Browsing by Subject "Embriología animal"

Now showing 1 - 8 of 8
  • Thumbnail Image
    Publication
    Open Access
    Composición del fluido oviductal: estudio comparado del fluido oviductal porcino, bovino y de coneja
    (Universidad de Murcia, 2022-09-26) Jara Pérez, Lourdes; Avilés Sánchez, Manuel; Mondéjar Corbalán, Irene; Escuela Internacional de Doctorado
    El oviducto es un órgano par que conecta los ovarios con el útero y donde tiene lugar el encuentro de los gametos. El oviducto y el fluido contenido en él son de gran importancia en la fecundación. A lo largo de las fases reproductivas de las hembras varían las características del oviducto y la composición del fluido oviductal. En hembras adultas, la fase periovulatoria es el momento en el que el oviducto está preparado para el encuentro de los gametos y el microambiente es favorable para la fecundación. El estudio de su composición puede resultar útil para mejorar las técnicas de reproducción asistida y condiciones patológicas como la polispermia, que es elevada en la especie porcina cuando la fecundación se realiza in vitro. En este estudio se intenta ampliar el conocimiento sobre la composición del fluido oviductal, realizando un análisis comparativo del fluido oviductal porcino de hembras prepúberes, y adultas en fase periovulatoria y luteal. El estudio se realizó sobre muestras fraccionadas mediante cromatografía líquida y columna de afinidad por heparina, que permitió una mayor identificación de proteínas al realizar el análisis proteómico de las muestras, por técnicas de espectrofotometría de masas, que el análisis proteómico de las muestras sin fraccionar. De las proteínas identificadas se prestó mayor atención a aquellas que eran secretadas, 15, 20 y 23 en prepúber, periovulatorio y luteal. Algunas de las proteínas secretadas, con importancia en la fecundación, fueron descritas por primera vez en el fluido oviductal porcino, como la heparanasa, progranulina o pleiotrofina. Una segunda parte de este trabajo se centró en el estudio del efecto de cada fracción sobre el endurecimiento de la zona pelúcida de los ovocitos, midiendo el tiempo de resistencia a la digestión enzimática tras la incubación de los ovocitos con las fracciones del fluido oviductal estudiadas. El endurecimiento se produjo tras la incubación con el fluido oviductal porcino de hembras en fase periovulatoria. En las fracciones de esta fase es donde mayor número de péptidos de oviductina se detectan, y su cantidad similar entre ellas como también comprobamos mediante técnicas de electroforesis y western blot. Solamente una de las fracciones produjo endurecimiento de la ZP. Fue ña fracción en la que se detectaron una mayor cantidad de proteínas secretadas mediante el análisis proteómico. Por último realizamos un estudio comparado entre fluido oviductal bovino y de coneja en fase periovulatoria, mediante técnicas de electroforesis 2D y DiGE, donde se observó una expresión diferencial en 217 manchas. En las manchas analizadas por MS/MS se identificaron 13 proteínas sobreexpresadas en fluido oviductal bovino frente a FOC y 11 se sobreexpresadas en FOC frente al bovino. Las proteínas sobreexpresadas en FOB muestran distintas acciones relacionadas con la defensa inmunológica, respuestas al estrés oxidativo y procesos relacionados con la interacción con el espermatozoide, mientras que la mayoría de las proteínas sobreexpresadas en el FOC tienen efecto antioxidante y relacionadas con la respuesta inmune.
  • Thumbnail Image
    Publication
    Open Access
    Comunicación materno-embrionaria y sus consecuencias en el desarrollo embrionario en bovino= Maternal-embryo interaction and consequences for embryo development in cattle
    (2014-07-14) Maillo Sevilla, Verónica; Rizos, Dimitrios; Lonergan, Patrick; Facultad de Veterinaria
    El objetivo de esta tesis ha sido estudiar la comunicación materno-embrionaria y sus consecuencias en el desarrollo embrionario. Para ello, se emplearon novillas Holstein primíparas postparto secadas (n=10) u ordeñadas (n=11) y se recogieron muestras de sangre dos veces por semana desde 15 días antes del parto hasta 100 días después, para medir ácidos grasos no-esterificados, β-hidroxibutirato, glucosa, insulina y factor de crecimiento insulínico tipo 1. Alrededor del día 60 (d60) postparto, se transfirieron 65 embriones in vitro, entre 2-4 células, al oviducto ipsilateral al cuerpo lúteo (CL) a todas las vacas en el d2 del ciclo estral, para observar el desarrollo embrionario cinco días después. Pasado el d90 postparto, se transfirieron 15-20 blastocistos in vitro al útero en d7, recuperándose el d14 tras sacrificarlas. El peso y la condición corporal fueron diferentes entre los grupos durante el estudio. Las vacas lactantes presentaron unos niveles altos de ácidos grasos no-esterificados y β-hidroxibutirato y bajos de glucosa, insulina y factor de crecimiento insulínico tipo 1 comparados con las no lactantes. En las vacas lactantes se recuperaron menos embriones en estadio de blastocisto comparado con las no lactantes. Sin embargo, la supervivencia embrionaria y el tamaño del concepto el d14 fue igual entre ambos grupos. Como conclusión, el tracto reproductivo de las vacas lactantes tiene una menor capacidad para mantener el desarrollo embrionario temprano comparado con las no lactantes. A continuación, se sincronizaron novillas de carne y las que presentaron celo (Día 0) se dividieron en cíclicas (no inseminadas, n=6) o gestantes (inseminadas artificialmente, n=11). Después de sacrificarlas (d3), ambos oviductos se diseccionaron, dividiéndose en ámpula e istmo. Cada porción se lavó para confirmar la presencia del ovocito/embrión y se abrió para obtener las células oviductales, que se congelaron en nitrógeno líquido para realizar un microarray. Todos los ovocitos/embriones se localizaron en el istmo del oviducto ipsilateral. El microarray de las células reveló que el embrión no afecta el transcriptoma del oviducto. Sin embargo, existe una gran diferencia entre el ámpula y el istmo del oviducto ipsilateral en novillas gestantes. Así, 2287 genes se expresaron de forma diferente: 1132 estaban sobre-expresados y 1155 menos expresados en el istmo. El análisis ontológico mostró que algunos de los procesos biológicos más representados en el istmo eran: síntesis de nitrógeno, lípidos, nucleótidos, esteroides y colesterol, transporte mediado por vesículas, ciclo celular, apoptosis, endocitosis y exocitosis. En el ámpula fueron: movimiento celular, motilidad y migración, reparación de ADN, homeostasis del calcio, biosíntesis de carbohidratos y regulación del movimiento y frecuencia del batido ciliar. En resumen, pese a las grandes diferencias entre el transcriptoma de istmo y ámpula, los datos sugieren que el embrión no altera la expresión de las células del istmo, aunque no se puede descartar un efecto localizado en el lugar concreto donde estaba el embrión. Finalmente, se trataron novillas de carne sincronizadas (n=43) con una dosis de solución salina el d1 (control) o 3000UI los días 1, 2, 3, o 4 después del celo. La hCG en el d1 no tuvo efecto ni en el CL ni en la concentración de progesterona. Sin embargo, el tratamiento los días 2, 3, o 4 incrementó el CL desde el día 6-12, 9-11, y 9 y 10, respectivamente (P<0.05), acompañado por un incremento en la progesterona, desde el día 6-11 (hCG d2) y desde el día 8-13 (hCG d4) (P<0.05). En d4, la hCG indujo la formación de un CL accesorio en el 89% de las novillas. Para concluir, la administración de hCG el d2 después del celo conlleva un incremento de progesterona en la circulación desde el d6, que podría beneficiar la elongación del concepto. The objective of this thesis was to study embryo-maternal interaction and its consequences on embryo development. Post-calving primiparous Holstein heifers were dried off (n=10) or milked (n=11). Blood samples were taken twice per week from 15 d before calving to 100 d postpartum to measure nonesterified fatty acids, β-hydroxybutyrate, glucose, insulin and insulin-like growth factor-I. Around 60 d postpartum, approximately 65 two- to four-cell embryos, produced in vitro, were endoscopically transferred to the oviduct ipsilateral to the corpus luteum (CL) of all cows on Day 2 of the estrous cycle. Five days later, the oviduct and uterus were flushed and blastocysts were recorded. After 90 d postpartum, 15 to 20 in vitro-produced blastocysts were transferred to the uterus of each cow on Day 7 and recovered after slaughter on Day 14. Body weight and body condition score were significantly different between groups during the study. Nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate were higher and glucose, insulin and insulin-like growth factor-I were lower in lactating compared to nonlactating cows. Fewer embryos developed to the blastocyst stage on Day 7 in lactating compared with the nonlactating cows. However, embryo survival and conceptus size on Day 14 were not different between lactating and nonlactating cows. In conclusion, the reproductive tract of the lactating dairy cow is compromised in its ability to support early embryo development compared with nonlactating cows. Then, cross-bred beef heifers were synchronized and those in standing oestrus (=Day 0) were assigned to cyclic (non bred, n=6), or pregnant (artificially inseminated, n=11) groups. After slaughter on Day 3 both oviducts were isolated and divided in ampulla and isthmus. Each portion was flushed to confirm the presence of an oocyte/embryo and opened longitudinally to obtain epithelial cells. Cells were snap-frozen in liquid nitrogen for microarray analysis. All recovered oocytes/embryos were located in the isthmus of the ipsilateral oviduct. Microarray analysis of oviductal cells revealed that the presence of an embryo did not affect the oviduct transcriptome. However, major differences existed between the ampulla and isthmus of the oviduct ipsilateral to the CL. Thus, 2287 genes were differentially expressed (P<0.01) of which 1132 and 1155 were up- and down-regulated in the isthmus, respectively. Gene ontology revealed that some of the biological processes overrepresented in the isthmus were: synthesis of different compounds, vesicle-mediated transport, cell cycle, apoptosis, endocytosis and exocytosis; whereas cell motion, motility and migration, DNA repair, calcium ion homeostasis, carbohydrate biosynthetic process and regulation of cilium movement and beat frequency were overrepresented in the ampulla. In conclusion, while large differences in gene expression were observed between the isthmus and ampulla, data suggest that the presence of an embryo does not alter the transcriptome of the cells of the isthmus, although a local effect at the precise position of the embryo cannot be ruled out. Finally, synchronized cross-bred beef heifers (n=43) were administered with saline on Day 1 (control) or 3000 IU hCG on Day 1, 2, 3, or 4 after oestrus. hCG on Day 1 had no effect neither on CL area nor progesterone concentration. However, treatment on Day 2, 3 or 4 increased CL area from Day 6 to 12, 9 to 11, and on Day 9 and 10, respectively (P<0.05). This was accompanied by an increase in progesterone, from Day 6 to 11 (hCG Day 2) and from Day 8 to 13 (hCG Day 4) (P<0.05). Injection of hCG on Day 4 induced the formation of accessory CL in 89% of heifers. In conclusion, administration of hCG at Day 2 after oestrus results in increased progesterone in circulation from D6, which should have beneficial effect on conceptus elongation.
  • Thumbnail Image
    Publication
    Open Access
    Effects of assisted reproductive technologies and reproductive fluids on phenotypical and epigenetics modifications in Bos taurus oocytes, preimplantational embryos and offspring
    (Universidad de Murcia, 2019-09-26) Portugal de Sena Lopes, Jordana Luísa; Coy Fuster, Pilar; Mermillod, Pascal; Soom, Ann Van; Escuela Internacional de Doctorado
    Human infertility is a disease that has been growing in large numbers in the past few years. Assisted reproductive technologies (ART) are the solution for many fertility issues in both human and animal world. Everyday new procedures are being developed but data on the consequences of these are not being generated at the same rate as they are being implemented. It is, then, imperative to investigate in this field in order to improve the results and to guarantee the health status of ART resulting offspring. The aim of this thesis was to study both the effect of the techniques as well as the protocols used, covering from the oocyte to the offspring. In Chapter 1, a brief review on the literature was made, where infertility in both humans and animals was approached, as well as the history of ART development, the most used techniques at the moment and lastly, the problems that have been associated with those ART. Chapter 2 summarize the main hypotheses and objectives of this thesis, while Chapter 3 embarked on the study of one of the most used ART: controlled ovarian stimulation (COS). We hypothesized that the methylome of oocytes submitted to hormonal stimulation would be altered. Cow oocytes from unstimulated animals were collected from pre-ovulatory stage and later, the same animals were hormonally stimulated to collect the oocytes as well. We performed single cell whole genome sequencing to those oocytes and results showed that, although the methylome of unstimulated and stimulated oocytes was quite similar globally, differences in methylation of specific CpG islands of imprinted genes and imprinting control regions were detected. Chapter 4 focused on the study of protocols of oocyte maturation in vitro. By adding the natural milieu of the oocyte (follicular fluid), we hypothesized that the oocyte competence would increase. Oocytes were matured in vitro using as supplement bovine follicular fluid (bFF), heat-inactivated bovine follicular fluid (bFFin) and fetal bovine serum (FBS). Results from oocyte competence evaluation showed no difference in nuclear maturation nor cortical granules distribution. However, bFF oocytes showed higher cumulus expansion rate than the other groups. Efficiency of in vitro fertilization of the oocytes showed lower values for bFFin group, but cleavage and blastocyst yield were similar across groups. Both bFF-derived embryos developed faster than FBS embryos and had increased total cell number. Nonetheless, higher quality was not decisive when evaluating embryo survivability post-vitrification. In Chapter 5, embryos were produced in vitro using culture media improved by reproductive fluids (RF), as well as control embryos (standard protocol, with bovine serum albumin, BSA). These embryos were vitrified and stored until warming and transfer to synchronized recipients. A parallel group consisting of artificial inseminated (AI) cows was created using the same bull as IVP embryos. Hormonal concentrations of pregnant recipients were followed during gestation in order to detect possible differences. These differences were more frequent between BSA and AI group, while RF pregnant group had more intermediate values. However, calving issues were more severe in both IVP groups than in AI, as well as neonatal mortality only happened in the IVP groups. In Chapter 6, we studied the calves resulting from chapter 5 and evaluated their growth and haematological status during the first 30 days of life. Only one difference in growth parameters was constantly different, which was the height at withers from AI calves being higher than IVP calves. Haematological parameters showed isolated differences in each day, not being repeated in different days. But all animals showed values that are in accordance to expected normal values. However, it is yet to be understood if these calves will have any difference in their development, as it might be too soon to draw conclusions. Additionally, biopsies were made to these calves in order to detect any change in the imprinting status of genes that are involved in the appearance of overgrowth syndromes. In summary, this thesis has shown that ART are many kilometres away from being the perfect substitute to in vivo embryo production, development and birth. The use of hormonal stimulation that is widely implemented in fertility clinics might be the reason of many alterations found in in vitro produced offspring. The supplementation of maturation medium might also be the key to change the in vitro embryo quality. Offspring derived from in vitro production of embryos might have a tendency to have more difficulties during deliver, but seem particularly similar to their in vivo controls after birth until one month of life. Changes are necessary in current used protocols and studies need to be made to fully understand the effects that ART have on the future offspring.   La infertilidad humana es una enfermedad que ha crecido exponencialmente en los últimos años. Las técnicas de reproducción asistida (TRA) son la solución para muchos problemas de fertilidad tanto en la especie humana como en el mundo animal. Pero, los datos sobre las consecuencias de las TRA no están siendo generados a la misma velocidad a la que se implementan los nuevos procedimientos. El objetivo de esta tesis doctoral consistió en estudiar el efecto de diferentes TRA y de los protocolos utilizados, cubriendo desde el ovocito hasta la descendencia. En el Capítulo 1, se presenta una breve revisión de la literatura, donde se aborda el problema de la infertilidad tanto en humanos como en animales, así como la historia del desarrollo de las TRA, los protocolos más utilizados actualmente, y, por fin, los problemas que han sido asociados a esas mismas TRA. El Capítulo 2 resume las hipótesis y objetivos de la tesis doctoral, mientras que el Capítulo 3 incluye el estudio de una de las TRA más utilizadas: la estimulación ovárica controlada (EOC). Nuestra hipótesis sería que el metiloma de los ovocitos sometidos a tratamiento hormonal estaría alterado. Se obtuvieron ovocitos de vacas no-estimuladas a partir de folículos pre-ovulatorios y, posteriormente, los mismos animales fueran estimulados hormonalmente para obtener nuevamente sus ovocitos. Utilizando tecnología de secuenciación masiva, obtuvimos el metiloma individual de los ovocitos y los resultados demostraron que, aunque el metiloma de los ovocitos no-estimulados y estimulados es globalmente muy parecido, existen diferencias específicas en la metilación de islas CpG de determinados genes de impronta y en sus regiones de control. El Capítulo 4 se ha enfocado al estudio de protocolos de maduración in vitro. Nos planteamos como hipótesis que al añadir el medio natural en el que madura el ovocito (fluido folicular) al medio de cultivo in vitro se incrementaría la competencia del ovocito para dar lugar a un embrión sano. Los ovocitos fueron madurados in vitro utilizando como suplemento fluido folicular bovino (bFF), fluido folicular bovino inactivado por el calor (bFFin) y suero fetal bovino (FBS). Los resultados demostraron los ovocitos de bFF tuvieran una mayor expansión del cumulus oophorus en comparación con los restantes grupos. Tras la fecundación in vitro, el grupo bFFin demostró una menor eficiencia, pero el porcentaje de blastocistos fueron similares entre grupos. Los embriones de los dos grupos experimentales se desarrollaron más rápidamente que los embriones del grupo FBS y presentaron mayor número de células totales. Sin embargo, la mayor calidad embrionaria no fue decisiva a la hora de evaluar la supervivencia pos-vitrificación En el Capítulo 5, embriones producidos in vitro utilizando medios de cultivo embrionario mejorados con la adición de fluidos reproductivos (RF), así como embriones control (con adición de albumina sérica bovina, BSA) fueron obtenidos para nuestros experimentos. Estos embriones fueron vitrificados y almacenados hasta su desvitrificación y transferencia a hembras receptoras sincronizadas. Paralelamente, se estableció un grupo de vacas inseminadas artificialmente (AI) utilizando el mismo toro que había sido utilizado para generar los embriones in vitro (grupos IVP). Las concentraciones hormonales de las receptoras fueron seguidas durante toda la gestación, con la intención de detectar posibles diferencias. Estas diferencias fueron más frecuentes entre los grupos BSA y AI, mientras que el grupo RF obtuvo valores intermedios. Sin embargo, se observó una mayor tendencia a la aparición de problemas en el parto en los grupos IVP así como la mortalidad neonatal ocurrió solo en los grupos IVP. En el Capítulo 6 estudiamos los terneros obtenidos según describimos en el Capítulo 5 y evaluamos su crecimiento y parámetros hematológicos durante los 30 primeros días de vida. Solo una diferencia de crecimiento fue constante durante el estudio: la altura a la cruz del grupo AI fue siempre superior a los grupos IVP. Los parámetros hematológicos demostraran algunas diferencias aisladas en algunos días, pero esas mismas no se repetían en distintos días. Sin embargo, todos los valores obtenidos se encontraban dentro de los rangos normales esperables para esa edad. Queda aún por entender si estos terneros tendrán alguna diferencia en el desarrollo posterior, ya que podrá ser muy temprano para llegar a conclusiones. Adicionalmente, se realizaron biopsias a estos mismos terneros para detectar algún cambio en el estadio de impronta de algunos genes asociados a síndromes de sobrecrecimiento. En conclusión, esta tesis demuestra que las TRA están muy lejos de ser el perfecto sustituto a la producción de embriones, desarrollo y nacimiento in vivo. El uso de estimulación hormonal, ampliamente implementado en las clínicas de fertilidad, puede ser la razón de muchas de las alteraciones encontradas en descendencia producida in vivo. La suplementación del medio de maduración puede también ser el punto clave para cambiar la calidad embrionaria in vitro. La descendencia derivada de la producción de embriones in vitro puede tener más dificultades en el parto, pero es muy similar a sus controles in vivo después del nacimiento hasta el primer mes de vida. Es evidente que se necesitan cambios en los protocolos utilizados actualmente y deben realizarse más estudios para entender los efectos de las TRA en la descendencia futura.
  • Thumbnail Image
    Publication
    Open Access
    Estudio de las implicaciones funcionales de la proteína oviductina en la fertilidad y el desarrollo embrionario en hámster dorado y conejo utilizando la tecnología CRISPR-Cas9
    (Universidad de Murcia, 2023-10-04) Balastegui Alarcón, Miriam; Avilés Sánchez, Manuel; Izquierdo Rico, María José; Escuela Internacional de Doctorado
    La infertilidad es un problema clínico muy extendido que afecta al 8 12% de las parejas en todo el mundo. De ellas, alrededor del 30% son diagnosticadas de infertilidad idiopática. La infertilidad relacionada con el factor femenino representa alrededor del 40-50% de los casos totales de infertilidad. Dentro de los posibles motivos de infertilidad idiopática, cabe destacar las probables alteraciones presentes en genes implicados en la fecundación y el desarrollo embrionario temprano. Así, las causas genéticas constituyen el 5-10% de todas las mujeres infértiles. El oviducto, denominado trompa de Falopio en la especie humana, y en particular el fluido oviductal (FO) crea un microambiente que interviene en procesos claves para la fecundación y la correcta fisiología del gameto y del embrión. La oviductina o glicoproteína oviductal 1 codificada por el gen OVGP1, es la proteína no sérica mayoritaria en el FO, habiendo sido identificada en diferentes especies de mamíferos, incluido el conejo, el hámster y el ser humano. En base a estas premisas el objetivo principal de la presente Tesis Doctoral ha sido comprobar el papel desempeñado por la proteína oviductina en la fecundación y en el desarrollo embrionario temprano, usando como modelos animales KO (del inglés, knock out) las especies hámster dorado (Mesocricetus auratus) y conejo común (Oryctolagus cuniculus). Este estudio ha permitido valorar si la presencia de oviductina es imprescindible para una correcta función reproductiva en estas especies. El segundo objetivo, también relacionado con el gen OVGP1, fue su análisis filogenético en la subfamilia Murinae. Dentro de esta subfamilia encontramos al ratón, que posee una proteína oviductina funcional, y a la rata, donde OVGP1 es un pseudogen. Este análisis ha permitido datar en qué fecha se produjo dicha pseudogenización, así como determinar qué otras especies se ven también afectadas por este proceso dentro de esta subfamilia. El tercer y último objetivo de esta Tesis está relacionado con el bloqueo de la polispermia. La poliploidía es una condición indeseable que provoca el fracaso del desarrollo embrionario. Para evitarla, el bloqueo de la polispermia impide la fecundación del óvulo por más de un espermatozoide. Dependiendo de la especie de mamífero, el bloqueo de la polispermia se produce a diferentes niveles: el oolema, la zona pelúcida (ZP) o ambos. En el bloqueo de la polispermia a nivel de la ZP, la proteasa ovastacina y la proteína ZP2 desempeñan un papel crucial. En el caso del conejo, el bloqueo de la polispermia se produce a nivel del oolema. Por tanto, el propósito científico ha sido determinar el mecanismo responsable de este proceso, para ello mediante análisis genómico se estudió la existencia de una pseudogenización del gen ASTL, gen codificante de la proteína ovastacina, en lagomorfos. Para el primer objetivo, se comenzó con la caracterizaron de ambos modelos animales KO para OVGP1 mediante experimentos de biología molecular y proteómica. A continuación, se analizó la fertilidad in vivo determinando si la ausencia de la proteína oviductina desencadena alteraciones de la fertilidad en estas especies. Para valorar los motivos causales de dichas alteraciones se realizó un estudio histológico de oviducto, un análisis del desarrollo embrionario preimplantacional, así como un análisis transcriptómico comparado de oviducto y embriones. Para el segundo objetivo se analizó mediante PCR la secuencia genómica del gen Ovgp1 en 22 especies de la subfamilia Murinae, obteniendo el árbol filogenético que nos permite datar la pseudogenización de Ovgp1 en esta subfamilia. Para el tercer objetivo se analizó mediante PCR la secuencia genómica de ASTL en 9 especies de lagomorfos determinando la pseudogenización de ASTL. En conclusión, los modelos animales KO para OVGP1 presentados en esta Tesis han demostrado que la proteína oviductina es esencial para un correcto desarrollo embrionario en hámster, pero no en conejo. El análisis filogenético del gen Ovgp1 en la subfamilia Murinae ha permitido datar su pseudogenización hace aproximadamente 12,5 millones de años, viéndose afectadas, a parte de la rata, otras especies pertenecientes a la tribu Rattini. Finalmente, el análisis genómico de ASTL en lagomorfos ha confirmado su pseudogenización en estas especies, pudiendo ser el motivo por el cual el bloqueo de la polispermia no se produce a nivel de la ZP en estas especies.
  • Thumbnail Image
    Publication
    Open Access
    Impact of embryo transfer and In vitro production of embryos on phenotypical and molecular traits ofoffspring in the porcine species (Sus scrofa)
    (Universidad de Murcia, 2020-07-29) París Oller, Evelye de las Mercedes; Coy Fuster, Pilar; Cánovas Bernabé, Sebastián; Kelsey, Gavin; Escuela Internacional de Doctorado
    Las técnicas de reproducción asistida (TRA) son una ciencia en crecimiento a nivel mundial. Muchas de estas técnicas se han desarrollado y aplicado, tanto en humanos como animales, para resolver problemas de infertilidad o para aumentar el rendimiento productivo de animales. El uso de TRA en animales tiene un doble objetivo: por un lado, todas las TRA han sido y son desarrolladas primero en animales sirviendo de modelo para la especie humana; y, por otro lado, debido al crecimiento demográfico de la población, su uso ha sido incrementado a fin de abastecer una mayor demanda de la producción de carne y leche. A nivel científico, el uso de modelos animales está ampliamente establecido para el estudio de enfermedades, entre otras aplicaciones. En este sentido, el cerdo presenta especial interés en todos los campos biomédicos dadas sus similitudes genéticas, fisiológicas y anatómicas con la especie humana. El uso de TRA en ganadería ha adquirido más relevancia en cuanto al desarrollo de nuevos procedimientos para lograr un mayor rendimiento productivo al menor coste. Sin embargo, estos objetivos no siempre son alcanzados o puede dar lugar a consecuencias no deseadas. Por ejemplo, la inseminación artificial (IA) está ampliamente establecida en granjas porcinas al proporcionar altos rendimientos productivos, aunque aumenta la endogamia dentro de una misma población. La transferencia embrionaria (TE), por otro lado, ha presentado algunas limitaciones en la especie porcina debido a la necesidad de llevar realizar un procedimiento quirúrgico o al gran número de embriones necesarios en cada transferencia. Sin embargo, aunque el desarrollo de la TE no quirúrgica ha proporcionado grandes ventajas por ser un procedimiento más seguro o por minimizar el riesgo de transmisión de enfermedades, y suponer un menor coste, su uso es aún muy limitado en la industria porcina. Las consecuencias a corto y largo plazo derivadas del uso de TRA en humanos y animales aún están poco establecidas. Se sabe que tanto gametos como embriones tempranos se encuentran en una etapa crítica de reprogramación epigenética, siendo muy sensibles a las condiciones ambientales. Por ello, la realización de más estudios sería necesario para conocer las consecuencias a corto, medio y largo plazo. El objetivo de esta tesis fue estudiar, utilizando el cerdo como modelo, el impacto de algunas TRA sobre varios rasgos fenotípicos y moleculares de la descendencia hasta los 6 meses de edad. En el Experimento 1, se recogieron embriones de cerdas donantes y se transfirieron no quirúrgicamente a receptoras. Las hembras procedentes de embriones producidos in vivo mostraron mayor peso al nacimiento que aquellas procedentes de IA; sin embargo, esas diferencias desaparecieron el día 15. La TE no indujo diferencias en los parámetros hematológicos y bioquímicos de la descendencia de relevancia clínica conocida. En los Experimentos 2 y 3, la producción in vitro (PIV) de embriones se realizó utilizando o no fluidos reproductivos (FR) como aditivos en los medios de cultivo, los embriones se transfirieron quirúrgicamente a cerdas receptoras y se estudió el crecimiento y desarrollo de los lechones hasta los 6 meses de edad. El uso de FR como aditivos no afectó las tasas de gestación y parto. La TE de embriones producidos in vitro no afectó el peso de la placenta, pero sí al tamaño y la eficiencia ésta. El peso al nacimiento, la longitud craneocaudal y la distancia anogenital de lechones procedentes de embriones producidos in vitro con FR como aditivos fueron más similares a los obtenidos por IA. Se observó un mayor peso al nacimiento y un crecimiento más rápido hasta el 6º mes de vida en lechones procedentes de embriones producidos in vitro. Esta tendencia se vio disminuida por la adición de FR a los medios de cultivo. Los lechones procedentes de embriones producidos in vitro, con la adición de FR mostraron un fenotipo más similar en cuanto a parámetros hematológicos con los nacidos por IA respecto a aquellos procedentes de embriones producidos in vitro sin FR. La tolerancia a la glucosa en lechones en crecimiento mostró una tendencia similar en los tres grupos. En resumen, la investigación desarrollada en esta tesis demostró que tanto el crecimiento como el perfil hematológico y bioquímico de los lechones no se ven afectados por la TE durante los primeros 15 días de edad. Por otro lado, aunque el rendimiento reproductivo no se ve afectado por la fuente de proteínas de los medios de cultivo, hay una influencia en la eficiencia placentaria y algunos de sus rasgos moleculares. Además, existe un efecto derivado de la producción in vitro de embriones en el crecimiento y algunos parámetros hematológicos, que se mitiga mediante la adición de FR a los medios de cultivo.
  • Thumbnail Image
    Publication
    Open Access
    Optimization of the generation of genetically modified pigs
    (Universidad de Murcia, 2025-07-10) Piñeiro Silva, Celia; Gadea Mateos, Joaquín Jerónimo; Escuela Internacional de Doctorado; Escuela Internacional de Doctorado
    La presente tesis doctoral se presenta como un compendio de cuatro publicaciones científicas que contribuyen a una línea de investigación centrada en la edición genética de embriones porcinos mediante técnicas de electroporación y lipofección. El objetivo de esta tesis fue optimizar las metodologías de edición genética en embriones porcinos mediante el uso del sistema CRISPR/Cas9 y de las técnicas de electroporación y lipofección. La mejora de la eficiencia de estas técnicas permitirá su aplicación en los campos de la biomedicina y la producción animal, incluyendo la generación de modelos de enfermedades, la resistencia a enfermedades virales y el avance en xenotrasplantes. Los estudios se realizaron fundamentalmente siguiendo un procedimiento estándar de producción in vitro de embriones porcinos. Se aplicaron diferentes protocolos de edición genética con CRISPR/Cas9 y se evaluó la eficiencia de la electroporación y la lipofección en términos de desarrollo embrionario y parámetros de mutación. Se realizó el genotipado de los embriones mediante PCR fluorescente y electroforesis capilar en gel para verificar las modificaciones genéticas en los embriones porcinos y se evaluó su desarrollo hasta la fase de blastocisto. Se demostró que la electroporación antes de la fecundación in vitro (FIV) permite generar embriones porcinos con mutaciones simples, dobles y múltiples de manera eficiente. La tasa de mutación no depende del número de guías por tratamiento, sino de la guía específica utilizada, y la concentración de ARN guía (sgRNA) y de la proteína Cas9 juega un papel crucial en la eficiencia del sistema de edición genética, afectando tanto a la tasa de mutación como al grado de mosaicismo. Además, la combinación de la electroporación con la FIV favorece el desarrollo embrionario temprano, ya que aumenta la activación ovocitaria y la proporción de ovocitos con un solo pronúcleo a las 18 horas post-inseminación, lo que incrementa la formación de partenotes sin alterar la tasa de blastocisto. En términos de optimización técnica, se identificó que el Opti-MEM es mejor medio de electroporación que el Duplex Buffer en términos de desarrollo embrionario. Asimismo, el momento de realización del procedimiento de electroporación con respecto a la FIV no influye en el desarrollo embrionario ni en la activación partenogénica, pero sí afecta a la tasa de mutación, siendo más eficiente si se realiza 7 horas después de la FIV. Por otro lado, se comprobó que es posible generar embriones porcinos modificados genéticamente mediante lipofección de ovocitos con zona pelúcida intacta durante la FIV, con una concentración óptima de liposomas-RNP del 5 % v/v. No se encontraron diferencias significativas entre las lipofectaminas comerciales CRISPRMAXTM y 3000 en términos de tasa de mutación y desarrollo embrionario, aunque se determinó que el tiempo de co-incubación óptimo con la lipofectamina CRISPRMAXTM es de 8 horas en nuestras condiciones experimentales. Los resultados de esta tesis contribuyen significativamente al campo de la biotecnología reproductiva y la edición genética, con aplicaciones en los ámbitos biomédico y ganadero.
  • Thumbnail Image
    Publication
    Open Access
    Optimization of vitrification protocols for embryos and oocytes in the porcine species
    (Universidad de Murcia, 2024-11-25) González Plaza, Alejandro; Cuello Medina, Cristina; Martínez García, Emilio Arsenio; Escuela Internacional de Doctorado
    Objetivos: el objetivo principal de esta Tesis fue optimizar el protocolo de vitrificación de embriones porcinos mediante la modificación del sistema Cryotop (Cryotopm) para la vitrificación simultánea de un elevado número de embriones y ovocitos, y analizar su impacto en el transcriptoma embrionario. Para este fin, los objetivos específicos contenidos en esta Tesis fueron: 1) evaluar el sistema Cryotopm en su forma abierta y cerrada para la vitrificación de mórulas y blastocistos producidos in vivo, y su calidad tras el calentamiento; 2) investigar los efectos de la vitrificación simultánea de un elevado número de blastocistos sobre la expresión génica y el transcriptoma de microARNs (miARNs); 3) evaluar la viabilidad de blastocistos producidos in vitro tras la vitrificación con el sistema Cryotopm; 4) estudiar el impacto del tiempo de equilibrado con crioprotectores y la suplementación con melatonina en el medio de maduración in vitro en la viabilidad y calidad de los ovocitos vitrificados y calentados con el sistema Cryotopm. Metodología: En la metodología general incluida en esta Tesis se describen los procesos de obtención de embriones in vivo y de producción de embriones in vitro, la vitrificación y el calentamiento (V-C) de embriones y ovocitos y la evaluación de la viabilidad tras la V-C. La metodología específica del Artículo 1 describe técnicas de evaluación de la calidad de los embriones V-C. En la metodología de los Artículos 2 y 3 se describen los procesos de extracción de ARN de los blastocistos y preparación de las muestras para los estudios de expresión génica y de transcriptoma de miARNs, respectivamente. La metodología del Artículo 4 incluye la evaluación de la calidad de los embriones producidos in vitro tras la V-C. Por último, la metodología específica del Artículo 5 describe las técnicas empleadas para la evaluación de la viabilidad y la calidad de los ovocitos tras la V-C. En cada artículo se incluyen además los análisis estadísticos realizados, así como un breve diseño experimental. Conclusiones: Las principales conclusiones de esta Tesis Doctoral son: 1) El sistema Cryotopm abierto (CA) permite la vitrificación de 20 embriones porcinos obtenidos in vivo en los estadios de mórula, blastocisto temprano y blastocisto, proporcionando unos parámetros de viabilidad y calidad post-calentamiento similares a la de los embriones frescos; 2) La vitrificación con los sistemas CA y SOPS tiene un efecto moderado sobre la expresión génica de los blastocistos porcinos. En embriones vitrificados con el sistema CA, se modifica la expresión de más genes relacionados con la proliferación celular y se alteran menos genes relacionados con la apoptosis;3) La vitrificación con los sistemas CA y SOPS modifica la expresión de miARNs en los blastocistos porcinos, habiendo mínimas diferencias entre ambos sistemas, alterando la expresión de miARNs relacionados con la proliferación celular, la apoptosis y la respuesta celular al estrés; 4) La vitrificación simultánea de 20 blastocistos porcinos producidos in vitro con el sistema CA proporciona mejores resultados de viabilidad y parámetros de apoptosis que la vitrificación empleando el sistema SOPS; 5) La viabilidad de los ovocitos maduros de cerdo vitrificados con el sistema CA aumenta con el incremento del tiempo de equilibrado con los crioprotectores, alcanzando su máximo a los 60 minutos y presentando estos ovocitos una morfología de la placa metafásica similar a la de los ovocitos sin vitrificar; 6) La suplementación con 10-9 M de melatonina en el medio de maduración no tiene efecto en la viabilidad ni la morfología de la placa metafásica de los ovocitos maduros de cerdo vitrificados con el sistema CA.
  • Thumbnail Image
    Publication
    Open Access
    Role of the nitric oxide system in different reproductive processes
    (Universidad de Murcia, 2019-10-09) Staicu, Florentin-Daniel; Matas Parra, Carmen; Martínez Soto, Juan Carlos; Chavarro, Jorge; Escuela Internacional de Doctorado
    El óxido nítrico (NO) regula los procesos fisiológicos y patológicos en diferentes sistemas orgánicos, incluido el sistema vascular, nervioso y reproductor. Su síntesis tiene lugar a partir del precursor L-Arginina, gracias a la familia de enzimas Óxido Nítrico Sintasa (NOS). Esta familia se encuentra formada por dos enzimas constitutivas, la NOS endotelial y la neuronal (eNOS, nNOS), y una inducible (iNOS). Los principales objetivos de esta tesis fueron estudiar el efecto del NO sobre la capacitación espermática en dos especies diferentes y determinar si los niveles de NO en el líquido folicular (FF) pueden predecir los resultados clínicos de las Técnicas de Reproducción Asistida. Para ello, en primer lugar, se analizó cómo la adición de NO o la inhibición de su síntesis afectaba a la capacitación espermática y a la fecundación in vitro (FIV) en la especie porcina (Capítulo 1). Posteriormente, se estudió cómo la fosforilación de las proteínas es modulada por el NO, L-Arginina y el FF durante la capacitación en espermatozoides humanos (Capítulo 2). Finalmente, se determinaron los niveles de NO en el FF y su relacion con la calidad de los ovocitos en mujeres (Capítulo 3). En el primer capítulo se describió la localización de las tres isoformas de la NOS en espermatozoides mediante inmunocitoquimica. Tanto la eNOS como la nNOS se ubicaron en la región de la cabeza espermática, con una señal débil en la pieza principal y final de la cola. Sin embargo, la iNOS mostró una distribución más general. En relación a: motilidad, sustratos de fosfo-PKA, fosforilación en tirosina, reacción acrosomal, translocación de fosfatidilserina y concentración del calcio intracelular, se observó que eran modificados por la presencia o ausencia de NO. Para estos análisis se utilizó el donante de NO, S-Nitrosoglutatión (GSNO), y dos inhibidores de las NOS, NG-Nitro-L-Arginina Metil Éster (L-NAME) y Aminoguanidina (AG). A tiempo 0 la motilidad no se vio afectada por los tratamientos utilizados. Sin embargo, a los 30 minutos se observó que la velocidad rectilínea (VSL) y la velocidad media (VAP) disminuyen en presencia de AG. La inhibición de NOS disminuyó el grado de fosforilación de tres sustratos de la PKA (~ 75, ~ 55 y ~ 50 kDa) aunque fosforilación de tirosina no difirió entre los tratamientos. El inhibidor L-NAME hizo disminuir el porcentaje de espermatozoides reaccionados y la exteriorización de la fosfatidilserina. L-NAME y AG indujeron una disminución en la concentración intracelular de calcio. En segundo lugar, se evaluó el papel del NO sobre la interacción de gametos en presencia o ausencia de células del cumulus. Se observó que tanto la adición del L-NAME como del AG durante la FIV, producía un descenso en el porcentaje de ovocitos penetrados cuando éstos se encontraban rodeados por las células del cumulus. No obstante, al eliminar éstas células la penetración disminuyó aún más, llegando a ser nula en presencia del inhibidor L-NAME. En el Capítulo 2, se analizó el papel de la L-Arginina y del FF sobre la fosforilación en serina, treonina y tirosina en espermatozoides de hombres y si su efecto se veía modificado por la presencia de donante de NO o por los inhibidores de síntesis de NO. Se observó que cuatro bandas de proteínas de ~ 110, ~ 87, ~ 75 y ~ 62 kDa disminuían la intensidad de fosforilación en presencia de inhibidores de las NOS, tanto en presencia como en ausencia de L-Arginina o FF. Posteriormente se identificaron que proteínas eran las afectadas y se observó que 29 de ellas estaban relacionadas con diferentes procesos reproductivos: espermatogénesis, unión a la zona pelúcida, metabolismo energético, respuesta al estrés, la motilidad y estructura, y señalización y recambio de proteínas. En el estudio final (Capítulo 3), se determinó la relación entre el nivel de nitrito (NO2) y nitrato (NO3) en el FF de mujeres que participaron en un programa de donación de gametos y la calidad de sus ovocitos. Se observó que ni el número total de ovocitos recogidos ni el de ovocitos MII se asociaron con los niveles de NO2 y NO3 en el FF. Sin embargo, la proporción de ovocitos MII sí que se relacionó directamente con los niveles de NO2 e inversamente con los niveles de NO3. Los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral muestran la importancia del NO sobre los gametos y su interacción. En relación al espermatozoide porcino, se observó que la localización de las isoformas de la NOS es diferente y que la inhibición de la síntesis de NO disminuye los parámetros que participan en el proceso de capacitación y la penetración de ovocitos. En relación a los espermatozoides del hombre, se determinó que al inhibir la producción de NO se produce una disminución de la fosforilación de proteínas relacionadas con la función reproductiva y este efecto no se revierte por la presencia de L-Arginina o FF. Además, la síntesis de NO en el FF de mujeres donantes de ovocitos sometidas a tratamiento de superovulación, se relaciona con el porcentaje de ovocitos maduros, pero no con la cantidad total de ovocitos recuperados tras el tratamiento. Nitric oxide (NO) regulates both physiological and pathological processes in different organic systems, including the vascular, nervous, and reproductive system. Its synthesis takes place from a precursor, namely L-Arginine, thanks to the Nitric Oxide Synthase (NOS) family of enzymes. The latter includes two constitutive enzymes, the endothelial and the neuronal NOS (eNOS, nNOS), and one inducible isoform (iNOS). The main objectives of this thesis were to study the effect of NO on sperm capacitation in two different species and to determine whether or not the NO levels in the follicular fluid (FF) can predict the clinical outcomes from Assisted Reproduction Techniques. To do this, the first step was to analyze how the addition of NO or the inhibition of its synthesis affected sperm capacitation and in vitro fertilization (IVF) in the porcine species (Chapter 1). Subsequently, the modulation of protein phosphorylation by NO, L-Arginine and FF was investigated during human sperm capacitation (Chapter 2). Finally, the levels of NO in the FF were determined and their correlation with the quality of the oocytes in women was studied (Chapter 3). In the first chapter, the localization of the three NOS isoforms was described in spermatozoa by immunocytochemistry. Both eNOS and nNOS were located in the sperm head region, with a faint signal in the principal and end piece of the tail. On the other hand, iNOS showed a more general distribution. The following parameters: motility, phospho-PKA substrates, tyrosine phosphorylation, acrosome reaction, phosphatidylserine translocation and intracellular calcium concentration, were affected depending on the presence or absence of NO. For these assays, a NO donor, S-Nitrosoglutathione (GSNO), and two NOS inhibitors, NG-Nitro-L-Arginine Methyl Ester Hydrochloride (L-NAME) and Aminoguanidine Hemisulfate salt (AG), were used. At time 0, the used treatments did not affect motility patterns, however, after 30 minutes of incubation the straight-line (VSL) and average path velocity (VAP) decreased in the presence of AG. The inhibition of NOS lowered the phosphorylation degree of three PKA substrates (~ 75, ~ 55 and ~ 50 kDa), but tyrosine phosphorylation levels did not differ between the treatments. The inhibitor L-NAME decreased the percentage of acrosome-reacted sperm and phosphatidylserine translocation, whereas both L-NAME and AG reduced the sperm intracellular calcium concentration. Secondly, the role of NO on the interaction of gametes was evaluated in the presence or absence of cumulus cells. The addition of both L-NAME and AG during IVF induced a decrease in the percentage of penetrated oocytes, when the latter were surrounded by the cumulus cells. Nonetheless, when the cumulus cells were removed, the percentage of penetration was further diminished, becoming null in presence of the inhibitor L-NAME. In Chapter 2, the role of L-Arginine and FF was analyzed on the phosphorylation of serine, threonine and tyrosine residues in human spermatozoa and whether their effect was modified by the presence of a donor or inhibitors of NO synthesis. Four protein bands of ~ 110, ~ 87, ~ 75 and ~ 62 kDa showed a decrease in their phosphorylation degree when using NOS inhibitors, both in the presence or absence of L-Arginine and FF. Later, the affected proteins were identified, and it was observed that 29 of them were related to different reproductive processes: spermatogenesis, binding to the zona pellucida, energy and metabolism, stress response, motility and structural organization, signaling and protein turnover. In the final study (Chapter 3), the relationship between the FF levels of nitrite (NO2) and nitrate (NO3) in women participating in a gamete donation program and the quality of their oocytes was determined. Neither total nor MII oocyte yields were associated with the FF concentrations of NO2 and NO3. However, the proportion of MII oocytes was directly related to NO2 levels and inversely to NO3 levels. The results obtained in this doctoral thesis show the importance of NO on gametes and their interaction. In relation to porcine spermatozoa, it was observed that the localization of the NOS isoforms is different and that the inhibition of NO synthesis decreases the parameters involved in the capacitation process and the penetration of oocytes. As far as the human spermatozoa are concerned, the inhibition of NO synthesis leads to a decrease in the phosphorylation of proteins related to reproductive functions and, this effect is not reverted by the presence of L-Arginine or FF. In addition, the synthesis of NO in the FF of oocyte donors undergoing superovulation treatment is associated to the proportion of mature oocytes, but not to the total number of oocytes recovered after the treatment