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Análisis de la degeneración de los fotorreceptoes en modelos experimentales de retinosis pigmentaria, degeneración macular asociada a la edad y glaucoma =Analysis of photoreceptor degeneration in experimental models of retinitis pigmentosa, aging macular degeneration and glaucoma
(2015-07-24) Ortín Martínez, Arturo; Vidal Sanz, Manuel; Agudo Barriuso, Marta; Villegas Pérez, María Paz; Facultad de Medicina
. Objetivo. Determinar el número total y la topografía de la población de conos en roedores adultos utilizando rutinas automatizadas que nos permita investigar objetivamente los efectos de diferentes modelos experimentales de patologías humanas tales como la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), retinosis pigmentaria (RP) y la neuropatía óptica glaucomatosa (NOG) sobre la población de fotorreceptores. Material y métodos. Se han utilizado cinco cepas distinta de roedores: Sprague-Dawley (SD), Piebald Virol Glaxo (PVG) y la rata transgénica P23H-1, y ratones Swiss y C57/BL6. Todos los experimentos y procedimientos se han realizado bajo el estricto cumplimiento de las recomendaciones de la “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO)” y la “European Union guidelines for the use of animals in research”, y todos los procedimientos utilizados han sido previamente aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal (CEEA) de la Universidad de Murcia. Se han utilizado diferentes técnicas para el estudio histológico y morfológico y se han analizado en retinas montadas a plano y en secciones transversales; se han utilizado tecnologías de imagen avanzadas como la Spectral Domain Optical Coherence Tomography (SD-OCT)y se ha realizado análisis de proteínas mediante Western Blot. Como modelo de RP se ha utilizado la rata transgénica P23H-1, esta rata es portadora de una mutación autosómica dominante en el gen de la rodopsina que causa distrofia y muerte de los fotorreceptores. Se ha desarrollado un nuevo modelo experimental útil para la comprensión de la patología de la DMAE, la fototoxicidad localizada de los fotorreceptores tipo cono inducida por LED (FTIL). Por último se ha utilizado un modelo experimental de hipertensión ocular (HTO) inducida mediante láser que permite la evaluación de los efectos de la NOG sobre la población de fotorreceptores. Resultados. El número medio de conos que expresan la opsina-L es de 231.736 ± 14.517 en la rata SD; 239.939 ± 6.494 en la rata PVG; 117.424 ± 17.721 en el ratón Swiss y 135.155 ± 8.742 en el ratón C57/BL6. El número medio de conos que expresan la opsina-S es de 41.028 ± 5.074 en la rata SD; 27.316 ± 2.235 en la rata PVG; 146.682 ± 24.958 en ratones Swiss y 119.616 ± 8.756 en ratones C57/BL6. El porcentaje de conos duales en la rata SD es del 3,2%, del 2,9% en la PVG, de un 73% en el ratón Swiss y de un 40% en el C57/BL6. En todas las cepas de ambas especies existe un paralelismo en la distribución de las células ganglionares de retina (CGR) y los conos-L. La topografía de los conos-L en todas las cepas de rata y ratón analizadas es similar, se observan zonas de alta densidad en el eje nasotemporal superior, las densidades medias alrededor del nervio óptico y un descenso de densidad gradual desde las zonas centrales hacia las periféricas. Sin embargo, existen claras diferencias en la distribución de los conos-S entre las especies y cepas analizadas. El la rata P23H-1, la degeneración de los bastones ocurre antes que la de los conos y de forma rápida: primero con el acortamiento de los segmentos externos, a P30 existe una gran pérdida de bastones y a P180 la pérdida es prácticamente en la totalidad de la retina exceptuando la extrema periferia. La degeneración de bastones y conos está espaciotemporalmente relacionada, ocurre en forma de anillos que aparecen alrededor de P90 y se extiende por toda la retina. A P180, los anillos de degeneración son más abundantes en la retina ecuatorial y de mayor tamaño en la retina dorsal. En un nuevo modelo in vivo de fototoxicidad focal de los fotorreceptores inducido por LED, la SD-OCT muestra un daño en una región circular situado en la retina superotemporal. En esta región se observa una disminución progresiva del espesor de la retina desde 183,4 ± 5 mm (12 h) hasta 114,6 ± 6 mm (7 d). Las secciones transversales muestras una pérdida masiva de bastones y conos en la región dañada por la luz. En las retinas montadas a plano se observa una región circular con disminución del número de conos-L y conos-S. En este área circular en las retinas izquierdas y en la región correspondiente de la retina control derecha, el número total de conos-L o conos-S es de 7.118 ± 842 ó 661 ± 125 en las retinas fotoexpuestas (n=7) y de 14.040 ± 1.860 ó 2.255 ± 193 en las retinas control (n=7), respectivamente. Aunque el CNTF no, la brimonidina, el BDNF, PEDF y el bFGF muestran efectos neuroprotectores significativos sobre los conos-L y conos-S. La HTO provoca sectores con su vértice en el disco óptico carentes de CGR Brn3a pero que aún contienen gran número de núcleos DAPI positivos. Los niveles de todas las opsinas disminuyen a las 2 semanas y esta disminución progresa hasta el 20% de los niveles basales a los 3 meses. Las secciones transversales revelan áreas focales de degeneración en las capas externas de la retina (CER). Las CGR supervivientes a los 15 días representan aproximadamente el 28% y no cambian con el tiempo, mientras que de las poblaciones de conos-L y conos-S sobreviven un 80% y un 65% a un mes o un 35% y un 20% a 6 meses, respectivamente. Conclusiones. Se ha establecido, por primera vez, el número total y la distribución topográfica de los conos-L y conos-S en dos cepas de rata y dos de ratón y se ha demostrado el paralelismo topológico de la distribución de los conos-L y las CGR. Se han proporcionado las bases para estudiar la degeneración de conos y su prevención en condiciones patológicas. Se ha descrito por primera vez que, en la rata P23H-1, la degeneración de bastones y conos está espaciotemporalmente relacionada y se produce en anillos. La pérdida de conos sigue a la pérdida de bastones, que comienza de forma temprana, incluso antes de P30, la primera edad analizada. Las características de los anillos sugieren que la degeneración secundaria de conos está influenciada por la localización en la retina y / u otros factores intrínsecos o extrínsecos. Se ha evidenciado que la FTIL provoca una pérdida de conos y bastones y es un modelo fiable, cuantificable y reproducible para estudiar la degeneración de los fotorreceptores. La administración intravítrea de BDNF, PEDF o bFGF, o la administración tópica de brimonidina proporcionan neuroprotección significativa sobre los conos, en este modelo. Se ha demostrado que la HTO induce una pérdida selectiva de CGR en la capa de la CGR que no progresa después de 1 mes, mientras que los conos-L y conos-S presentan una pérdida progresiva hasta los 6 meses. Por lo tanto, HTO provoca graves daños tanto en las capas más internas como en las CER. SUMMARY. Purpose. To determine the total number and topography of the cone population in two rat and two mouse strains using automated routines which allowed us to investigate objectively the effects of different experimental models of human pathologies such as Aging Macular Degeneration (AMD), Retinitis Pigmentosa (RP) and Glaucomatous Optic Neuropathy (GON) on the photoreceptor population. Material y methods. A total of 303 rats and 23 mice were used in this thesis, five different strains of rodents were used: albino Sprague-Dawley (SD), pigmented Piebald Virol Glaxo (PVG) and P23H-1 transgenic rats, albino Swiss and pigmented C57/BL6 mice. All experimets and procedures were carried out in strict accordance with the recommendations in the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) and the European Union guidelines for the use of animals in research, and all the protocols were approved by the Ethical and Animal Studies Committee of the University of Murcia. Several techniques such as, the identification of the three different types of photoreceptors and other retinal populations by immunohistofluorescence analyzed in whole flat-mounted retinas and in oriented radial sections, classical staining as H-E, imaging advanced technologies as Spectral Domain Optical Coherence Tomography (SD-OCT), and protein analysis by western blot, have been used. In this thesis the P23H-1transgenic rat has been used as a model of RP, this animal bears an autoasomal dominat mutation in the rhodopsin gene (proline to histidine substitution at codon 23 of the rodopsin protein) that causes photorecptor dystrophy and death. A new experimental model useful to understand the AMD pathology, has been developed for this thesis, Light Emmitting Dioede (LED)-induced cone-photoreceptor phototoxicity (LIP), the blue-light LED exposition on the rat retina causes a damage-area located in the retinal zone with maximun L-cones densities and a cone to rod ratio similar to the human macular fovea. And finally, an experimental model of Laser-induced ocular hypertension developed recently in our Laboratory of Experimental Ophthalmology at the University of Murcia has been used to understand the effects of GON on the cone population. Results. The mean number of L-opsin+cones is 231,736 ± 14,517 in SD rat; 239,939 ± 6,494 in PVG rat; 117,424 ± 17,721 in Swiss mouse and 135,155 ± 8,742 in C57/BL6 mouse. The mean number of S-opsin+cones 41,028 ± 5,074 in SD rat; 27,316 ± 2,235 in PVG rat; 146,682 ± 24,958 in Swiss mouse and 119,616 ± 8,756 in C57/BL6 mouse. The percentage of dual cones is 3.2% in SD rat; 2.9% in PVG rat; 73% in Swiss mouse and 40% in C57/BL6 mouse. In all strains, and both species, there is a parallel distribution of retinal ganglion cells (RGC) and L-cones. The topography of L-cones is similar in all strains of rats and mice analyzed, the highest densities are observed in the superior nasotemporal axis, medium densities around the optic nerve, and this density gradually decreases from the center to the periphery. However, obvious differences are found in S-cones distribution. While in the two rat strains there is a increasing gradient of S-cones density along the inferonasal quadrant and the highest densities are found in the retinal rim, in the Swiss mouse strains S-cones are abundant in the dorsal retina although their highest densities are ventral but the C57/BL6 mouse shows a low number of S-cones in the dorsal retina and very dense population in the ventral retina, being densest in its nasal aspect. In P23H-1 rats, rod degeneration occurs rapidly: first the rod outer segment shortens, at P30 there is extensive rod loss, and by P180 rod loss is almost complete except for the most peripheral retina. The numbers of L cones are, at all postnatal ages, lower in P23H-1 rats than in control SD rats, and decrease significantly with age (by P180). Rod and cone degeneration is spatiotemporally related and occurs in rings that appear already at P90 and spread throughout the entire retina. At P180, the rings of rod-cone degeneration are more abundant in the equatorial retina and are larger in the dorsal retina. In a novel in vivo model of focal LED-induced photoreceptor phototoxicity SD-OCT showed damage in a circular region of the superotemporal retina, whose diameter varied from 1,842.4 ± 84.5 mm (at 24 hours) to 1,407.7 ± 52.8 mm (at 7 days). This region had a progressive thickness disminution from 183.4 ± 5 mm (at 12 h) to 114.6 ± 6 mm (at 7 d). Oriented cross-sections showed within the light-damaged region of the retina massive loss of rods and cone-photoreceptors. Wholemounts documented a circular region containing lower numbers of L- and S-cones. Within a circular area (1 mm or 1.3 mm radius, respectively) in the left and in its corresponding region of the contralateral-fellow-retina, total L- or S-cones were 7,118 ± 842 or 661 ± 125 for the LED exposed retinas (n=7) and 14,040 ± 1,860 or 2,255 ± 193 for the fellow retinas (n=7), respectively. Brimonidine, BDNF, PEDF and bFGF but not CNTF showed significant neuroprotective effects on L- and S-cones. Ocular hypertension (OHT) resulted in wedge-like sectors with their apex on the optic disc devoid of Brn3aRGC but with large numbers of DAPI+nuclei. The levels of all opsins diminished by 2 weeks and further decreased to 20% of basal-levels by 3 months. Cross-sections revealed focal areas of outer retinal layers (ORL) degeneration. RGC survival at 15 days represented approximately 28% and did not change with time, whereas the L-cone and S- populations diminished to 80% and 65%, or to 35% and 20% at 1 or 6 months, respectively. Conclusions. It has been established, for the first time, the total number and the topographical distribution of S- and L-cones in two rat and two mouse strains and demonstrated the correlation of L-cones and RGC spatial distribution. It has been provided the basis to study cone degeneration and its prevention in pathologic conditions. It has been described for the first time that in the P23H-1 rat, rod and cone degeneration is spatiotemporally related and occurs in rings. Cone loss follows rod loss and starts very soon, even before P30, the first age analyzed here. The characteristics of the rings suggest that secondary cone degeneration is influenced by retinal position and/or other intrinsic or extrinsic factors. It has been evidenced that LIP results in rod and cone-photoreceptor loss, and is a reliable, quantifiable model to study cone-photoreceptor degeneration. Intravitreal BDNF, PEDF or bFGF, or topical BMD afford significant cone neuroprotection in this model. It has been demostrated that OHT induces in the ganglion cell layer selective RGC loss that does not progress after 1 month, whereas the S- and L-cones exhibit progressive loss up to 6 months. Thus, OHT results in severe damage to both the innermost and the ORL. Palabras clave: Retina, Fotorreceptores, Conos, Retinosis Pigmentaria, Degeneración Macular Asociada a la Edad, Glaucoma. Key words: Retina, Photoreceptors, Cones, Retinitis Pgmentosa, Aging Macular Degeneration, Glaucoma.
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Análisis de la evolución del queratocono tratado con Crosslinking
(2014-04-08) López Izquierdo, Inmaculada; Gutiérrez Ortega, Ángel Ramón; Gómez Ramírez, Ana María; Facultad de Medicina
El queratocono es una patología no inflamatoria de la córnea en la que se produce un adelgazamiento corneal, que causa un aumento progresivo de la curvatura de la córnea, con miopía y astigmatismo irregular (defectos ópticos que causan una importante pérdida de visión). Es una enfermedad que evoluciona aumentando progresivamente y llegando en la fase avanzada a un adelgazamiento y una ectasia (deformidad) grave, que explicaría la acusada distorsión de las imágenes y la pérdida de agudeza visual. Las opciones terapéuticas dependen del mayor o menor adelgazamiento y la deformidad corneal y van desde el uso de gafas ó lentillas, aplicación de Crosslinking, la implantación de anillos intracorneales, hasta la queratoplastia. En el caso que nos ocupa nos centraremos en el Crosslinking, que es un tratamiento que consiste en la activación, mediante luz ultravioleta, de una sustancia llamada riboflavina que produce una especie de polimerización entre las láminas de colágeno corneales, cuyas uniones moleculares se encuentran debilitadas o ausentes, para reforzar la rigidez de la córnea. Por lo tanto, el propósito de este estudio es determinar los cambios inducidos por el Crosslinking en ojos con queratocono tratados mediante esta técnica, durante un periodo de tiempo de dos años tras la intervención. Para ello, se han analizado 22 ojos de 18 pacientes, todos ellos diagnosticados de queratocono en progresión y tratados con Crosslinking. Se han realizado exámenes de agudeza visual, refracción subjetiva, presión intraocular, biomicroscopía, exploración de fondo de ojo y análisis de Scheimpflug con el Pentacam. Este protocolo de exámenes se realizó tanto preoperatoriamente como al mes, tres meses, seis meses, un año y dos años tras la intervención. Los resultados obtenidos muestran como la máxima agudeza visual corregida aumentó 1,33 líneas a los dos años del Crosslinking, la esfera de la mejor corrección óptica se mantuvo estable a lo largo del tiempo de seguimiento, al igual que el cilindro y la presión intraocular. En la superficie anterior de la córnea, tanto la K media como el astigmatismo, la asfericidad, el grado del queratocono, todos los índices corneales analizados, incluido el radio mínimo anterior, y la elevación en esta cara se mantuvieron estables sin diferencias con respecto al valor preoperatorio. En la superficie posterior corneal la K media, el astigmatismo, la asfericidad y la curvatura mínima no sufrieron cambios durante este periodo de tiempo. Sin embargo, los valores de la elevación si que se encontraron por encima de los valores preoperatorios. Los valores de la paquimetría en el ápex y en el punto más delgado a los dos años del Crosslinking se encontraron por debajo de los valores preoperatorios, por el contrario, la paquimetría en el centro pupilar mantuvo su valor tras el periodo de seguimiento. Tampoco se han encontrado diferencias en la posición de ninguno de los puntos analizados. La densitometría corneal, el volumen corneal y el poder refractivo real de la córnea, mantuvieron su valor transcurridos dos años de la intervención. En la cámara anterior, ni el ángulo, ni la profundidad cambiaron tras el Crosslinking pero el volumen de la cámara anterior fue menor. En la densitometría del cristalino, no se registró cambio alguno durante el periodo de seguimiento. La impresión general que se obtiene, a la vista de los resultados obtenidos, es que el Crosslinking parece ser eficaz para detener la progresión del queratocono, ya que casi todos los parámetros estudiados se mantienen estables transcurridos dos años de la intervención. Keratoconus is a non-inflammatory disorder of the cornea that produces corneal thinning, which causes a progressive increase in the curvature of the cornea, with myopia and irregular astigmatism (optical defects that cause an important loss of vision). It is a condition that becomes progressively worse and leads to the advanced phase of thinning and serious ectasia (deformity), which would explain the attributed distortion of images and the loss of visual acuity. The therapeutic options depend on the greater or lesser extent of the thinning and corneal deformation and can range from the use of glasses or contact lenses, implementation of Crosslinking, implantation of intracorneal rings, and corneal transplantation. In the case that interests us we will focus on Crosslinking, which is a treatment that consists of the activation, by means of ultraviolet light, of a substance called riboflavin that produces a sort of polymerization among the corneal collagen layers, whose molecular bonds are found weakened or absent, in order to strengthen the rigidity of the cornea. Therefore, the intention of this study is to determine the changes provoked by Crosslinking in eyes with keratoconus treated with this technique, during a two-year period of time after the procedure. To do this, 22 eyes from 18 patients have been analyzed, all of them diagnosed with progressing keratoconus and treated with Crosslinking. Examinations were performed for visual acuity, subjective refraction, intraocular pressure, biomicroscopy, fundus photography and a Scheimpflug analysis with a Pentacam. This protocol of examinations was performed pre-operatively as well as within one month, three months, six months, one year and two years after the procedure. The results obtained show how the maximum visual acuity corrected increased 1.33 lines two years after the Crosslinking procedure, the sphere of the best optical correction remained constant throughout the monitoring time, the same was seen in the cylinder and intraocular pressure. On the anterior surface of the cornea, the mean K value, astigmatism, asphericity, the degree of keatoconus, all of the analyzed corneal indices, including the minimum anterior radius, and the elevation in this surface remained stable without differences in respect to the pre-operatory values. In the posterior surface of the cornea the mean K value, astigmatism, asphericity and the minimum curvature did not experience any changes during this period of time. However, the elevation values were found to be higher than those of the pre-operatory values. The pachymetry values of the apex and finest point two years after Crosslinking surgery were found to be below pre-operatory values, on the contrary, the pachymetry of pupil center maintains its values after the monitoring period. No differences have been found in the position of any of the analyzed points. Corneal densitometry, corneal volume and actual refractive power of the cornea maintained their values two years after the procedure. In the anterior chamber, neither the angle, nor the depth changed after Crosslinking but the volume of the anterior chamber was less. Lens densitometry did not register any change during the treatment period. The general impression, in light of the obtained results, is that Crosslinking seems to be effective in halting the progression of keratoconus, due to the fact that almost all of the studied factors remain stable two years after the operation.
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Aplicaciones del suero autólogo en la consulta del servicio de oftalmología en el Hospital Donostia.
(Murcia : Servicio de Publicaciones de la Universidad de Murcia, 2008) Solórzano Sánchez, M.; Pernas Pena, A.; Zabala Largo, AI.
Introducción: La etiología del ojo seco se relaciona con la falta de factores de crecimiento, responsables de mantener una adecuada proliferación de la superficie del epitelio ocular. En la sangre se encuentran estos componentes, por lo que la utilización del suero autólogo es una opción terapéutica para el ojo seco. El suero autólogo es un preparado a base de tu propia sangre centrifugada a 3.000 rev/minuto. Objetivo: Protocolizar el procedimiento de prescripción, elaboración, y dispensación de colirio de suero antólogo. Material y Métodos: En el año 2004 se acordó con el Servicio de Oftalmología definir la protocolización del colirio de suero autólogo. Resultados: Entre mayo de 2004 y abril de 2006 se ha tratado a 42 pacientes. En el 2004 se elaboraron colirios para 11 pacientes, en el 2005 para 32, y hasta abril del 2006 para 22. El 50% de los pacientes ha necesitado ser retratado al menos una vez, siendo los casos con EICH, con una media de 8 dispensaciones por paciente, los más retratados. Conclusiones: El aumento de la demanda justifica la protocolización de este preparado. La elaboración y dispensación del colirio por parte del Servicio de Farmacia garantiza la esterilidad y estabilidad del mismo, y posibilita la atención farmacéutica orientada a la mejora de la eficacia y correcto uso del colirio. Todos los pacientes tratados con Suero Autólogo han mejorado de su patología de ojo seco. Han mejorado en su calidad de vida (menos molestias en la visión, mejor visión).
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Calidad óptica en ojos pseudofáquicos : medidas experimentales, modelado y aplicaciones = Optical quality in pseudophakic eyes : experimental measurements, modeling and applications
(2013-01-10) Cánovas Vidal, Carmen; Artal Soriano, Pablo; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Física
RESUMEN Hay diferentes formulas para predecir la potencia de la lente intraocular (LIO) a implantar en la cirugía de catarata. La precisión de dichas formulas depende del tipo de paciente, y deben ser modificadas para pacientes que se han sometido a una cirugía refractiva previa o que presentan configuraciones oculares poco comunes. Estas formulas están basadas en optica paraxial y por lo tanto no incorporan el efecto de las aberraciones. En este trabajo, se ha desarrollado y validado clínicamente un procedimiento optimizado de cálculo de potencia de LIO basado en trazado exacto de rayos en modelos de ojo personalizados. Se ha demostrado que puede ser utilizado tanto en pacientes normales como en pacientes que se hayan sometido a una cirugía refractiva previa, mejorando en este caso, los resultados de las formulas que representan el estado del arte actual. En estos pacientes, se ha mostrado la necesidad de considerar las aberraciones corneales. PALABRAS CLAVE: Óptica, física, oftalmología, trazado de rayos, modelo personalizado de ojo, cirugía de cataratas, cirugía refractiva, lente intraocular, potencia óptica, aberraciones corneales, aberración esférica. SUMMARY: There several formulas to predict the power of the intraocular lens (IOL) to implant in cataract surgery. These are only partially patient specific because some modifications must be made when patients have undergone refractive surgery or present extreme eye geometries. Most common clinically used IOL power calculation methods are based on a paraxial optics representation of the eye and therefore cannot directly account for corneal or IOL aberrations. Therefore, an optimized approach based on ray tracing through customized eye models has been developed and clinically validated during this work. It has been shown that can be used in eyes with no previous LASIK and in post-LASIK eyes, leading to a robust IOL power calculation method. The incorporation of corneal spherical aberration is crucial for the accurate prediction of the IOL power in eyes that have had refractive surgery. KEY WORDS: Optics, physics, ophthalmology, ray tracing, customized eye models, cataract surgery, refractive surgery, intraocular lens, power, corneal aberrations, spherical aberration.
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Caracterizacion en roedores adultos de la población de células ganglionares de retina melanopsínicas y estudio de la degeneración de las células ganglionares tras hipertensión ocular y neuroprotección
(2015-07-02) Valiente Soriano, Francisco Javier; Vidal Sanz, Manuel; Agudo Barriuso, Marta; Avilés Trigueros, Marcelino; Facultad de Medicina
Objetivos • Caracterizar la población de CGRm del ratón pigmentado y albino adulto. • Estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO en ratón pigmentado. • Estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO y su protección con BDNF en rata albina adulta. Material y métodos Para la realización de los experimentos se utilizaron ratones machos pigmentados y albinos adultos y ratas hembras adultas albinas. Las manipulaciones de los animales se realizaron siguiendo la normativa europea (Directiva 2010/63/UE) y nacional (RD 53/2013) sobre la protección de los animales utilizados para la experimentación y otros fines científicos. Para caracterizar la población de CGRm del ratón pigmentado y albino adulto, se inmunodetectaron secciones transversales de retina y retinas a plano con el anticuerpo contra la melanopsina, con el anticuerpo contra Brn3a y se contratiñeron los núcleos de todas las células de la retina con DAPI. Para estudiar la proyección de las CGRm, se aplicó en ambos CS o en el muñón del nervio óptico el trazador neuronal OHSt. Para estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO en ratón pigmentado, se caracterizó el modelo de HTO fotocoagulando con láser las venas perilimbares y epiesclerales del ratón. Para analizar el curso temporal de daño axonal y muerte de las CGR y las CGRm, las CGR fueron trazadas retrógradamente desde los CS con OHSt, las retinas se inmunodetectaron con Brn3a y melanopsina, y se analizaron a las 2 y 4 semanas. Para estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO y su protección con BDNF en rata albina adulta, se analizó el curso temporal de daño axonal y muerte de las CGR y CGRm tras HTO en retinas tratadas con BDNF o vehículo. Las CGR fueron trazadas retrógradamente desde los CS con FG, y las retinas se inmunodetectaron con Brn3a y se analizaron a 12 y 15 días tras la inducción de la HTO. Para el análisis estadístico, el test Kruskal-Wallis se utilizó cuando se compararon dos o más grupos y el test Mann-Whitney cuando se compararon dos grupos solamente. Las diferencias entre grupos se consideraron estadísticamente significativas para p<0.05. Resultados Los ratones pigmentados y albinos tienen un número similar de CGRm (1.021±109 CGRm pigmentado y 962±169 CGRm albino). En los ratones pigmentados las CGRm son más abundantes en la retina tempora y en los albinos están más localizadas en la retina superior. Ambos ratones también tienen CGRm desplazadas (CGRm-d) en la capa nuclear interna, que representan el 14% del total de CGRm en ratones pigmentados y el 5% en los albinos. El marcaje desde ambos CS muestra que el 98% (pigmentado) y el 97% (albino) de la población total de CGRm se marcan retrógradamente, mientras que el estudio de colocalización de melanopsina y Brn3a confirma que un porcentaje muy pequeño de CGRm expresa este factor de transcripción en ratones. En el estudio del marcaje retrógrado colocando OHSt en el muñón del nervio óptico demuestra que no todas las CGRm eran trazadas. Existía una subpoblación de CGRm-d (14% en pigmentados y 28% en albinos) y CGRm residentes en la zona ciliar marginal de la retina (20% en pigmentados y 24% en albinos) que no se trazaban desde el nervio óptico; por lo que estas células no envían el axón a través del nervio óptico y pueden ser consideradas interneuronas de la retina, quizá relacionadas con el reflejo pupilar intrínseco. En el estudio de la caracterización del modelo de hipertensión ocular en el ratón pigmentado observamos un aumento significativo de la presión intraocular desde las primeras 6 horas de la fotocoagulación láser hasta los 5 días. En ratón pigmentado, la HTO resulta en una pérdida difusa y/o sectorial de CGR trazadas con el trazador neuronal OHSt (CGR OHSt+) (50% a 2 semanas y 62% a 4 semanas). Sin embargo, a las 2 semanas aún se observa un 66% de CGR marcadas con Brn3a (CGR Brn3a+). Esto indica que sobreviven en la retina aproximadamente un 16% de CGR cuyo transporte axonal retrógrado está comprometido. Parte de estas CGR acaban muriendo y a las 4 semanas el número de CGR trazadas con OHSt e inmunodetectadas con Brn3a se iguala. La población de CGRm disminuyó aproximadamente al 59% a las 2 semanas y al 46% a las 4 semanas, valores similares a los de las CGR Brn3a+ para los mismos tiempos. La distribución topográfica de la pérdida de CGRm, aunque era mayor en la zona supero-temporal de retina, no era sectorial, sino difusa a lo largo de la retina y no se complementaba con la distribución de la pérdida del resto de CGR. En rata albina, la HTO resulta en una pérdida sectorial de las CGR FG+ (78 y 84% a los 12 y 15 días, respectivamente). El número de CGR Brn3a+ fue significativamente mayor para ambos tiempos de estudio, esto indica que una proporción considerable (≈21 - 26%) de CGR sobreviven en la retina con su transporte axonal retrógrado deteriorado. Las CGRm también presentaron una disminución significativa (50-51%) y esta pérdida, al igual que en ratón, fue difusa. La administración intravítrea de BDNF aumentó la supervivencia de las CGR Brn3a+ a 81 y 67% a los 12 y 15 días, respectivamente, pero no tuvo ningún efecto sobre las CGRm. D. Francisco Javier Valiente Soriano “Characterization in adult rodents of the melanopsin retinal ganglion cells population and study of the retinal ganglion cells degeneration after ocular hypertension and neuroprotection” SUMMARY Objetives • Characterization of the mRGC population of adult pigmented and albino mouse. • Study the RGC and mRGC degeneration after OHT in the pigmented mouse. • Study the RGC and mRGC degeneration after OHT and their protection with BDNF in adult albino rat. Material and methods To perform the experiments we used adult pigmented mice, adult albino mice and female adult albino rats. Manipulations of animals were carried out according to the European (Directive 2010/63/UE) and National (RD 53/2013) regulations existing on the protection of animals used for experimentation and other scientific purposes. To study the characterization of the mRGC population of adult pigmented and albino mouse, cross sections of retina and whole mounts were immunoreacted with anti-melanopsin antibody, with anti-Brn3a antibody and stained with DAPI. To study the projection of the mRGC, the neuronal tracer OHSt was applied in both SC or in the optic nerve. To study the RGC and mRGC degeneration after OHT in the pigmented mouse, ocular hypertension model was performed by laser photocoagulation of the perilimbar and epiescleral veins of the experimental eye. To study the time course of the axonal damage and RGC and mRGC death caused, the RGC were traced from the SC with OHSt and retinas were immunodetected with Brn3a and melanopsin and analyzed at 2 and 4 weeks. To study the RGC and mRGC degeneration after OHT and their protection with BDNF in adult albino rat, we analyzed the time course of the axonal damage and RGC and mRGC death after OHT in BDNF or vehicle-treated retinas, RGC were retrogradely traced from the SC with the retrogradely transported tracer fluorogold (FG), retinas were immunodetected with Brn3a and analyzed at 12 and 15 days after the induction of OHT. For statistical analysis, Kruskal–Wallis test was used when comparing more than two groups and Mann–Whitney when comparing two groups only. Differences were considered significant when p<0.05. Results Both pigmented and albino mice have a similar number of mRGC (1,021±109 mRGC in pigmented, 962±169 mRGC in albino). The mRGC are most abundant in the temporal retina in pigmented mice, and in dorsal retina in albino mice. Both mice also have displaced mRGC (d-mRGC) located in the inner nuclear layer representing 14% of the total population of mRGC in pigmented mice and 5% in albino mice. The 98% (pigmented) or 97% (albino) of the total population of mRGC were marked retrogradely from both SC, while the colocalization study of melanopsin and Brn3a confirms that a very small percentage of this transcription factor was expressed by mice mRGC. A surprising fact in the study of retrograde labeling with OHSt applied on the ON stump was that not all the mRGC were traced. A subpopulation of d-mRGC (14% in pigmented and 28% in albino) and mRGC located in the ciliary marginal zone of the retina (20% pigmented and 24% in albino) that were not traced from the optic nerve, that means that these cells do not send an axon into the optic nerve and can be considered an interneuron of the retina, perhaps related to the intrinsic pupil reflex. In the study of the characterization of ocular hypertension model in pigmented mouse, a significant increase of the intraocular pressure (IOP) was observed from 6 hours of laser photocoagulation up to 5 days. OHT results in a sectorial and/or diffuse loss of RGC traced with OHSt (OHSt+RGC) (50% at 2 weeks and 62% at 4 weeks). However, at 2 weeks, 66% of RGC, which were immunodetected with Brn3a (Brn3a+RGC) were still present. This indicates that at this time around 16% of RGC survive in the retina with their retrograde axonal transport committed. These RGC, however, died at 4 weeks and the number of traced OHSt+RGC and immunodetected Brn3a+RGC was equal. The mRGC population decreased to 59% at 2 weeks and to 46% at 4 weeks. These percentages of loss were similar to the Brn3a+RGC at the same time points. The loss of the mRGC was higher in the supero-temporal area of the retina. However, this loss was not sectorial, but was diffuse along the retina, and did not parallel the distribution of loss of the rest of RGC. In albino rat, OHT resulted in a sectorial loss of FG+RGC (78-84% at 12 and 15 days, respectively). The number of Brn3a+RGC was significantly higher in both times of study, which indicates that a significant proportion (≈21-26%) of RGC survive in the retina with their impaired retrograde axonal transport. The mRGC also presented a significant reduction of approximately 50-51%, and this loss, as in mice, was diffuse. The intravitreal administration of BDNF increased the Brn3a+RGC survival to 81% and 67% at 12 and 15 days, respectively, but had no effect on the mRGC. The study of the inner retinal vasculature did not show any abnormality that could explain the sectorial loss of RGC.
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Estudio cuantitativo y cualitativo del aplastamiento intraorbitario del nervio óptico : curso temporal de la degeneración neuronal, efecto neuroprotector de diferentes factores tróficos, y expresión de neurofilamentos / Guillermo Parrilla Reverter; director, Manuel Vidal Sanz.
(Murcia : Universidad de Murcia, Departamento de Cirugía, Pediatría, Obstreticia y Ginecología,, 2006) Parrilla Reverter, Guillermo
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Estudio de la respuesta glial y de las células ganglionares intrínsecamente fotosensibles en dos modelos animales de degeneración hereditaria de fotorreceptores y tras inyecciones intravítreas
(2017-07-19) Di Pierdomenico, Johnny; Villegas Pérez, María Paz; García Ayuso, Diego; Agudo Barriuso, Marta; Facultad de Medicina
Objetivos Estudiar el curso temporal de muerte de los fotorreceptores y la respuesta de las células de macro y microglia en el inicio de la degeneración de la retina, en dos modelos animales de degeneración hereditaria de los fotorreceptores con diferentes mecanismos: la rata P23H-1 y la rata Royal College of Surgeons (RCS). Estudiar la población de células ganglionares de la retina intrínsecamente sensibles a la luz que expresan melanopsina (mCGRs) en uno de los modelos de degeneración hereditaria de fotorreceptores: la rata P23H-1. Investigar la respuesta de las células de macro y microglia de la retina de la rata adulta tras una o varias inyecciones intravítreas (IIV). Material y métodos. Para estudiar la evolución de la degeneración de la retina se utilizaron dos modelos de degeneración hereditaria de los fotorreceptores con paradigmas diferentes, la rata P23H-1 y la RCS, y como controles sanos la rata Sprague Dawley (SD) y la Pieval Virol Glaxo (PVG), respectivamente. Los animales fueron procesados entre los 10 y 60 días de edad y se realizaron secciones transversales en criostato de sus retinas. Las secciones fueron inmunodetectadas con anticuerpos contra; i) rodopsina para detectar los segmentos externos de los bastones, ii) Opsinas L/M y S para detectar los segmentos externos de los conos, iii) molécula ionizadora adaptadora de enlace de calcio1 (Iba1) para detectar las células de microglia, iv) proteína ácida fibrilar glial (GFAP) para detectar las células de macroglia , v) antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) para detectar células en división celular, vi) isolectina B4 (IB4) para detectar las células de microglia y vasos sanguíneos. Además, se cuantificaron las filas de núcleos de los fotorreceptores en la capa nuclear externa y las células de microglía en todas las capas de la retina. Para estudiar la población de mCGRs en las ratas P23H-1 y P23H-3 se utilizaron animales con 30, 365 y 540 días de edad y como control se utilizaron ratas SD con la misma edad. Tras diseccionar y montar a plano las retinas, éstas se inmunodetectaron con anticuerpos contra melanopsina y/o Brn3a para detectar la población de mCGR y la población general de células ganglionares de la retina (CGR), respectivamente. Finalmente, se cuantificaron dichas poblaciones y se representó gráficamente su distribución en la retina mediante el uso de mapas de isodensidad para las CGRs y mapas de vecinos para las mCGRs. Además, de estas últimas se analizó su arborización dendrítica. Para investigar la respuesta de las células de macro y microglia tras una o varias IIV se utilizaron ratas hembra adultas SD. Estas recibieron una o tres IIV (una cada 7 días) de anticuerpo anti VEGF derata (5 μl, 0,015 μg / μl), triamcinolona (2,5 o 5 μl, 40 μg / μL, Trigón Depot), bevacizumab (5 μL y 25 μg / µL, Avastin), o sus vehículos (PBS y solución salina equilibrada (BSS)). Las retinas se analizaron 7 días después de la última inyección, se montaron a plano y se incubaron con anticuerpos contra: i) Iba1, ii) GFAP y iii) vimentina (marcador específico de las células de Müller). Las células de macro y microglia fueron analizadas cualitativamente, además las células de microglia fueron analizadas cuantitativamente mediante un método semiautomático. En todos los estudios las retinas fueron examinadas con un microscopio de fluorescencia. En el estudio de las IIV también se utilizó además microscopía confocal. Resultados. Al analizar las retinas en los animales con degeneración retiniana, se observó que la degeneración de los fotorreceptores comenzaba antes y progresaba más rápidamente en las ratas P23H-1 que en las ratas RCS. Sin embargo, en ambos modelos de degeneración, la activación de las células de microglía ocurría simultáneamente a la muerte de los fotorreceptores; mientras que la sobreexpresión de GFAP en los astrocitos y células de Müller, comenzaba más tarde y con mayor intensida en estas últimas. A medida que progresaba la degeneración, en contraste con los animales sanos, encontramos células microgliales en las capas nuclear externa y de los segmentos externos de los fotorreceptores. Además, el número de células microgliales aumentó en la totalidad de la retina, pero disminuyendo en la retina interna y aumentando en la retina externa. Tanto el número total de células de microglia como la migración de las mismas desde las capas internas hacia las externas fue mayor en las ratas RCS. El mayor número de células microgliales en las retinas degeneradas no se puede explicar solamente con la migración intrarretiniana y además la inmunodeteccion de PCNA reveló proliferación microglial en ambos modelos, aunque más importantemente en las ratas RCS. Cuando se analizó la población de mRGCs y de CGRs en las ratas P23H-1 jovenes comparadas con los animales controles se observó una disminución significativa en las CGRs que expresan Brn3a, pero no de mRGCs. Sin embargo, en las ratas P23H-1 adultas se observó una disminución del número de mRGCs y de CGRs de un 22.6% y un 28,2% a los 365 y 540 días de edad, respectivamente. Además, con el tiempo se observó una disminución en los parámetros de arborización dendrítica de las mRGCs tanto en las ratas P23H-1 como en las ratas P23H-3 (cepa en la que la degeneración de la retina es más lenta). Al analizar la coexpresión de Brn3a y melanopsina en las ratas P23H-1 se encontró un porcentaje significativamente superior de coexpresión de ambos marcadores ya a 30 días de edad (3.31%) con respecto a los animales control (0.27%), además, este porcentaje de coexpresión aumentaba con la edad en las ratas P23H-1 (10,65% a 540 días de edad). Estos cambios celulares y de expresión se observaron solamente en los animales con degeneración hereditaria de los fotorreceptores (P23H-1), ya que en las ratas SD no se observó ningún cambio en la población general de CGR, ni en las población de mRGCs, ni en el porcentaje que mostró coexpresión (0.27%). Finalmente, en las retinas tratadas con las IIV se encontró en la zona de la inyección y a lo largo de toda la retina una importante respuesta de las células de macro y microglia, sin importar la sustancia inyectada; y esta respuesta fue mayor en las retinas que habían recibido varias inyecciones. También se observó una leve respuesta de las células de microglia tras las IIV en las retinas contalaterales que no habían sido inyectadas. Cuando se inyectó el anticuerpo humanizado bevacizumab, este causó una reacción/respuesta microglial tan fuerte que no se pudieron cuantificar las células de microglia. Al analizar la respuesta de las células de macroglia a las IIV se observaron dos tipos de respuesta: hipertrofia astrocítica e hipertrofia de los pies de las células de Müller. La hipertrofia de los astrocitos se observó en toda la superficie de las retinas inyectadas, mientras que la hipertrofia de los pies de las células de Müller sólo se observó en zonas bien definidas de la retina tras las inyecciones de triamcinolona y/o tras inyecciones repetidas. Conclusiones. En las degeneraciones hereditarias de los fotorreceptores la degeneración de la retina tiene un patrón diferente dependiendo del mecanismo etiopatogenico. En los dos modelos estudiados, la activación y migración de las células de microglia es simultánea a la muerte de los fotorreceptores, mientras que la respuesta de las células de macroglia es más tardía. La respuesta de la microglia no se puede explicar solamente en base a la muerte de los fotorreceptores ya que en los dos modelos existe una muerte severa de los fotorreceptores pero la respuesta de la microglia es mayor en las ratas RCS. Por lo tanto, en las ratas RCS la inflamación retininana es mayor y probablemente respondería mejor a un tratamiento antinflamatorio dirigido a la inhibición de las células de microglia. Tras la degeneración de los fotorreceptores hay una perdida secundaria de la población general de CGRs y de mCGRs. Las mCGRs supervivientes mostraron parámetros de arborización dendrítica disminuidos y aumento de la coexpresión de Brn3a y melanopsina. Estos cambios fenotípicos y moleculares pueden representar un esfuerzo de las mCGRs capaces de expresar Brn3a para resistir a la degeneración y / o supervivencia preferencial de las mCGRs. Las inyecciones intravítreas causan una respuesta en las células de macro y microglia que varía dependiendo de las sustancias inyectadas y del número de inyecciones. A mayor número de inyecciones mayor respuesta. Además la respuesta inflamatoria de la glía puede influir en los efectos de las sustancias inyectadas en la retina. SUMMARY. Purpose. To study the temporal course of photoreceptor cell death and macro and microglial reactivity in two rat models of retinal degeneration with different etiologies: the P23H- 1 and the Royal College of Surgeons (RCS) rat strains. To study the population of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells (melanopsin-expressing RGCs, m+RGCs) in a rat model of inherited photoreceptor degeneration: theP23H-1 strain. To investigate the macro and microglial response of the normal rat retina after one or several intravitreal injections. Material y methods. To study the evolution of degeneration in two models of inherited retinal degeneration, we have used the P23H-1 and Royal College of Surgeon rat strains, and control age-matched animals: Sprague Dawley (SD) for the P23H1 rats and Pieval Virol Glaxo (PVG) for the RCS rats. The animals were sacrificed at different postnatal ages (P) (from P10 to P60), and their retinas were cryostat cross-sectioned. Sections were immunodetected with antibodies against: i) rhodopsin to label the rod outer segment, ii) L/M and S opsin to label the cone outer segments, iii) ionized calcium-binding adapter molecule1 (Iba1) to label microglial cells, iv) glial fibrillary acid protein (GFAP) to label macroglial cells, v) proliferating cell nuclear antigen (PCNA) to label cellular proliferation, and vi) isolectin B4 (IB4) to detect microglial cells and blood vessels. The numbers of photoreceptor nuclei rows in the outer nuclear layer and of microglial cells in the different retinal layers were quantified. To study the population of m+RGCs in P23H-1 rats we have used 30, 365, and 540 days old animals (P30, P365 and P540). As controls, we have used age-matched SD rats. The retinas were dissected as whole-mounts and immunodetected with antibodies against melanopsin and Brn3a to detect m+RGCs and the general population of RGCs, respectively. These populations were quantified and their distribution graphically represented with isodensity maps (for RGCs) and neighbour maps (for mRGCs). In addition, some morphometric dendritic parameters of m+RGCs were analysed. To investigate the response of macro and microglial cells after one or more intravitreal injections (IVI) we used SD rats. The left eye received one or three (one every 7 days) IVI of anti-rat VEGF (5 μL; 0.015 μg/μL), triamcinolone (2.5 or 5 μL; 40 μg/μL; Trigón® Depot), bevacizumab (5 μL; 25 μg/μL; Avastin®), or their vehicles (PBS and balanced salt solution). Seven days after the last injection retinas were dissected as whole mounts and incubated with antibodies against: i) Iba1, ii) GFAP, and iii) vimentin (to label Müller cells). Macroglial cells were qualitatively analysed, while microglial cells were quantified using a semiautomatic method. In all studies retinas were examined with a fluorescence microscope, and some retinas that received IVI were observed with confocal microscopy. Results. In young animals with inherited retinal degeneration, photoreceptor degeneration starts earlier and progresses quicker in P23H-1 rats than in RCS rats. However, in both models, microglial cell activation occurs simultaneously with the initiation of photoreceptor death while GFAP over-expression in astrocytes and Müller cells begins later. As degeneration progresses, the total numbers of microglial cells in the retina increase and the numbers of microglial cells in the different layers increase in the outer retinal layers, but decrease in the inner retinal layers, more markedly in RCS rats. Microglial cells reach the outer nuclear and outer segment layers in both models. The higher number of microglial cells in dystrophic retinas cannot be fully accounted by intraretinal migration and PCNA immunodetection revealed microglial proliferation in both models, but more importantly in the RCS rats. Young (P30) P23H-1 rats had significantly lower numbers of Brn3a+RGCs than P30 SD control rats, while the population of m+RGCs was similar in both strains at this age. However, in adult P23H-1 rats there was a decrease in the number of m+RGCs and RGCs of 22.6% and 28.2% at 365 and 540 days of age, respectively. In addition, a decrease in morphometric dendritic parameters of m+RGCs was observed over time in both P23H-1 and P23H-3 rats (a rat line with a slower retinal degeneration). When analysing the co-expression of Brn3a and melanopsin in the P23H-1 rats, a significantly higher percentage of co-expression of both markers was found in m+RGCs already at P30 (3.31%) when compared to control animals (0.27%). This co-expression increased with age reaching 10.65% at P540. Finally, in the retinas treated with IVI we found that all the injected substances caused an important micro- and macroglial response locally at the injection site and all throughout the injected retina. This response was exacerbated by repeated IVI. In the contralateral non-injected eyes there was a microglial response as well, but it was milder than in the injected eye. The IVI of the humanized antibody bevacizumab caused a very strong microglial reaction in the treated retina. Two types of macroglial response were observed: astrocyte hypertrophy and Müller end-feet hypertrophy. While astrocyte hypertrophy was widespread throughout the injected retina, Müller end-feet hypertrophy was observed only in a specific area of the retina and was more extensive with triamcinolone or after repeated injections. Conclusions. In hereditary photoreceptor degenerations, the observed retinal changes vary depending on the etiopathogenic mechanism. In both models, photoreceptor death and microglial cell activation and migration occurred simultaneously, while the macroglial cell response is delayed. The activation of microglial cells in the degeneration process cannot be explained in the basis only of photoreceptor death: these cells participate more actively in the RCS model. Thus, this model is more inflammatory and would probably respond better to interventions aimed to inhibit microglial cells. Inherited photoreceptor degeneration was followed by secondary loss of RGCs labelled with Brn3a and mRGCs. Surviving mRGCs showed decreased dendritic morphometric parameters and increased coexpression of Brn3a and melanopsin. These phenotypic and molecular changes may represent an effort of mRGCs to resist degeneration and/or preferential survival of the cells capable of synthesizing Brn3a. Intravitreal injections cause micro- and macroglial responses that vary depending on the injected agent and the number of injections. The higher the number of injections, the greater the response. This inflammatory glial response may influence the effects of the injected substances on the retina.
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Estudio electrorretinográfico en un biomodelo de glaucoma crónico en Göttingen Minipig
(2014-12-01) Micó Valls, Carlos; Vecino Cordero, Elena; Bayón del Río, Alejandro Ángel; Facultad de Veterinaria
La electrorretinografía es una técnica que permite evaluar de forma objetiva, la función retinal durante el proceso de transformación de un estímulo luminoso en una respuesta eléctrica. En nuestro estudio, se reproduce un biomodelo de glaucoma crónico humano de ángulo abierto en Göttingen minipig. Este biomodelo de glaucoma se consigue mediante la cauterización de las venas epiesclerales de uno de sus ojos, estando ya previamente validado en cerdo. Nuestros objetivos comprenden primeramente, la valoración de la evolución de la presión intraocular a lo largo de un periodo cercano al año (50 semanas), la estandarización de un protocolo electrorretinográfico en el Göttinger minipig y mediante el mismo, analizar los cambios producidos en el electrorretinograma como consecuencia del aumento sostenido de la presión intraocular. Esto nos permitirá crear un modelo de neurodegeneración producido por el glaucoma experimental. Por último, se analizará el modelo de neurodegeneración para encontrar patrones electrofisiológicos tempranos de dicho proceso. Todos estos datos se compararán con la bibliografía existente tanto a nivel de estudios realizados en humanos, como en otros biomodelos. Este estudio fue realizado en los ojos de 5 cerdos Göttingen minipig con edades en torno a los 5 meses. Tras confirmar la aptitud de los ojos para el estudio, a cada uno de los animales se les realizó un estudio clínico electrorretinográfico inicial, basado en las recomendaciones descritas por el ECVO y el ISCEV. El Test electroretinográfico se divide en tres pruebas, donde son recogidas las respuestas de la retina a estímulos de alta frecuencia (30Hz) y estímulos de baja frecuencia (4HZ) en condiciones fotópicas y en escotópicas. Una vez obtenidos los registros electrorretinográficos basales, se procede a la cauterización de las venas epiesclerales dorsales y ventrales de ojo izquierdo de cada animal. Este diseño experimental posibilita obtener en el mismo individuo un ojo control y un ojo experimental. Dicha cirugía permitió obtener una presión intraocular por encima de los valores normales, con un rango comprendido entre los 25 y 40 mmHg y mantenido a lo largo de todas las semanas de estudio. Nuevos estudios electrorretinográficos se repitieron posteriormente a los 2 y 4 meses tras la cirugía. El análisis de los resultados electrorretinográficos obtenidos, permitió mostrar una relación estadísticamente significativa entre el aumento de presión intraocular conseguida en el ojo a estudio, y el descenso de los valores de las ondas del electrorretinograma en dichos ojos. La comparativa realizada entre los valores electrorretinográficos basales y el ojo derecho control, con los datos obtenidos en el ojo izquierdo intervenido, evidencian la existencia de alteraciones en las ondas electrorretinográficas. Estas alteraciones quedan reflejadas primeramente en los valores de la onda-b, la onda-i y el PhNR del electrorretinograma y posteriormente se extienden al resto de los componentes electrorretinográficos. Estas ondas muestran un decrecimiento en su amplitud y latencia conforme avanza el tiempo de estudio y la presión intraocular elevada es mantenida. Dicho decrecimiento muestra un patrón, afectando primero a los componentes electrorretinográficos encargados de evaluar la función de las células ganglionares, así como también cuanto mayor es el tiempo de adaptación a condiciones escotópicas. Esta misma progresión de los valores electrorretinográficos de las ondas, ha sido ya descrita tanto en otros biomodelos de glaucoma experimental, como en personas afectadas por glaucoma crónico de ángulo abierto. Los hallazgos encontrados en nuestro estudio son homólogos a los que describe la bibliografía existente. Dentro de los parámetros cuyos valores muestran afectación debido al aumento sostenido de la presión intraocular, el componente PhNR presenta evidencias de una mayor precocidad en la detección los efectos producidos por dicha presión, en la respuesta de la retina. Los resultados obtenidos en nuestro estudio muestran que, en los ojos intervenidos, este componente posee un mayor número de valores fuera del rango normalidad desde el inicio del estudio electrorretinográfico y así mismo, no presenta alteración en el ojo control. Otros componentes como la onda-i y los valores de onda-b en condiciones escotópicas, presentan valores similares al PhNR pero no de forma tan precoz. Se representa así pues al componente PhNR como un importante marcador que permite el estudio y evaluación de los efectos que produce un aumento de presión intraocular sostenido, en la función electrofisiológica de la retina. The electroretinography is a technique that allows us, in an objective way, to test the function of the retina during the transformation process of a light stimulus into an electrical response. In this study, a biomodel of human chronic open-angle glaucoma is reproduced in Gottinguen minipigs. This glaucoma biomodel is made by the cauterization of episcleral veins in one of their eyes, this was previously described for pigs. Our main objectives include: Firstly, the evaluation of the intraocular pressure evolution throughout a period of nearly a year (50 weeks). Secondly, the standardization of an electroretinographic protocol in the Gottinguer minipig and, by means of it, the analysis of the changes produced in the electroretinogram after a sustained increase of the intraocular pressure. This will allow us to generate a model of neurodegeneration produced by the experimental glaucoma. And lastly, we will analyse the model of neurodegeneration in order to find early electrofisiological patterns in the mentioned process. All these data will be compared with the current bibliography about studies done in humans as well as in other biomodels. This test was done in the eyes of five gottinguen minipigs aged around five months. After verifying the suitability of the eyes for the study, a first electroretinografic clinic study was done to each animal, based on the detailed recommendations of the ECVO and ISCEV. The electroretinographic Test is divided into three different tests, in which we gather the responses of the retine to high(30Hz) and low (4HZ) frequency stimuli in photopic and scotopic conditions. Once we have obtained the basal electroretinographic values, we continue by cauterizing the dorsal and ventral episcleral veins in the left eye of each animal. This experimental design gives us the possibility of obtaining in the same individual a control eye and an experimental eye. Such surgery gave a result of an intraocular pressure above the standard values, with a rank of values between 25 and 40 mmHg, and were maintained all over the test period. New electroretinographic studies were repeated later, two and four months after the surgery. The analysis of the obtained electroretinographic results, gave us the possibility of showing a statistically significant relation between the increase of the intraocular pressure achieved in the eyes tested and the decrease of the electroretinogram wave values in those eyes. This comparison made between the basal electroretinographic values and the control right eye to the obtained data from the operated left eye, showed the presence of alterations in the electroretinographic waves. These alterations are showed first in the b-wave, the i-wave and the PhNR values of the electroretinogram and are later reflected on the rest of electroretinographic components. These waves show a decrease in their amplitude and latency as the time of the study progresses and the high intraocular pressure is maintained. Such a decrease shows a pattern: it first affects the electroretinographic components in charge of evaluating the ganglion cells function, and even more when the adaptation time to scotopic conditions is higher. This same progression of the wave electroretinographic values, has been already described in other biomodels of experimental glaucoma as well as in people affected by chronic open-angle glaucoma. The discoveries found in our study are a counterpart of what it is described in the current bibliography. Among the parameters whose values show affectation because of the sustained increase of intraocular pressure, the PhNR component gives evidence of a higher precocity in the detection of the effects produced by such pressure, in the retine response. The results obtained in our study show that, in the operated eyes, this component has a higher number of values out of the normal rank from the beginning of the electroretinographic study, and besides, there is no alteration in the control eye. Other components as the i-wave and the b-wave values in scotopic conditions, show values similar to the PhNR but not in such an early way. The PhNR is then presented as an important sign for allowing the study and evaluation of the effects produced by an increase of a sustained intraocular pressure in the electrophysiological function of the retine.
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Estudios electrorretinográficos en modelos de neurodegeneración en el sistema visual del roedor adulto
(Universidad de Murcia, 2010-02-09) Alarcón Martínez, Luis; Vidal Sanz, Manuel; Departamentos y Servicios::Departamentos de la UMU::Oftalmología, Optometría, Otorrinolaringología y Anatomía Patológica
Las enfermedades neurodegenerativas cursan con la degeneración y muerte de las neuronas las cuales son incapaces de suplir su propia muerte. Debido a esta característica enfermedades como el Alzheimer, el Parkinson o el Glaucoma no tienen cura en la actualidad. La retina es una proyección del sistema nervioso central (SNC) encapsulada en el globo ocular y aislada del resto del SNC, lo que la hace fácilmente accesible a la manipulación experimental. En este trabajo estudiamos las alteraciones funcionales de la retina con el electrorretinograma de campo completo (ERG), técnica basada en el registro de la respuesta eléctrica retiniana tras la presentación de un estímulo de luz homogéneo. Así hemos estudiado los efectos de la sección del nervio, del aumento de presión intraocular y de la fototoxicidad, dichas lesiones afectan selectivamente a determinadas poblaciones neuronales retinianas e imitan enfermedades neurodegenerativas como el Glaucoma o la Degeneración Macular Asociada a la Edad. Abstract: Neurodegenerative diseases are characterized by degeneration and death of neurons which are unable to recover after a given insult, thus impairing functional recuperation. Because of this, there is no cure for diseases such as Alzheimer, Parkinson or Glaucoma. The retina is a projection of the central nervous system (CNS) located in the eye and therefore, isolated from the rest of the CNS. This makes the retina a very good model for experimental manipulation. In this work we have studied the functional changes in the retina by full field electroretinograme (ERG). This technique records the electric response of the retina after presentation of homogeneous light stimuli. We have studied the effects that optic nerve sections, increase of the intraocular pressure and phototoxicity have on ERG recordings. These lesions impair selectively certain retinal neuronal populations and imitate neurodegenerative diseases as Glaucoma or Age-related Macular Degeneration.
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Identificación y caracterización de la población total de las células ganglionares de la retina en rata : nuevos métodos de trazado, expresión de melanopsina y de factores de transcripción Brn3:estudio de la respuesta neuronal y microglial a la axotomía y efecto del envejecimiento en la retina
(2015-12-01) Nadal Nicolás, Francisco Manuel; Agudo Barriuso, Marta; Vidal Sanz, Manuel; Facultad de Medicina
Introducción La retina es parte del sistema nervioso central (SNC) y se localiza en la cara interna del globo ocular. Su función principal es la fototransducción de las ondas electromagnéticas del espectro de la luz visible en energía eléctrica. Esta función es realizada por los fotorreceptores (conos y bastones). Tras su procesamiento, la información llega a las células ganglionares de retina (CGR). Las CGR son las únicas neuronas aferentes de la retina y transmiten la información visual al cerebro a través de sus axones, que forman el nervio óptico (NO). En roedores, la mayoría de las CGR proyecta contralateralmente, siendo la población ipsilateral menor del 5%. Dentro de las CGR existe un subtipo que contiene un pigmento fotosensible, la melanopsina, que les confiere la propiedad de la fototransducción. Estas CGR melanopsínicas son responsables principalmente de funciones extravisuales o no formadoras de imágenes, como son el reflejo pupilar o la sincronización del ritmo circadiano con la luz. Objetivos 1º Caracterizar un muevo marcador para identificar las CGR de rata: Brn3a. 2º. Caracterizar la expresión de los factores de transcripción de familia Brn3 en las CGR de rata: Brn3a, Brn3b y Brn3c. 3º. Caracterizar las CGR desplazadas en rata albina y pigmentada. 4º. Caracterizar la población de CGR con proyección retino-retiniana en rata. 5º. Desarrollar nuevos métodos de trazado de las CGR de rata: desde el nervio óptico intacto y desde el tracto óptico. 6º. Analizar el efecto del trazado y la lesión axonal en las CGR melanopsínicas y en la expresión de melanopsina en rata albina y pigmentada. 7º. Caracterizar el efecto a largo plazo de la lesión del nervio óptico en la población general de CGR y CGR melanopsínicas ortotópicas y desplazadas y en el resto de las células que componen la capa de células ganglionares en rata albina y pigmentada. 8º. Caracterizar la respuesta de las células microgliales en la retina de rata tras axotomía del nervio óptico. 9º. Caracterizar el efecto del envejecimiento en la retina de rata albina y pigmentada. Material y Métodos. Resultados y Conclusiones Para identificar las CGR clásicamente se han usado técnicas de trazado. Los trazadores como el Fluorogold® (FG) se aplican o en el NO, para identificar la proyección retinofugal completa, o en los colículos superiores (CS), adonde proyectan el 98,4%% de las CGRs en roedores. En esta tesis hemos puesto a punto dos métodos nuevos de trazado: desde el NO intacto o desde el tracto óptico mediante una inyección bilateral estereotáctica. Ambas técnicas son asequibles, reproducibles y fiables. Además, hemos caracterizado el Brn3a como marcador de CGR. El Brn3a es un marcador fiable y eficiente para identificar y cuantificar las CGR en retinas intactas y con lesión axonal y además, permite analizar la topografía de las CGR después del daño axonal ya que a diferencia de los trazadores neuronales, no presenta interferencia con la microglía fagocítica trazada transcelularmente. Conjuntamente hemos analizado la expresión de los tres miembros de la familia Brn3 en las CGR, y hemos demostrado que el 70% de las CGR co-expresan dos o tres miembros de la familia Brn3 y el 30% restante expresa solamente Brn3a (26%) o Brn3b (4%) en retina de rata. Por tanto, el Brn3a se expresa en todas las CGRs exceptuando las CGR melanopsínicas y la mitad de la población ipsilateral. La mayoría de las CGR se localizan en la capa de las células ganglionares (CCG), conocidas como CGR ortotópicas (CGRo), aunque una pequeña población de CGR se encuentra desplazada a la capa nuclear interna o a la capa plexiforme interna. Estas CGR se llaman células de Dogiel o CGR desplazadas (CGRd). Nosotros hemos estudiado a ambas poblaciones en paralelo. Mientras que las CGR ortotópicas se distribuyen principalmente por la región dorso-central de la retina, las CGR desplazadas tienen una topografía diferente, se encuentran en el ecuador de la retina, con un densidad mayor en la retina temporal y son más abundantes en la rata pigmentada. La mayoría de las CGRd expresan Brn3a, y una pequeña proporción expresa melanopsina, estas últimas se distribuyen de manera similar a las CGRo melanopsínicas: son más abundantes en la retina dorso-temporal. Existe una pequeña población de CGR que proyecta a la retina contralateral, éstas son las CGR de proyección retino-retiniana (CGR ret-ret). Hemos corroborado que esta proyección es mayor en animales jóvenes que en adultos y que se encuentran preferentemente en la retina nasal y, además hemos demostrado que éstas expresan Brn3a o melanopsina y que, las que lo hacen, son las que se mantienen en los animales adultos. En la CCG, además de las CGRo hay otras poblaciones celulares: células endoteliales, células gliales y las células amacrinas desplazadas (CAd). En esta tesis hemos descrito que el 45% de las neuronas de la CCG son CGRs y el 55% restante son CAd. Y si excluimos las células endoteliales, las células gliales representarían un 10% de la población total de la capa de células ganglionares. En esta tesis, también analizamos como el albinismo afecta a las CGR. El albinismo es una enfermedad hereditaria, en la que hay una ausencia parcial o total de pigmentación que, entre otras, provoca una serie de anomalías en el sistema visual tales como una menor proyección ipsilateral y número de CGRd y, la agudeza visual y el nistagmus optocinético están afectados. Nosotros hemos demostrado que el albinismo produce los mismos defectos en la población melanopsínica que en el resto de las CGR: disminución en el número de CGRd-m y una proporción inferior de ipsilateralidad. Las lesiones en el SNC provocan la muerte neuronal con secuelas permanentes e irrecuperables, ya que las neuronas del SNC no se reemplazan. En esta tesis hemos utilizado dos modelos de degeneración de SNC que afectan específicamente a las CGR: la lesión traumática axonal por sección (SNO) o aplastamiento (ApNO) de nervio óptico, y la hipertensión ocular (HTO) como modelo de glaucoma aumentando la presión intraocular por fotocoagulación láser de la malla trabecular y las venas perilimbares y episclerales. Usando el modelo de la elevación de la presión intraocular hemos observado que las CGR desplazadas presentan la misma respuesta que las CGR ortotópicas. Y los modelos de axotomía de nervio óptico también nos han permitido documentar que estas lesiones causan la pérdida específica de CGR (ortotópicas y desplazadas), sin afectar a otras poblaciones de la capa de células ganglionares. Sin embargo, dentro de las CGR, las CGR melanopsinicas tienen un curso temporal de pérdida diferente, son más resistentes a la lesión, pero la expresión de melanopsina se infra-regula transitoriamente como respuesta tanto la axotomía como al trazado retrógrado desde el NO. Así, este hallazgo debe ser tenido en cuenta cuando se utilice la melanopsina para estudiar la población de las CGR intrínsicamente fotosensibles. Las células de la microglía (CM) son los macrófagos residentes del SNC. En condiciones normales se encuentran en estado de vigilancia. Sin embargo, tras una lesión neurodegenerativa se activan fagocitando desechos celulares. La aproximación experimental que se utiliza para identificar las CM que han fagocitado una neurona (o CM fagocíticas, CMF) se basa en el hecho de que las CM acumulan en sus fagolisosomas productos exógenos, proceso conocido como marcaje transcelular. Así, cuando una CM fagocita una CGR en degeneración previamente trazada, acumula el trazador siendo posible distinguirla de las CM que no han fagocitado. En esta tesis hemos cuantificado y analizado la distribución de las CM en la CCG y la CPI tanto en animales intactos como después de ambos modelos de axotomia (SNO y ApNO). La aparición de las CMF después del insulto aumenta al aumentar el tiempo post-lesión y se distribuyen en la región central de la retina donde hay una mayor pérdida de las CGR, a diferencia de los animales intactos donde se distribuyen homogéneamente. Aunque éste aumento de CMF es más rápido después de la SNO, existe una correlación lineal y topográfica entre la aparición de las CMF y la pérdida de CGR. La aparición de las CMF en la CCG y el descenso de las CM no fagocíticas en la CPI a 14d de ambas lesiones, sugiere que tras la lesión de las CGR las CM migran entre ambas capas. La pérdida funcional o estructural de la actividad sensorial relacionada con la edad, es muy relevante cuando afecta al sistema visual, ya que de él dependemos más que de otros sentidos. No sólo los componentes puramente físicos implicados en la visión (córnea, cristalino, humor vítreo y humor acuoso) sufren cambios estructurales que influyen en la eficiencia de la transmisión lumínica perjudicando la calidad de la visión, sino que hay pérdida numérica y funcional en las poblaciones celulares implicadas en la transmisión de la información hasta el cerebro que aumenta con la edad. En esta tesis hemos comprobado que el envejecimiento causa principalmente un déficit funcional de la retina en ambas estirpes de rata analizadas. Pero anatómicamente, ni el número de células en la CCG, ni el transporte axonal anterógrado disminuyen con la edad, solamente en la cepa pigmentada, hay un descenso del número de fotoreceptores tipo cono. Y mediante un análisis “in vivo” (SD-OCT), también hemos observado un alargamiento y adelgazamiento progresivo de la retina. Para la realización de esta tesis ha sido necesario el desarrollo de rutinas informáticas que permitan tanto la cuantificación como la representación grafica de la distribución de las diversas poblaciones celulares estudiadas en la retina. Todas estas metodologías automáticas fueron realizadas en colaboración con D. Manuel Jiménez López. Introduction The retina is part of the central nervous system (CNS) and it is located in the posterior part of the ocular globe. The main function of the retina is to sense light. Photoreceptors, cones and rods and send the luminous information to retinal ganglion cells (RGCs) through intermediate neurons. RGCs are the only afferent retinal neurons and transmit this information from the retina to the retinorecipient areas in the brain through their axons that form the optic nerve (ON). In rodents, the majority of RGC project to the contralateral superior colliculi (SCi), being the ipsilateral projection smaller than 5%. There is a subtype of RGC that expresses a photosensitive pigment, melanopsin, that confers them the ability of phototransduction. Melanopsin+RGC (m+RGC) are responsible for the non visual functions triggered by light, such as the pupilary reflex and the circadian photoentrainment. Objetives 1st. To characterize Brn3a as a marker of rat RGCs. 2nd. To characterize the expression of Brn3 transcription factors, Brn3a, Brn3b and Brn3c, in rat RGCs. 3rd. To characterize the population of displaced RGCs in albino and pigmented rats. 4th. To characterize the population of RGCs that project retino-retinially. 5th. To investigate the efficiency of two new methods to trace rat RGCs: from the intact optic nerve and from the optic tract. 6th. To analyze the effect of tracing or axotomy on the expresión of melanopsin and detection of melanopsin+RGCs in albino and pigmented rat RGCs. 7th. To analyze in albino and pigmented rats the long term effect of optic nerve injury on RGCs and m+RGCs orthotopic and displaced, and on the rest of the ganglion cell layer cells. 8th. To analyze the microglial response in the rat retina after optic nerve axotomy. 9th. To study in albino and pigmented rats the effect of aging on the retina. Material and Methods. Results and Conclusions Retrograde tracing with tracers such as Fluorogold® (FG) is the classical approach to identify RGCs. Tracers are applied in the ON to identify the whole retinofugal projection or on the SC, where 98.4% of the RGC project to. In these thesis, we have tuned up two new methods to trace rat RGCs: from the intact optic nerve and from the optic tract by a bilateral stereotactic injection. Both techniques are affordable, reproducible and reliable. In addition we have characterized the Brn3a as a marker of rat RGCs. Brn3a is a reliable marker to identify, quantify and assess the viability of rat RGCs in health and disease. In addition, Brn3a immunodetection allows quantifying and determining the topography of RGCs after a given injury without interference of transcellularly- labelled microglial cells. We have analyzed the expression of the three members of the Brn3 family RGC, and we have shown that 70% of RGC co-express two or three Brn3 members and the remaining 30% expresses only Brn3a (25%) or Brn3b (4%). Brn3a is expressed by all RGCs except melanopsin+ ones and half of the ipsilateral projection. Most of the RGC are placed in the ganglion cell layer (GCL), these are orthotopic RGC (oRGC). However a small proportion of them is located in the inner nuclear layer or in the inner plexiform layer. These are known as Dogiel's cells or displaced RGC (dRGC). We have studied both counterpart together. While the ortothopic RGCs, are denser in the dorso-central retina, the displaced RGCs have a different topography, they are found in the retinal equator, with a higher density in the temporal retina and are more abundant in pigmented animals. Most of the dRGCs express Brn3a, and a small proportion express melanopsin, the last ones have a similar distribution than the m+-oRGCs: they are more abundant in the dorso-temporal retina. There is a small number of RGC projects to the contralateral retina, these are retino-retinal projecting RGC (ret-ret RGC). We have beared out the retino-retinal projection is minute but higher in young than in adult animals. Ret-ret RGCs are mainly nasal, and express Brn3a or melanopsin and those do it, are preserved in adult animals. In the GCL besides oRGC there are endothelial cells, glial cells and displaced amacrine cells (dAC). In this work, we have described that 45%percent of neurons in the GCL are RGCs, and 55% are displaced amacrine cells. And, if we exclude the endothelial cells, glial cells represent 10% of the total cell population of the ganglion cell layer. In this thesis, we have also analyzed how albinism affects RGCs. Albinism is a hereditary disease caused by the partial or total lack of pigmentation that causes a long list of abnormalities in the visual system such as an impaired visual acuity and optokinetic nystagmus and defects in the crossing of the retinofugal projections. Here, we added to this knowledge, that albinism produces in the melanopsin population the same defects than in the general RGC population: reduced number of displaced m+RGCs and a lower ipsilaterally. CNS lesions induce the permanent and irreversible death of the affected neurons, since CNS neurons do not proliferate and thus, are not replaced. In this thesis we have used two models of RGC degeneration: traumatic axonal injury (axotomy) transecting (ONT) or crushing (ONC) the optic nerve, and ocular hypertension (OHT), a model of glaucoma created by increasing the intraocular pressure with laser photocoagulation of the trabecular meshwork, the perilimbar and episcleral veins. Using the ocular hypertension, we have observed that the dRGCs and oRGC respond similarly to lesion. And the axotomy models also allowed us to document that after axotomy only RGCs are lost (ortothopic and displaced) without affecting other populations in the ganglion cell layer. However, within RGCs, the m+RGCs have a different course of loss, they are more resistant to injury, but the expression of melanopsin is temporarily under-regulated in response to both axotomy and retrograde tracing from the NO. Thus, this finding should be considered when melanopsin is used to study the population of the intrinsically photosensitive CGR. Microglial cells (MC) are the CNS resident macrophages. In the healthy CNS they are found in a resting (surveying) state. However, during a neurodegenerative process, they activate and among other functions, phagocytose the cellular debris. The experimental approach to identify CM that have phagocytose a neuron (phagocytic microglial cells, PMC) is based on the fact that CM accumulate in their phagolysosomes exogenous compounds, such as tracers. This process is known as transcellular tracing. Thus, when a MC engulfs a traced RGC it is possible to distinguish it from the rest of MC. In this thesis, we quantified and analyzed the distribution of MC in the GCL and the IPL in intact animal or after both axotomy models (SNO and APNO). The number of CMF after the insult increases with time post-injury. These PMC are distributed in the central region of the retina where the loss of RGCs is greater, unlike in intact animals where they are homogeneously distributed. The appearance of PMC correlates linearly and topographically with the loss of RGCs. The increase of PMC in the GCL and the decrease of MC in the IPL suggest that upon RGC injury, MC migrate between both layers. Aging is very relevant when affects the visual system, since we depend on vision more than on any other senses. Not only the physical components of the eye (cornea, lens, vitreous and aqueous humor) through which the light passes age, there is also a progressive neuronal loss and degeneration. In this thesis we found that aging causes, mainly, a functional deficit in the retina in both rat strains. Anatomically, neither the number of cells in the GCL nor the anterograde axonal transport diminishes with age, however, in the pigmented, but not in the albino rat, there is a loss of cone photoreceptors. And by “in vivo” analysis (SD-OCT), we have also observed a progressive elongation and thinning of the retina. For the consecution of this thesis it has been necessary to develop several automated routines to perform the quantification and graphic representation of the different cell populations analyzed. All these automated methodologies were created in collaboration with D. Manuel Jimenez López.
Open Access
Influencia de las aberraciones en visión binocular mediante el uso de sistemas de óptica adaptativa= Influence of aberrations on binocular vision by means of adaptive optics instruments
(2013-12-19) Schwarz, Christina; Artal Soriano, Pablo; Facultad de Medicina
El objetivo de esta tesis ha sido obtener una mejor comprensión de la influencia que tienen las aberraciones en la visión binocular mediante el uso de le tecnología de óptica adaptativa. Para este fin, se diseñó y construyó un simulador visual binocular de óptica adaptativa capaz de controlar de manera precisa la función pupila compleja en ambos ojos simultáneamente. El sistema se basa en el uso de moduladores espaciales de cristal líquido, lo que permite una alta resolución en planos conjugados de pupila para manipular la amplitud y la fase de ambos ojos de manera independiente. En consecuencia, los resultados y las conclusiones están resumidos. El desenfoque inducido bilateralmente tiene un efecto desventajoso en la sumación binocular. Mientras el mínimo ocurre a distancias intermedias, la sumación binocular recupera valores que se obtienen en el mejor foco. La aberración esférica tiene un impacto favorable en la sumación binocular. En cambio, si se corrige esta aberración, se reduce la sumación binocular. No obstante, si la calidad óptica difiere entre los dos ojo, tanto el desenfoque como la aberración esférica tienen un efecto negativo en la ventaja binocular. Se simuló el beneficio visual al llevarse a cabo una implantación bilateral en pacientes pseudofáquicos con lentes intraoculares correctoras de aberración esférica y aberración cromática longitudinal. En el caso de la corrección combinada de aberración esférica y aberración cromática longitudinal, se puede esperar un aumento significativo de la agudeza visual binocular, aunque la mejora en condiciones binoculares resulta inferior a la obtenida bajo condiciones monoculares. Con la corrección de aberraciones la sumación binocular disminuye. El coma tiene el potencial de extender la profundidad de foco tanto monocular como binocularmente, en gran parte, sin afectar a la agudeza visual en el mejor foco. Debido a la generación de disparidad retiniana, el efecto depende, sin embargo, de la orientación del coma. La mayor extensión de la profundidad de foco se obtiene si el coma está orientado verticalmente en la misma dirección en ambos ojos. La corrección de aberraciones binoculares y la sumación binocular proporcionan una mayor ventaja en condiciones de baja luminancia. La sumación binocular parece estar correlacionada inversamente con la agudeza monocular alcanzada a esos niveles de iluminación y, por tanto, mitiga el rendimiento visual reducido. La visión binocular incrementa la precisión subjetiva en la determinación del mejor foco en baja luminancia. Se encontró un pequeño, pero consistente, desplazamiento relativo miópico cuando se reduce la iluminación, que puede explicarse mediante el efecto Purkinje junto con la aberración cromática longitudinal del ojo humano. El desplazamiento aumenta si la aberración esférica está presente, probablemente debido a la extensión de la profundidad de foco en combinación con el error acomodativo. La simulación de un implante corneal de abertura pequeña demuestra que en condiciones fotópicas aumenta la profundidad de foco con igual eficacia que la monovisión tradicional. Bajo condiciones de luz mesópicas, el rendimiento depende más del sujeto, lo que destaca la importancia de tener en cuenta la agudeza visual bajo estas condiciones de iluminación durante la selección de pacientes. La evaluación de diversos procedimientos de corrección de presbicia muestra el potencial del simulador visual binocular de óptica adaptativa como instrumento de uso clínico. Se podría usar el aparato para encontrar la corrección visual óptima al tiempo que los pacientes podrían adquirir un rol activo en el proceso de tratamiento. Resumen en inglés The aim of this thesis was to achieve a better understanding of the influence of aberrations on binocular vision by means of adaptive optics technology. Therefore, a binocular adaptive optics visual simulator fully capable to control the two complex pupil functions was successfully designed and constructed. The system is based on liquid crystal spatial light modulators offering high resolution in pupil conjugate planes to manipulate amplitude and phase of both eyes independently. This allows to noninvasively modify optical factors such as aberrations and pupil shapes while subjects undergo visual testing. The instrument was used in a variety of experiments to investigate in what way the optics of the eye influence binocular vision. In the following paragraphs, the main results and conclusions are summarized. Bilateral defocus has a detrimental effect on binocular summation, with the minimum occurring at an intermediate vergence. Binocular summation recovers to values obtained at best focus for greater vergences, mitigating the reduction in optical quality. For bilaterally induced spherical aberration, in contrast, a beneficial effect on binocular summation was observed. However, when optical quality is different between both eyes, both defocus and spherical aberration have a negative influence on the binocular advantage. The potential visual benefit of bilateral implantation of the average pseudophakic patient with aspheric-achromatic intraocular lenses was studied. In case of a combined correction of spherical and longitudinal chromatic aberration, significant increase in binocular visual acuity can be expected, albeit the improvement under binocular conditions is lower compared to that under monocular conditions. As the level of aberration correction increases, the binocular summation declines. Inducing coma has the potential to extend monocular and binocular depth of focus, without significantly affecting visual acuity at best focus. Due to the generated retinal disparity, this effect is however orientation dependent. The greatest depth of focus extension is achieved when coma occurs vertically in the same direction. Binocular aberration correction and binocular summation presents a special benefit under low luminance conditions for natural light-adapted pupils. Binocular summation seems to be inversely correlated with monocular VA under natural viewing conditions, thus, mitigating reduced visual performance. Binocular viewing increases the subjects’ precision to judge best-focus positions under reduced luminance conditions. A small but consistent relative myopic shift can be observed as light levels are reduced which can be fully explained by the Purkinje shift in combination with the longitudinal chromatic aberration of the human eye. The shift increases when spherical aberration is induced, probably due to the extended depth of focus in combination with the accommodative lag. Visual simulations of a corneal small aperture inlay prove that this device extends depth of focus just as effectively as traditional monovision in photopic light. Under mesopic luminance conditions, performance is more subject-dependent. For two subjects, performance was still comparable to traditional monovision. However, centration of the device is critical and also the annulus pupil could reduce visual performance with the corneal inlay. Successful simulation of different monovision-types for presbyopia correction demonstrates the potential of the binocular adaptive optics visual simulator as a pre-screening device. The instrument could be used to find the appropriate vision correction for a large number of patients, so that they could take an active role in the treatment process.

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