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    Agricultural and environmental evaluation of biochar obtained by pyrolysis from different organic wastes
    (2016-10-28) López Cano, Inés; Sánchez Monedero, Miguel Ángel; Cayuela García, Mª Luz; Escuela Internacional de Doctorado
    El biochar es un material sólido obtenido a través de la conversión termoquímica de la materia orgánica (tales como madera, estiércol, hojas, etc.) en un ambiente ausente de oxígeno a temperaturas relativamente bajas (<700°C). El biochar presenta propiedades físico-químicas favorables para su uso en agricultura y, además, está ganando importancia en los últimos años como estrategia de mitigación del cambio climático. El objetivo global del presente trabajo de tesis consiste en estudiar la viabilidad de una serie de residuos orgánicos de origen agrícola y urbano para su transformación en biochar y evaluar su uso como enmienda de suelos y como aditivo del proceso de compostaje. Para ello, el trabajo experimental se ha dividido en tres fases: • Caracterización físico-química de un amplio rango de residuos orgánicos (madera de encina, residuos de invernadero, residuos de parques y jardines, la fracción celulósica resultante del tratamiento térmico de residuos sólidos urbanos (CellMatt), purines de cerdo, y un digerido parcialmente deshidratado de residuos sólidos urbanos) y de los biochars obtenidos a partir de los mismos mediante pirólisis lenta a 400°C y 600°C. • Evaluación agrícola y ambiental del uso de diversos biochars como enmienda de suelo, ya sean solos o en combinación con fertilizantes minerales y otras enmiendas orgánicas. Con el fin de entender el impacto del origen del biochar (composición lignocelulósica y contenido en cenizas) sobre las dinámicas de nutrientes del suelo, el destino de los metales pesados y el crecimiento de las plantas. • Evaluación del biochar como aditivo durante el proceso de compostaje del alperujo y estiércol de oveja a escala piloto durante 31 semanas con el fin de valorar su impacto en el proceso de compostaje (degradación de la materia orgánica, emisión de gases, ciclo del N), y sobre la calidad del compost final en términos de su valor nutricional. A grandes rasgos la caracterización físico-química mostró que la mayoría de los biochars presentan propiedades aceptables para su uso. Las características de los materiales de partida usados y la temperatura del proceso de pirólisis determinaron las propiedades físico-químicas. El incremento de la temperatura de pirólisis conllevó un aumento del contenido de cenizas, del C recalcitrante y mayores pérdidas de los grupos funcionales que contienen N y O. La evaluación agronómica de los biochars obtenidos a partir de residuos agrícolas y urbanos muestra que la incorporación de biochar está poco influida por el tipo y el origen del biochar, apenas teniendo impacto sobre los principales ciclos de nutrientes (C, N y P). Las principales diferencias entre los biochars son originadas, por el contenido relativamente alto de cenizas, en los biochar preparados a partir de residuos orgánicos pre-tratados, comparados con los obtenidos a partir de biomasa lignocelulósica. Finalmente, al incorporar los biochar al suelo durante los ensayos de incubación no se observan impactos negativos sobre las dinámicas de nutrientes, ni efectos fitotóxicos que afectan negativamente a las plantas ensayadas. Algunos biochar muestran necesidades menores de agua para mantener los niveles de humedad. Sin embargo, el uso agrícola de los biochars preparados a partir de residuos municipales pre-tratados, se puede ver limitado por la presencia de metales pesados. Por último, se ensaya el impacto de una pequeña cantidad de biochar (4%) sobre el proceso de compostaje a escala piloto de alperujo (el residuo sólido de la almazara de dos fases) mezclados con un 54% de estiércol de oveja durante 31 semanas. La incorporación de biochar incrementó el contenido de NO3--N, indicando una mayor actividad nitrificante, y reduciendo las pérdidas de N en un 15% sin afectar a la cantidad de N2O liberada. El uso de biochar como aditivo del proceso de compostaje mejorar el valor de los compost de alperujo reduciendo las pérdidas de N e incrementando su disponibilidad en materiales pobres en N. Biochar is produced by thermal decomposition of organic material (e.g. wood, manure or leaves) under limited supply of oxygen (O2), and at relatively low temperatures (<700°C). Biochar presents favourable physicochemical properties for its use in agriculture and has recently attracted attention as a climate change mitigation strategy. This thesis has a strong focus on developing a better understanding of the influence of the original waste used for pyrolysis on the biochar characteristics and its behaviour in soil. Also, the use of biochar as a composting additive was tested. The main objective of the present thesis was to explore the recycling in agriculture of a range of organic wastes of agricultural and urban origin through their transformation into biochar (by slow pyrolysis process) and to evaluate its use as soil amendment and as additive to the composting process. The experimental work has been structured in three stages: • To evaluate the physicochemical characteristics of a series of biochars obtained by pyrolysis from a wide range of organic wastes (oak, greenhouse waste, green waste, cellulosic fraction of MSW, pig manure and food digestate) and at different pyrolysis conditions (slow pyrolysis at 400°C and 600°C). • To perform an agricultural and environmental evaluation of the use of these biochars as soil amendment either alone or in combination with mineral fertilisers and other organic amendments. In order to understand the impact of the origin of the biochar (lignocellulosic composition and ash content) on soil nutrient dynamics, the fate of heavy metals and plant growth • To evaluate the effect of biochar as additive during composting of olive mill wastes and sheep manure in a pilot scale during 31 weeks, in order to assess its impact on the composting performance (organic matter degradation, gas emission, N cycling), and on the quality of the final compost in terms of its nutritional value. In broad terms, the physico-chemical characterization shows that most of biochars present suitable properties for its use. The physicochemical properties of biochars were driven by the characteristics of feedstocks and the pyrolysis temperature. The use of high temperatures increased the ash content and recalcitrant C and increased the losses of N and O containing functional groups. Agronomical and environmental evaluation of biochars from agricultural and urban organic wastes shows that the type and origin of feedstock only had a minor impact on most important nutrient cycles (C, N y P). The main differences among biochars were originated by the presence of relatively higher content of ash in biochars prepared from pre-treated organic wastes, compared to biochars from raw lignocellulosic biomass. Also, the tested biochars did not show any negative impacts on soil nutrient dynamics or phytotoxic effects on plant growth during the soil incubation experiments and pot trials. However, the agricultural use of the biochars prepared from feedstocks of urban origin can be only limited by the presence of heavy metals. Finally, in this thesis the impact of a small proportion of biochar (4% dry weight) was studied on the composting process of olive mill waste (two-phase olive mill waste) mixed with a 54% of sheep manure during 31 weeks. The incorporation of biochar improved N cycling by increasing NO3--N content, indicating a higher nitrifying activity, and reducing N losses by 15% without affecting the amount of N2O released. The use of biochar as an additive for composting could improve the value of olive mill waste composts by reducing N losses and increasing N availability in lignocellulosic and N-poor materials.
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    Aproximación proteómica y metabolómica de la producción de metabolitos secundarios en líneas celulares elicitadas de Solanum Lycopersicum
    (2014-06-05) Briceño de Lara, Zuleika Coromoto; Ferrer Ayala, Mª Ángeles; Calderón García, Antonio Asensio; Facultad de Biología
    El cultivar de tomate MT presenta una serie de características fenotípicas, como un corto ciclo biológico (inferior a 3 meses) y pequeño tamaño (menos de 20 cm), que hacen que sea más adecuado para estudios en laboratorio que otros cultivares de tomate. El objetivo general planteado al iniciar este trabajo fue determinar el comportamiento in vitro del cv. MT, así como llevar a cabo un estudio de los perfiles de metabolitos secundarios y de los patrones de expresión proteica en suspensiones celulares sometidas a la elicitación con MJ, en presencia y en ausencia de dos tipos de β-CDs: metiladas al azar (CDsM) o hidroxipropiladas al azar (CDsH). El fin último es explorar el potencial de las suspensiones celulares derivadas del cv. MT para utilizar este sistema en la producción de metabolitos con alto valor añadido. Para abordar este objetivo se han utilizado diversas técnicas de análisis cromatográfico (HPLC-MS y GC-MS), electroforético (SDS-PAGE e IEF), citológico (TTC y FDA) y espectrofotométrico (determinaciones de metabolitos y de diversas actividades enzimáticas); también se ha llevado a cabo la microsecuenciación de fragmentos peptídicos por nanoLC ESI MS/MS y se han utilizado las herramientas bioinformáticas correspondientes para el análisis de los resultados. Las suspensiones celulares presentaron una acumulación de compuestos fenólicos y triterpenos máxima durante la fase de crecimiento exponencial. La elicitación de las suspensiones celulares con MJ y CDsM o CDsH, separadamente o en combinación, dio lugar a un aumento de los niveles de isofucosterol, -sitosterol y taraxasterol, si bien los mayores cambios se registraron en los tratamientos con CDsM. Sin embargo, los mayores niveles de fenoles solubles totales se obtuvieron en los tratamientos combinados, sobre todo en el tratamiento CDsM+MJ. Además, ambos elicitores (CDs+MJ) actuaron de forma sinérgica en la producción de ácido cafeico en el medio intracelular, indicando que la naturaleza fisicoquímica de las CDs influyó en su capacidad para estimular la producción de metabolitos y para actuar como agentes secuestrantes. Por otra parte, en los tratamientos de elicitación se observó, en general, una diminución de las actividades enzimáticas peroxidasa, PAL, endoquitinasa y -1,3-glucanasa en presencia de CDsM y un aumento de dichas actividades enzimáticas en presencia de CDsH, en los tratamientos con MJ y, sobre todo, en los combinados (CDs+MJ), lo que indica que las CDs y el MJ son capaces de regular diferencialmente la actividad de estas enzimas. El análisis del proteoma extracelular de las suspensiones celulares mediante separación monodimensional en geles de poliacrilamida y microsecuenciación en las suspensiones elicitadas con CDsM+MJ permitió la identificación de diez fragmentos trípticos cuyas secuencias de aminoácidos mostraron homología con varías proteínas PR de S. lycopersicum, quitinasas, una proteína asociada a la muerte celular biótica y una peroxidasa catiónica. Estas proteínas podrían formar parte de las respuestas de defensa en suspensiones celulares de tomate MT. Además de las proteínas inducidas en el tratamiento de elicitación, se identificaron una serie de proteínas constitutivas, como proteínas PR del tipo PR-1 y PR-5, endoquitinasas, quitinasas, peroxidasas, una proteína inhibidora de endoglucanasas fúngicas específicas de xiloglucano (XEGIP) y otras enzimas hidrolíticas implicadas en la ruptura de xilanos y arabinoxilanos como la LeXYL2 y la α-L-Arabinofuranosidasa, que pueden estar implicadas en la modificación de la arquitectura de la pared celular durante el crecimiento del cultivo. ABSTRACT The tomato cultivar Micro-Tom displays several phenotypic characteristics such as small size (less than 20 cm) and a reduced life cycle (less than three months), which make it more suitable for laboratory experiments than standard cultivars. The overall objective proposed in this research is to know the in vitro behavior of Micro-Tom as well as analyzing the response of MT cell cultures to elicitation with methyl jasmonate (MJ) and two -cyclodextrins (randomly methylated -cyclodextrins, CDsM, and randomly hydroxypropyl -cyclodextrins, CDsH), alone or in combination, exploring the changes on both secondary metabolite and protein expression patterns that occur in these cell cultures in the presence of these elicitors. To address this objective, a variety of different techniques including: chromatographic (HPLC-MS and GC-MS), electrophoretic (SDS-PAGE and IEF), cytological (TTC and FDA) and spectrophotometric (for the determination of metabolites and enzymatic activities) methods were used. Moreover, tryptic fragments of SDS-PAGE bands of interest were analyzed by nanoLC ESI MS/MS and the LC-ESI-MS/MS spectra submitted to the database-mining tool for protein identification. An accumulation of both phenolic and triterpenoids compounds was seen during the exponential phase of non-elicited cell suspension cultures. Under elicitation conditions, an increase in the levels of isofucosterol, -sitosterol and taraxasterol was observed, although the highest levels of these compounds were found in CDsM-treated cells. In contrast, the highest levels of phenolic compounds were detected in the presence of both elicitors, especially in CDsM+MJ-treated cells. Moreover, both elicitors act synergistically to stimulate the production of caffeic acid in the intercellular medium, suggesting that the physicochemical properties of CDs have a great influence in their ability to induce the production of secondary metabolites and in their metabolite-sequestering properties. On the other hand, a decrease in the enzymatic activities of peroxidase, PAL, endochitinase and -1,3-glucanase was observed in CDsM-treated cells whereas an increase of these enzymatic activities occurred in the presence of CDsH, MJ, and in the combined treatments, indicating that both elicitors are able to differentially regulate the activity of these enzymes. Analysis of the extracellular proteome showed the presence of amino acid sequences homologous to several pathogenesis-related (PR) proteins, a cationic peroxidase, and a biotic cell death-associated protein, which suggests that MJ and CDs could play a role in mediating defense-related gene product expression in MT. Moreover, several constitutive proteins were also identified such as PR 1 and 5 proteins, endochitinases, chitinases, peroxidases, an inhibitor protein of xyloglucan-specific fungal endoglucanase (XEGIP), and other hydrolytic enzymes like LeXYL2 and L-arabinofuranosidase, which are cell wall-degrading enzymes involved in the breakdown of xylans and arabinoxylans, suggesting their involvement in the modification of the cell wall architecture during cell culture growth.
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    Estudio metabolómico y genómico de cultivos celulares de zanahoria
    (2018-01-09) Miras Moreno, María Begoña; Pedreño García, María Ángeles; Almagro Romero, Lorena; Sabater Jara, Ana Belén; Facultad de Biología
    El objetivo principal de este trabajo de investigación fue caracterizar los metabolitos secundarios producidos en dos líneas celulares de zanahoria. Para ello, uno de los objetivos concretos fue la caracterización de la producción de compuestos de naturaleza isoprenoide y compuestos fenólicos en suspensiones celulares de una línea celular verde de Dacus carota en condiciones control y en condiciones de elicitación con ciclodextrinas, jasmonato de metilo, hexenol y β-glucano separadamente o en combinación. De la misma manera, se caracterizó la producción de isoprenoides y compuestos fenólicos en suspensiones celulares de una línea celular naranja de D. carota en condiciones control y en condiciones de elicitación con ciclodextrinas y jasmonato de metilo. Asimismo, se estudio la producción de fitosteroles y carotenoides y la expresión de genes implicados en su ruta biosintética en suspensiones celulares de una línea celular naranja de D. carota en presencia de inhibidores de la ruta de biosíntesis de carotenoides y fitosteroles. Los resultados derivados de este estudio muestran que la línea celular de zanahoria verde biosintetizó de manera constitutiva los siguientes isoprenoides: carotenoides, α-tocoferol, clorofilas a y b y fitosteroles. El principal isoprenoide encontrado en la línea verde fue la luteína, una xantofila amarilla. La caracterización de la línea celular de zanahoria verde mostró que los fitoesteroles y compuestos fenólicos se acumularon principalmente en el medio extracelular (15100 μg/L y 477,5 μg/L, respectivamente) en presencia de ciclodextrinas. A diferencia de los compuestos mencionados anteriormente, el β-caroteno (1138,1 μg/L), la luteína (25949,5 μg/L), el α-tocoferol (8063,8 μg/L) y la clorofila a (1625,1 μg/L) y b (9958,3 μg/L) se acumularon principalmente dentro de las células. Por lo tanto, los ciclodextrinas fueron capaces de inducir la ruta biosintética del mevalonato, aumentando la biosíntesis de fitoesteroles y compuestos fenólicos, y acumulándolos fuera de las células. Sin embargo, en ausencia de ciclodextrinas, las células de la zanahoria acumularon principalmente carotenoides a través de la ruta biosintética del 4-fosfato de metileritritol. Por lo tanto, el uso de ciclodextrinas permitiría la acumulación extracelular de fitoesteroles y compuestos fenólicos incrementando el flujo de carbono hacia la ruta citosólica del mevalonato y hacia la ruta de biosíntesis fenilpropanoide. Además, β-glucano fue capaz de inducir la acumulación intracelular de α-tocoferol en la línea de células de zanahoria verde. Por otro lado, la línea celular de zanahoria naranja biosintetizó de manera constitutiva carotenoides y fitoesteroles. Los principales isoprenoides acumulados en esta línea celular fueron β-caroteno y luteína. El análisis de esta línea naranja en condiciones de elicitación (50 mM ciclodextrinas) mostró que los fitoesteroles se acumulaban principalmente en el medio extracelular. Sin embargo, el β-caroteno y la luteína se acumularon esencialmente dentro de las células. El tratamiento combinado de ciclodextrinas y jasmonato de metilo mejoró la acumulación extracelular de compuestos fenólicos. Por lo tanto, la línea celular de zanahoria naranja bajo condición de elicitación proporciona un sistema biotecnológico eficiente para producir compuestos bioactivos. La adición de Terbinafina y Diflufenican que inhiben las rutas biosintéticas de fitoesteroles y carotenoides respectivamente, provocó una alta acumulación de escualeno y fitoeno. Estos compuestos bioactivos no suelen acumularse y, debido a esto, la línea celular de zanahoria naranja tratada con estos inhibidores es una fuente alternativa para producirlos. Los niveles de expresión más altos del gen escualeno sintasa se encontraron después de 24h de tratamiento con el inhibidor terbinafina. Esto puede explicar la alta acumulación intracelular de escualeno sin efecto negativo sobre los niveles de fitosteroles. Además, las ciclodextrinas no aumentaron los niveles de expresión de escualeno sintasa. Este hecho puso de manifiesto que los ciclodextrinas no funcionan como moléculas inductoras en la biosíntesis de los fitoesteroles, sino que son capaces de extraerlos de las membranas celulares. Por último, los niveles de expresión del gen fitoeno desaturasa 1 sugirieron que la acumulación del contenido total de carotenoides podría estar vinculada a la expresión de este gen. Sin embargo, el tratamiento con diflufenican disminuyó los niveles de expresión de fitoeno sintasa 1 y fitoeno desaturasa, lo que sugiere que la alta acumulación de fitoeno no se correlacionó con un alto nivel de expresión de estos genes. The main objective was to characterize secondary metabolites produced in two carrot cell lines. Thus, one of the specific objectives was to characterize the production of isoprenoid and phenolic compounds in cell suspensions of a Daucus carota green cell line under control conditions and under elicitation conditions with cyclodextrins, methyl jasmonate, Hexenol and β-glucan separately or in combination. Moreover, the production of isoprenoids and phenolic compounds was characterized in cell suspensions of orange D. carota cell line under control conditions and under conditions of elicitation with cyclodextrins and methyl jasmonate. It was also studied the production of phytosterols and carotenoids and the expression of genes involved in their biosynthetic pathway in cell suspensions of orange D. carota cell line in the presence of inhibitors of the biosynthesis pathway of carotenoids and phytosterols. The results derived from this study refer to the green carrot cell line constitutively biosynthesized the following isoprenoids: carotenoids, α-tocopherol, chlorophyll a and b, and phytosterols. The main isoprenoid found in this green carrot line was lutein, a yellow xanthophyll. The characterization of the green carrot cell line showed that phytosterols and phenolic compounds wew mainly accumulated in the extracellular medium (15100 μg/L and 477.5 μg/L, respectively) in the presence of cyclodextrins. Unlike the aforementioned compounds, β-carotene (1138.1 μg/L), lutein (25949.5 μg/L), α-tocopherol (8063.8 μg/L) and chlorophyll 1625.1 μg/L) and b (9958.3 μg / L) were mainly accumulated within the cells. Therefore, cyclodextrins were able to induce the biosynthetic pathway of mevalonate, increasing the biosynthesis of phytosterols and phenolic compounds, and accumulating them outside the cells. However, in the absence of cyclodextrins, carrot cells mainly accumulated carotenoids through the methylerythritol 4-phosphate biosynthetic pathway. Therefore, the use of cyclodextrins would allow the extracellular accumulation of phytosterols and phenolic compounds by increasing the flow of carbon towards the mevalonate cytosolic pathway and towards the phenylpropanoid pathway. In addition, β-glucan was able to induce the intracellular accumulation of α-tocopherol in the green carrot cell line. On the other hand, the orange carrot cell line constitutively biosynthesized carotenoids and phytosterols. The major isoprenoids accumulated in this cell line were β-carotene and lutein. Analysis of this orange line under elicitation conditions (50 mM cyclodextrins) showed that phytosterols accumulated mainly in the extracellular medium. However, β-carotene and lutein were essentially accumulated within the cells. Combined treatment of cyclodextrins and methyl jasmonate improved the extracellular accumulation of phenolic compounds. Therefore, the orange carrot cell line under elicitation condition provides an efficient biotechnological system to produce bioactive compounds. The addition of Terbinafine and diflufenican, which inhibited the biosynthetic pathways of phytosterols and carotenoids respectively, caused a high accumulation of squalene and phytoene. These bioactive compounds are not usually accumulated and, because of this, the orange carrot cell line treated with these inhibitors is an alternative source to produce them. The highest expression levels of the square gene were found after 24h of treatment with the inhibitor terbinafine. This fact may explain the high intracellular accumulation of squalene with no negative effect on phytosterol levels. In addition, the cyclodextrins did not increase the expression levels of squalene synthase. This fact revealed that cyclodextrins do not function as induction molecules in the biosynthesis of phytosterols, but are capable of extracting them from cell membranes. Finally, gene expression levels of squalene synthase suggest that the accumulation of total carotene content could be linked to the expression of this gene. However, treatment with diflufenican decreased expression levels of phytoene synthase 1 and phytoene desaturase, suggesting that high phytoene accumulation did not correlate with a high level of expression of these genes.
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    Interacción del biochar con las dinámicas de N involucradas en la formación y emisión de óxido nitroso en agricultura
    (2016-06-06) Sánchez García, María; Cayuela García, Mª Luz; Sánchez Monedero, Miguel Ángel; Escuela Internacional de Doctorado
    El potencial de calentamiento global del óxido nitroso es unas 300 veces superior a una masa equivalente de dióxido de carbono, por lo que la reducción de sus emisiones representa un importante papel en la lucha contra el cambio climático. El objetivo del presente trabajo de tesis consiste en alcanzar una mejor comprensión sobre cómo el biochar influye en las dinámicas del N implicadas en la formación y emisión de N2O a partir de dos importantes fuentes agrícolas: los suelos y el reciclaje de residuos orgánicos a través del compostaje. Con este propósito, el trabajo experimental se ha estructurado del siguiente modo: - Experimentos de suelo bajo condiciones de laboratorio con medidas de gases conteniendo nitrógeno marcado 15N e inhibidores de la nitrificación con el objetivo de identificar los principales mecanismos responsables de la formación de N2O en distintos suelos y cómo el biochar influye sobre los mismos. - Experimento de campo de dos años de duración en un suelo bajo cultivo ecológico de olivos en el que se estudió su respuesta a tres enmiendas diferentes: biochar, compost y una mezcla compost/biochar. Durante este tiempo se monitorizaron las emisiones de N2O, el almacenamiento de C en el suelo, la disponibilidad de C y N y la actividad microbiana relacionada con el ciclo del N. También se evaluó el estado nutricional de los olivos. - Experimento a escala real del compostaje de gallinaza en el que se evaluó el impacto de una pequeña adición de biochar en el desarrollo del proceso, la liberación de gases y la calidad del compost obtenido. Los resultados de los experimentos de laboratorio demostraron que en distintos tipos de suelos bajo las mismas condiciones de laboratorio pueden predominar distintos mecanismos de formación y emisión de N2O. Además, la adición de biochar puede reducir o aumentar dichas emisiones según cuál sea el mecanismo responsable de las mismas. La adición de biochar mitigó las emisiones cuando procedían de mecanismos de desnitrificación. Sin embargo, el biochar favoreció el mecanismo conocido como nitrifier-denitrification y en consecuencia las emisiones asociadas a este mecanismo. El experimento de campo se realizó en una explotación ecológica de olivos con riego deficitario bajo un clima mediterráneo semiárido. Durante dos años se monitorizaron las emisiones de N2O tras realizar una enmienda de compost, de biochar y de una combinación de ambos (compost+biochar). Los suelos enmendados con la combinación de compost y biochar registraron los niveles más altos de actividad enzimática desnitrificante (en inglés: Denitrifying Enzyme Activity, DEA) así como un incremento en el número de copias del gen amoA (gen estructural de la enzima amonio monooxigenasa, implicada en el primer paso de la nitrificación). Las emisiones de N2O no se vieron afectadas de forma significativa por las distintas enmiendas, que en general fueron muy bajas. En estas condiciones, en las cuales la desnitrificación no es el mecanismo predominante, el biochar o las enmiendas que contienen biochar no tuvieron el efecto de mitigación de las emisiones que habitualmente se observa en otros suelos. Finalmente, se evaluó el compostaje a escala piloto de una mezcla de gallinaza y paja de cebada y se monitorizó todo el proceso con y sin adición de biochar. Aunque no de modo significativo, en las pilas con biochar se registraron flujos de óxido nitroso más elevados coincidiendo con las fases mesofílica y de maduración, lo que probablemente estuvo relacionado con procesos de nitrificación. La adición de biochar no tuvo un efecto distintivo en las pérdidas de N ni en el contenido en macro y micronutrientes, siendo los parámetros de calidad similares en los dos tipos de composts. No obstante, se estimó que la adición de un 3% de biochar redujo un 20% el tiempo de compostaje, con el consiguiente ahorro de los costes de producción. Nitrous oxide (N2O) global warming potential is about 300 times greater than the equivalent mass of carbon dioxide. Thus, the reduction of N2O emissions plays an important role concerning climate change mitigation. The aim of this dissertation is to improve our understanding of biochar effect on N dynamics involved in the formation and emission of N2O from two important agricultural sources: soils and the recycling of organic wastes through composting. With this objective, the experimental work has been structured as follows: - Soil experiments in laboratory conditions with gas measurements containing marked nitrogen 15N and nitrification inhibitors with the purpose of identifying the main pathways leading to N2O formation in contrasting soils and how biochar influences different mechanisms. - Two-year field experiment in a semi-arid calcareous soil cultivated with olive trees organically managed studying the response of three different amendments: biochar, compost and a mixture compost/biochar. During this experiment, the impact of the three amendments on N2O release, soil C accrual, C and N availability and microbial activity related to the N cycle were monitored. The nutritional status of the olive trees was also assessed. - Full scale experiment of poultry manure composting in order to address the impact of a low quantity of biochar addition on the process performance, gaseous release and the quality of the end product. The results of laboratory experiments demonstrated that different mechanisms of N2O formation and emission can prevail in different soils under the same environmental conditions. Moreover, biochar addition can decrease or increase these emissions depending on the mechanism involved. Biochar addition reduced N2O emissions when proceeding from denitrification. However, biochar promoted the mechanism known as nitrifier-denitrification and the consequent emissions associated to this mechanism. The field experiment was developed in an agricultural organic olive orchard with deficit irrigation under semi-arid Mediterranean conditions. During two years N2O emissions were monitored after compost, biochar and a mixture of both (compost+biochar) amendment. The soils amended with the mixture reached the highest levels of denitrifying enzyme activity (DEA) as well as an increase of the number of copies of the AmoA gene (structural gene encoding the enzyme ammonia monooxigenase, involved in the first step of nitrification). N2O emissions were not significantly affected by different amendments, which were generally very low. In these conditions, where denitrification is not the prevailing mechanism, biochar or amendments containing biochar did not mitigate N2O emissions as it is usually observed in other soils. Finally, a pilot scale composting process of a mixture of poultry manure and barley straw was evaluated. The whole process was monitored with and without biochar addition. Although not significant, biochar treated piles registered higher N2O fluxes during the mesophilic and maturation phases, which was probably related to nitrification processes. Biochar addition did not affect N losses nor the concentration of macro and micronutrients, being quality parameters similar in both types of composts. However, it was estimated that the 3% addition of biochar reduced the required time for the composting process a 20%, with the consequent alleviation of the production costs.
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    Metabolómica de aceites esenciales de mejoranas, romeros y salvias con aplicaciones biotecnológicas
    (Universidad de Murcia, 2018-01-15) Cutillas Gomariz, Ana Belén; Tudela Serrano, José; Tomás Martínez, Virginia; Facultades, Departamentos, Servicios y Escuelas::Facultades de la UMU::Facultad de Biología
    Los aceites esenciales (AEs) han sido utilizados desde tiempos remotos por sus propiedades aromáticas y medicinales. En la actualidad, el interés por conocer y mejorar la aplicabilidad de los AEs en diferentes industrias está en aumento. Este estudio muestra la composición detallada de los AEs obtenidos a partir de cuatro especies de la famila Lamiaceae: Thymus mastichina L., R. officinalis L., Salvia lavandulifolia VAHL and S. officinalis L. Además, las actividades antimicrobianas de estos AEs fueron comparadas con las de los AEs de Thymus zygis Loefl. ex L. y Thymus hyemalis LANGE. Todas las plantas fueron cultivadas en la Región de Murcia y sus AEs obtenidos mediante hidrodestilación. Además, se determinó la actividad antimicrobiana de cuatro AEs durante la elaboración y el almacenamiento de mezclas de frutas y verduras. La composición de cada AE fue determinada mediante cromatografía de gases acoplada a un espectrómetro de masas. Los resultados fueron expresados en concentraciones relativas y absolutas. Los principales compuestos identificados en los AEs fueron: α-pineno, β-pineno, 1,8-cineol, linalol y α-terpineol en AEs de T. mastichina; α-pineno, canfeno, 1,8-cineol y alcanfor en AEs de R. officinalis; α-pineno, canfeno, 1,8-cineol y alcanfor en AEs de S. lavandulifolia; 1,8-cineol, α-tuyona, β-tuyona y alcanfor en los AEs de S. officinalis. Mediante la cromatografía de gases enantioselectiva, las proporciones enantioméricas de las principales biomoléculas quirales de los AEs fueron analizadas. Algunos enantiómeros se encontraron en altas concentraciones en todos los AEs: (-)-canfeno, (+)-hidrato de sabineno, (+)-terpinen-4-ol, (-)-linanol, (+)-acetato de α-terpinilo y (-)-β-cariofileno. Sin embargo, las distribuciones enantioméricas de otros componentes fueron diferentes dependiendo del AE. Estas propiedades son útiles para determinar la autenticidad y el origen de los AEs. Los AEs mostraron actividades antioxidantes similares con todos los métodos usados. Los AEs de T. mastichina fueron los más activos en los métodos ORAC y TBARS. La actividad contra el radical libre DPPH fue similar en todos los AEs analizados. Los AEs de romero fueron, en general, los más activos en el método ABTS, aunque el AESo-1 y el AETm-1 mostraron capacidades antioxidantes superiores a las del resto de AEs. Sólo los AEs de Salvia mostraron capacidad reductora. Los AEs de R. officinalis y S. lavandulifolia mostraron capacidades quelatantes ligeramente superiores que el resto. Las capacidades de los AEs para inhibir las actividades enzimáticas de lipoxigenasa (LOX) y acetilcolinesterasa (AChE) fueron determinadas, ya que estas enzimas están relacionadas con varias enfermedades, procesos inflamatorios y neurotransmisión. Todos los AEs fueron capaces de inhibir la actividad LOX, debido sobre todo a la presencia de acetato de bornilo, limoneno y linalol. La enzima AChE fue también inhibida por los AEs estudiados en esta Tesis Doctoral, ya que contienen alta concentración de 1,8-cineol. En cuanto a la actividad antimicrobiana, P. aeruginosa fue el microorganismo más resistente y S. aureus y C. albicans los más sensibles. Los AEs de T. zygis mostraron la mayor actividad antimicrobiana. Entre las biomoléculas, α-Pineno, p-cimeno, limoneno, linalol, borneol, timol y carvacrol mostraron capacidad antimicrobiana. Además, la adición de AEs de Citrus medica, Mentha piperita, Salvia officinalis y Thymus zygis durante el lavado de frutas y verduras, fue útil para la conservación de tres de las cinco formulaciones probadas, sin cambiar las condiciones organolépticas del producto final. Estos resultados pueden utilizarse como punto de partida para futuras investigaciones sobre la aplicación de AEs en industrias alimentarias. Los estudios llevados a cabo durante esta Tesis Doctoral determinan que los AEs obtenidos a partir de plantas cultivadas en la Región de Murcia podrían ser utilizados como antioxidantes naturales, inhibidores de enzimas y antimicrobianos en industrias alimentarias, cosméticas y farmacéuticas.   Essential oils (EOs) have been used since ancient times because of their aromatic and medicinal properties. Nowadays, the interest in knowing and improving the applicability of EOs in many industries is increasing. The current study shows the detailed compositions and bioactivities of EOs obtained from four Lamiaceae species: Thymus mastichina L., R. officinalis L., Salvia lavandulifolia VAHL and S. officinalis L. In addition, the antimicrobial activities of these EOs were compared to that from Thymus zygis Loefl. ex L. and Thymus hyemalis LANGE EOs. All plants were cultivated in the Region of Murcia and their EOs were obtained by hydrodistillation. Moreover, the antimicrobial activity of four EOs was tested during the processing and storage of fruits and vegetables mixtures. The composition of each EO was determined by gas chromatography coupled with mass spectrometry. The results were expressed in relative and absolute concentrations. Main compounds identified in the EOs were: α-pinene, β-pinene, 1,8-cineole, linalool and α-terpineol in the EOs from T. mastichina; α-pinene, camphene, 1,8-cineole and camphor in the EOs from R. officinalis; α-pinene, camphene, 1,8-cineole and camphor in the EOs from S. lavandulifolia; 1,8-cineole, α-thujone, β-thujone and camphor in the EOs from S. officinalis. Using enantioselective gas chromatography, the enantiomeric ratios of main chiral biomolecules of the EOs were analyzed. Some enantiomers were the most abundant in all EOs: (-)-camphene, (+)-sabinene hydrate, (+)-terpinen-4-ol, (-)-linanool, (+)-terpinyl acetate and (-)-β-caryophyllene. However, the enantiomeric distributions of other compounds were different depending on the EO. These properties are useful to determine the authenticity and origin of EOs. The EOs revealed similar antioxidant capacities with all methods used. EOs from T. mastichina were the most active in ORAC and TBARS methods. The activity against DPPH radical was similar in all the EOs analyzed. In general, the EOs from rosemary were the most active in the ABTS method, although AESo-1 and AETm-1 had higher antioxidant capacities than the other EOs. Only the EOs from Salvia showed reducing capacity. The EOs from R. officinalis and S. lavandulifolia presented slightly higher chelating activity than the other EOs. The capacities of EOs to inhibit the lipoxygenase (LOX) and acetylcholinesterase (AChE) activities were assayed, because these enzymes are related to several illnesses, inflammatory process and neurotransmission. All EOs were able to inhibit LOX activity, mainly due to the presence of bornyl acetate, limonene and linalool. AChE activity was also inhibited by the EOs investigated in this PhD Thesis, because they contained high concentration of 1,8-cineole. Regards to the antimicrobial activity, P. aeruginosa was the most resistant microorganism and S. aureus and C. albicans were the most sensitive ones. The EOs from T. zygis showed the highest antimicrobial activities. α-Pinene, p-cymene, limonene, linalool, borneol, thymol and carvacrol were compounds with antimicrobial activity. Moreover, the addition of EOs from Citrus medica, Mentha piperita, Salvia officinalis and Thymus zygis during washing of fruits and vegetables, was useful for the conservation of three of five formulations, without changing the organoleptic properties. These results can serve as a starting point for future research about the applicability of EOs in food industries. The studies carried out in this PhD Thesis make it possible to establish that EOs from plants grown in Murcia (S.E. Spain) have potential applicability as natural antioxidants, enzyme inhibitors and antimicrobials in food, cosmetic and pharmaceutical industries.