Análisis molecular de dípteros necrófagos de la Península Ibérica

Abstract

Esta tesis está enfocada a la identificación de dípteros con interés forense en la península Ibérica mediante técnicas de barcoding, otras técnicas moleculares y técnicas de morfometría geométrica. La identificación de los especímenes es un paso esencial en los estudios de entomología forense. Esta identificación sería utilizada en el cálculo del intervalo post mortem (PMI), pero con una identificación errónea el resultado de este cálculo no podría utilizarse en un proceso judicial. En ocasiones, el estado en el que se encuentran las muestras en el escenario de un crimen imposibilita su identificación por técnicas morfológicas. Por ello, las técnicas moleculares se han convertido en una herramienta esencial en este tipo de estudios. Para desarrollar los capítulos de esta tesis hemos realizado extracciones de ADN de múltiples ejemplares de dípteros con interés forense recolectados en España y Portugal entre los años 2012 y 2015. Se realizó la secuenciación de los genes mitocondriales COI (para el análisis de barcoding) y 16S, y del gen nuclear ITS2. Se realizaron identificaciones moleculares comparando las secuencias con las secuencias presentes en las bases de datos GenBank y BOLD a través de las herramientas BLAST y BIN respectivamente. Las relaciones entre las especies identificadas se analizaron mediante árboles filogenéticos de Neighbor-Joining y mediante redes de haplotipos. Además, se aplicaron métodos de reconstrucción de estados ancestrales para especies de amplia distribución. Estos análisis se aplicaron: a un amplio rango de especies para conocer la diversidad de especies de dípteros de la península Ibérica (capítulo I); a la familia Sarcophagidae de especial dificultad en su identificación morfológica (capítulo II); a la especie Calliphora vicina de amplia distribución para conocer la relación entre sus poblaciones y su historia evolutiva (capítulo III); y a las especies Lucilia ampullacea, Lucilia caesar y Lucilia illustris, consideradas especies hermanas con dificultades para su identificación morfológica en muestras mal conservadas (capítulo IV). Además, en este último capítulo, se utilizaron técnicas de morfometría geométrica para analizar las alas y las cabezas de los especímenes de estas especies. Se investigó si estás técnicas son útiles para la identificación de especies y la diferenciación de las poblaciones en las que fueron recolectadas. La información producida en esta tesis aumenta y mejora nuestro conocimiento sobre los dípteros con interés forense en la península Ibérica. Durante la realización de esta tesis se han producido un total de 1398 nuevas secuencias (669 de COI, 206 de 16S y 523 de ITS2). Se ha creado un proyecto en la base de datos BOLD, llamado “Barcoding of Iberian Diptera”, que será de gran utilidad en futuros trabajos. Se ha corroborado la utilidad de las herramientas moleculares, en especial las de barcoding, para la identificación de especies. Esto incluye algunos cambios de nombre debidos a erróneas identificaciones morfológicas previas, así como la identificación de dípteros recolectados por la policía científica de Alicante en casos forense. Además, el análisis filogeográfico mostró que las muestras de casos forenses de Alcoy presentan haplotipos locales. El análisis de la especie C. vicina reveló que no existe estructura biogeográfica para ninguno de los genes analizados, confirmando que las barreras geográficas no son suficientes para detener el flujo génico. La reconstrucción de los estados ancestrales de esta especie mostró colonizaciones seriadas entre las poblaciones, posiblemente ligadas a la actividad humana. Las especies L. ampullacea, L. caesa y L. illustris se identificaron mediante técnicas moleculares y mediante morfometría geométrica del ala y la cabeza. Ambas estructuras morfológicas se analizaron agrupando los datos por poblaciones y revelaron ser capaces de identificar la procedencia de las muestras con estos análisis. This thesis is focused on the identification of Diptera with forensic interest in the Iberian Peninsula through barcoding techniques, other molecular techniques and geometric morphometric techniques. The identification of specimens is an essential step in forensic entomology studies. This identification would be used in the calculation of the post mortem interval (PMI), but with a wrong identification the result of this calculation could not be used in a judicial process. Sometimes, the state in which the samples are in the scene of a crime makes impossible to identify them by morphological techniques. Therefore, molecular techniques have become an essential tool in this type of studies. To develop the chapters of this thesis, we performed DNA extractions of multiple dipterous specimens with forensic interest collected in Spain and Portugal between 2012 and 2015. We sequenced the mitochondrial genes COI (for the analysis of barcoding) and 16S, and of the nuclear gene ITS2. Molecular identifications were performed comparing the sequences with the sequences present in the GenBank and BOLD databases through the BLAST and BIN tools respectively. The relationships among the identified species were analyzed by Neighbor-Joining phylogenetic trees and by haplotype networks. In addition, reconstruction of ancestral states methods for widely distributed species were applied. These analyzes were applied: to a wide range of species to know the diversity of Diptera species of the Iberian Peninsula (chapter I); to the family Sarcophagidae of special difficulty in its morphological identification (chapter II); to the Calliphora vicina species of wide distribution to know the relationship between its populations and its evolutionary history (chapter III); and to the species Lucilia ampullacea, Lucilia caesar and Lucilia illustris, considered sister species with difficulties for their morphological identification in poorly conserved samples (chapter IV). In addition, in this last chapter, geometric morphometric techniques were used to analyze the wings and heads of the specimens of these species. It was investigated if these techniques are useful for the identification of species and the differentiation of the populations in which they were collected. The information produced in this thesis increases and improves our knowledge about Diptera with forensic interest in the Iberian Peninsula. During the performing of this thesis, a total of 1398 new sequences were produced (669 of COI, 206 of 16S and 523 of ITS2). A project has been created in the BOLD database, called "Barcoding of Iberian Diptera", which will be very useful in future work. The usefulness of molecular tools, especially those of barcoding, for the identification of species has been corroborated. This includes some rename specimens due to erroneous previous morphological identifications, as well as the identification of Diptera collected by the scientific police of Alicante in forensic cases. In addition, the phylogeographic analysis showed that samples of forensic cases from Alcoy have local haplotypes. The analysis of the species C. vicina revealed that there is no biogeographic structure for any of the genes analyzed, confirming that geographic barriers are not enough to stop gene flow. The reconstruction of the ancestral states of this species showed serial colonizations among the populations, possibly linked to human activity. The species L. ampullacea, L. caesa and L. illustris were identified by molecular techniques and geometric morphometric techniques of wing and head. Both morphological structures were analyzed grouping the data by populations and revealed to be able to identify the provenance of the samples with these analyzes.