinidad, se mostró como un posible represor. Finalmente, se iniciaron estudios de muerte celular. Para ello, utilizamos cultivos de células TBY-2 que sobre-expresaban PsTrxo1 y H2O2 como un inductor de PCD (Programmed Cell Death). La respuesta de las células dependió de la intensidad del tratamiento aplicado. Una concentración 15 mM H2O2 provocó una ligera disminución en la viabilidad del cultivo celular sin diferencias entre líneas. Sin embargo, concentraciones superiores a 35 mM causaron un efecto diferenciador sobre la viabilidad de ambas líneas y la línea sobre-expresante murió varios días después que la línea control. En este sentido, las células sobre-expresantes presentaron un menor estrés oxidativo y diferentes marcadores de PCD que justificaron el retraso observado en la muerte celular. En conclusión, estos resultados podrían sugerir la implicación de PsTrxo1 en la tolerancia de TBY-2 a un tratamiento con H2O2 y en el proceso de muerte celular desarrollado en estas condiciones. ABSTRACT Thioredoxins (Trxs) are ubiquitous small proteins involved in the reduction of disulfide bonds of target proteins. Trxs´ group is organized in different types. Animals contain only two types, one cytoplasmic and one mitochondrial. In plants there are at least ten families of Trxs with more than 40 members present in almost all the cellular compartments. In plant mitochondria only two types of Trx have been described, Trxh found in Populus and Trxo1 type in Arabidopsis (A. thaliana) and pea (Pisum sativum), where it has been also co-localized in the nucleus. In this thesis we have carried out different experimental approaches in order to study in greater depth some of the possible functions of the Trxo1 in plant cells. Firstly, we have identified specific potential nuclear targets of PsTrxo1 using affinity chromatographic techniques. The identification of PCNA protein (Proliferating Cell Nuclear Antigen) and the pyrabactin resistance 1 (PYR1) regulatory component of abscisic acid (ABA) receptor establishes new functions of PsTrxo1 related to DNA synthesis, cell cycle, hormonal metabolism and stress response. The role of Trxo1 in seed germination has been studied in this Thesis. Expression assays of AtTrxo1 pointed out a high level during germination, particularly in seeds embryo suggesting the feasible role of AtTrxo1 in storage proteins mobilization occurring in this process. In addition, germination tests showed that mutant seeds (KO AtTrxo1) germinated earlier than wild type seeds (Wt) in saline conditions, although under standard growth conditions, both genotypes germinated and developed normally, suggesting the importance of Trxo1 in germination and adaptation to salinity. The scarce information on the transcriptional regulation of plant Trxs led us to search cis-trans elements in the promoter of AtTrxo1. For this purpose, phylogenetic studies were done and six cis-functionally relevant elements were found. These elements were validated performing tests of β-glucuronidase. Subsequently, one hybrid assays in yeast allowed us to identify more than 30 transcription factors belonging to six different families showed as feasible regulators of AtTrxo1 expression. Among them, bZIP9 showed a strong interaction with pAtTrxo1 and it was identified as a positive regulator, while AZF2, a transcription factor strongly related with salinity response, was identified as a feasible AtTrxo1 repressor. Finally, we initiated different studies on the possible involvement of Trxo1 in cell death. We used overexpressing PsTrxo1 TBY-2 cell cultures and H2O2 as a PCD (Programmed Cell Death) inductor. The response of cells depended on the severity of the treatment. A concentration of 15 mM H2O2 caused a slight decrease in the viability of the cell culture with no differences between control versus overexpressing line. However, concentrations above 35 mM caused a differentiating effect on the viability and the over-expressing line died several days after the control line. In this situation, over-expressing cells presented lower oxidative stress and several PCD markers justifying the observed delay in cell death. In conclusion, these results could suggest the involvement of PsTrxo1 in TBY-2 of H2O2 treatment and in the cell death process developed in these conditions.
Open Access
Caracterización funcional de mutantes de peroxidasas implicadas en la biosíntesis de ligninas en arabidopsis thaliana
(2015-04-16) Fernández Pérez, Francisco; Pedreño García, María Ángeles; Novo Uzal, Esther; Facultad de Biología
La lignificación de la pared de las células del xilema es un proceso extremadamente complejo, sometido a un estrecho control hormonal cuya función principal es la de conferir rigidez e impermeabilidad al sistema vascular. La lignificación es una secuencia de reacciones en cadena que conducen desde un metabolito primario, la fenilalanina, hasta los precursores inmediatos de las ligninas, los alcoholes hidroxicinamílicos (p-cumarílico, coniferílico y sinapílico). Estos alcoholes son oxidados, finalmente, por las peroxidasas para dar lugar a sus correspondientes radicales, que se ensamblan en la pared celular generando un polímero hidrofóbico y fuertemente polidisperso, que da rigidez e impermeabiliza la pared celular, constituyendo uno de los mayores sumideros metabólicos del CO2 fijado durante la fotosíntesis. Las peroxidasas siringilo son las enzimas responsables de la oxidación del alcohol sinapílico, lo que conduce a la formación de monómeros siringilo (S) que se incorporan al polímero de lignina. Estas enzimas han sido descritas como peroxidasas básicas que no presentan restricciones estéricas que impidan la entrada de alcohol sinapílico en el centro catalítico. Hasta el momento, las peroxidasas más estudiadas a nivel estructural han sido la ATP A2 de Arabidopsis y HRP A2 de rábano, las cuales son peroxidasas guaiacilo incapaces de oxidar el alcohol sinapílico. La peroxidasa siringilo mejor caracterizada hasta el momento es la de Zinnia elegans (ZePrx). En el genoma de Arabidopsis existen 73 peroxidasas pero ninguna de ellas ha sido identificada como una peroxidasa de tipo siringilo. Estudios previos buscaron en el genoma de A. thaliana peroxidasas que presentan una gran homología de secuencia con ZePrx, así como de estructura, carga superficial, punto isoeléctrico y regulación de su expresión. Teniendo en cuenta estos criterios se seleccionaron las peroxidasas AtPrx4, AtPrx52, y AtPrx72. En esta tesis, se muestra cómo la supresión de dichas peroxidasas en diferentes líneas mutantes de Arabidopsis afecta al contenido y a la composición de ligninas. En general, todas las líneas mutantes mostraron una disminución en el contenido de ligninas, medido con bromuro de acetilo, entre un 17 y un 37%. Además, la relación S/G, obtenida por tioacidolisis, indica una disminución en las unidades de S en todos los mutantes. Además, como se deduce de las tinciones de Wiesner y de Mäule, esta reducción en el contenido de monómeros S parece estar restringida a las fibras interfasciculares, pero no afecta a los vasos del xilema. Para analizar si este cambio en la composición de lignina era dependiente de la edad de la planta, también se realizaron análisis cualitativos y cuantitativos de ligninas en tallos en diferentes etapas de desarrollo. Nuestros resultados mostraron diferencias significativas en el contenido y la composición de ligninas entre plantas mutantes y WT solamente en las últimas etapas del desarrollo. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en el tamaño de las plantas mutantes en comparación con el WT. Los análisis mediante qPCR revelaron que los genes implicados en la biosíntesis de ligninas, así como en la formación de la pared celular secundaria, redujeron su expresión en las plantas mutantes. Por otro lado, la expresión de genes implicados en la biosíntesis de ésteres sinapato y de flavonoides se incrementó en las plantas mutantes con respecto al WT lo cual indica que hay una reorientación de los esqueletos carbonados de la ruta de biosíntesis de las ligninas hacia otras rutas del metabolismo fenilpropanoide. En conjunto, nuestros resultados sugieren que AtPrx4, AtPrx52 y AtPrx72 son peroxidasas siringilo implicados en la síntesis de unidades S en las fibras interfasciculares y además, su represión afecta a toda la ruta fenilpropanoide y puede ser suficiente para alterar el metabolismo de la planta. Abstract The lignification of xylem cell walls is an extremely complex process, under strict hormonal control, whose main function is to confer rigidity and impermeability to the vascular system. Lignification is the result of several reactions from a primary metabolite, phenylalanine, until the immediate precursors of lignin, the hydroxycinnamyl (p-coumaryl, coniferyl and sinapyl) alcohols. These alcohols are finally oxidized by peroxidases to give their corresponding radicals, which will be further assembled in the cell wall, generating a hydrophobic polymer (lignin) which gives rigidity and waterproof cell wall. Lignin constitutes a major metabolic sink for the CO2 fixed during photosynthesis. Syringyl peroxidases are the enzymes responsible for sinapyl alcohol oxidation that eventually lead to syringyl monomers formation. They have been described as basic peroxidases which show no steric restrictions that hinder the entry of sinapyl alcohol into the catalytic centre. So far, the most studied peroxidases at the structural level, such as ATP A2 from Arabidopsis and HRP A2 from horseradish, are guaiacyl peroxidases, unable to oxidize sinapyl alcohol. Unfortunately, little is known regarding structure and catalytic properties of syringyl peroxidases. The best characterized is ZePrx from Zinnia elegans. Since such a peroxidase similar to ZePrx has not been identified in Arabidopsis, a search through A. thaliana genome was performed, in order to identify the peroxidases which showed the highest homology to ZePrx. Based on several structural and molecular characteristics, AtPrx4, AtPrx52 and AtPrx72 were determined to be the most likely homologous to ZePrx in Arabidopsis. In this thesis, we show how the suppression of AtPrx4, AtPrx52 and AtPrx72 in different mutant lines of Arabidopsis affects lignin content and composition. Overall, all the mutant lines showed a decreased in lignin content, measured with acetyl bromide, ranging from 17 to 37%. Furthermore, the S/G ratio, obtained by both nitrobenzene oxidation and thioacidolysis, indicated a decrease in S units in all the mutants. As deduced from Wiesner and mainly Mäule stainings, this reduction in S monomers content seems to be restricted to the interfascicular fibers, but it does not affect xylem vessels. To assay whether this shift in lignin composition was age-dependent, we also performed qualitative and quantitative analyses of lignins in stems at different stages of development. Our results showed significant differences in both content and composition only in late stages of development of mutant plants. However, no significant differences were found regarding mutant size in comparison with WT when plants reached maturity. qPCR revealed that genes involved in lignin biosynthesis as well as in secondary cell wall formation were down-regulated in mutant plants. On the other hand, expression of genes involved in sinapate esters and flavonoid biosynthesis was up-regulated in mutant plants, which indicates a reallocation of carbon from lignin biosynthetic pathway to other routes of phenylpropanoid metabolism. Taken together, our results indicate that AtPrx4, AtPrx52 and AtPrx72 may be syringyl peroxidases involved in the synthesis of S units in interfascicular fibers. Moreover, the suppression of the last step of syringyl lignins biosynthesis affects the whole phenylpropanoid pathway and may be sufficient to alter plant metabolism.
Metadata only
Caracterizacion molecular de N-acetil-D-glucosamina 2-epimerasa de "bacteroides ovatus" : una enzima relevante en la síntesis de ácido siálico = Molecular characterization of N-acetyl-D-glucosamine 2-epimerase from "bacteroides ovatus" : a relevat enzyme in the sialic acid synthesis / Agustín Sola Carvajal; directores, Alvaro Sánchez Ferrer, Francisco García Carmona.
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular A,, 2011) Sola Carvajal, Agustín
Metadata only
Clonación y evolución dirigida de enzimas implicadas en la modificación de la cefalosporina y sus derivados / Irene Martínez Martínez; directores, Alvaro Sánchez Ferrer, Francisco García Carmona.
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular,, 2007) Martínez Martínez, Irene
Metadata only
Clonación, sobrexpresión y caracterización de esterasas bacterianas / Inmaculada Navarro González; director, Francisco García Carmona.
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-A,, 2009) Navarro González, Inmaculada
Metadata only
Contribución al estudio de la estructura y función de la Ca2+-ATPasa del retículo sarcoplásmico / María Senena Corbalán García ; directores Juan Carmelo Gómez Fernández, José Antonio Teruel Puche.
(Murcia : Universidad de Murcia, Facultad de Veterinaria, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular (A),, 1994) Corbalán García, María Senena