Aplicaciones traslacionales en neoplasias mieloides de la secuenciación de nueva generación de ARN : nuevas dianas letalidad sintética e inmunoterapia

Abstract

Antecedentes: Los avances terapéuticos y en la supervivencia en neoplasias linfoides durante las dos últimas décadas no se han reproducido en el entorno de las enfermedades malignas mieloides, en las que existe una necesidad urgente de nuevas dianas terapéuticas. A pesar de la ausencia de mutaciones en los genes de la maquinaria de reparación del ADN en neoplasias mieloides, la llegada de la secuenciación de nueva generación y los descubrimientos de defectos epigenéticos y del espliceosoma en leucemia mielomonocítica crónica (LMMC) nos impulsó, en el primer capítulo de este trabajo, a revisar el papel patogénico de los genes implicados en la respuesta a las lesiones en el ADN. En el segundo capítulo, nos centramos en los antígenos testiculares tumorales (ATTs), un grupo de moléculas cuya expresión se silencia por hipermetilación en las células somáticas de individuos sanos. Sin embargo, las células tumorales re-expresan algunos de estos ATTs, de manera específica para cada tumor, con propiedades inmunogénicas. Incluso cuando se re-expresan, estas moléculas muestras niveles bajos de transcritos, y el uso del RNA-seq global puede no ser lo suficientemente sensible para caracterizarlos. Para este tipo de estudios, el RNA-seq dirigido ha demostrado ser más preciso.

Objetivos: Aprovechar los avances en los experimentos de RNA-seq para identificar nuevas moléculas que puedan ser dianas en LMMC y enfermedades relacionadas, centrándonos en la estrategia de la letalidad sintética para los genes de la reparación del ADN, y en los cambios de expresión génica de los ATTs tras tratamiento con azacitidina para dianas de inmunoterapia.

Métodos: Estudiamos la desregulación de los genes de reparación de ADN mediante RNA-seq global en médula ósea de 27 pacientes de LMMC y 9 controles (cohorte de descubrimiento). Validamos los candidatos diferencialmente expresados en la fracción CD34+ de médula ósea de pacientes con LMMC, y en una cohorte independiente de 74 LMMC, caracterizadas a nivel mutacional por secuenciación dirigida de ADN. En segundo lugar, diseñamos un panel dirigido a 210 ATTs para estudiarlos por RNA-seq al diagnóstico y tras un ciclo de azacitidina en 19 pacientes, validando a nivel proteico el comportamiento de nuestros principales candidatos y comparando los resultados con RNA-seq global procedente de 11 pacientes al diagnóstico y tras tratamiento

Resultados: Encontramos una infra-expresión de BAP1 y PARP1 específica de LMMC comparada con otras enfermedades relacionadas. Los casos con mutaciones en reguladores de la cromatina mostraron los niveles más bajos de BAP1. Validamos una sobre-expresión significativa de dos genes clave en mantener la fidelidad de la reparación de roturas de doble cadena, CDKN1A y ERCC1, independiente de la metilación del promotor y asociado a quimioresistencia. Además, los pacientes portadores de mutaciones en el componente del espliceosoma SRSF2, presentaban numerosos eventos de splicing aberrante en los genes de reparación de ADN, más frecuentes en los genes de la vía de reparación de cadena única. Por otra parte, realizamos RNA-seq dirigido a 210 ATTs en muestras antes y después del primer ciclo de azacitidina (día +28) en 19 pacientes con SMD (n=13) y LMMC (n=6). Encontramos que 137 de los 210 ATTs mostraban una expresión significativa (CPM>1) al diagnóstico. Algunos de los ATTs que no se expresaban antes del tratamiento mostraron una re-expresión significativa tras azacitidina; destacando ADAM29 dentro de estos ATTs expresados de novo tras tratamiento hipometilante. Además, TFDP3 y DDX53, ambos en el cromosoma X, emergen como candidatos principales a dianas terapéuticas al cumplir dos condiciones: i) aumento significativo de la expresión tras un ciclo de azacitidina en aquellos pacientes que alcanzaron respuesta completa tras 4 o 6 ciclos, y ii) dinámica paralela a nivel proteico. Con lo disponibilidad de datos del transcriptoma completo de 11 de estos pacientes antes y después de un ciclo de azacitidina, comparamos los datos de ambas técnicas. Identificamos 203 ATTs comunes en los dos experimentos. De ellos, 181 se expresaban antes y/o después del primer ciclo de azacitidina en el experimento dirigido y solo 53 en el experimento del transcriptoma global.

Background: Recent therapeutic and survival advances in the lymphoid malignancies setting have not been paralled in the myeloid setting, where there is an urgent need for new targets. Despite the absence of mutations in the DNA repair machinery in myeloid malignancies, the advent of high-throughput sequencing and discovery of splicing and epigenetics defects in chronic myelomonocytic leukaemia (CMML) prompted us, in the first chapter of our work, to revisit a pathogenic role for genes involved in DNA damage response. In the second chapter, we focused on the cancer testis antigens (CTA), a group of molecules whose expression has been silenced by hypermethylation in the somatic cells of healthy individuals. However, cancer cells re-express some of them, specific for the type of tumor, with immunogenic properties. Even when re-expressed, these molecules show a low number of transcripts, and global transcriptome RNA-seq approaches could be not sensitive enough for their characterisation. A customized targeted RNA-seq approach has shown to be more reliable for these purposes.

Aims: to take advantage of recent RNA-seq approaches to identify new molecules to be targeted in CMML and related disorders, focusing in a synthetic lethality strategy for DNA repair genes, and in CTAs change of expression after azacitidine for immunotherapeutic purposes.

Methods: First, we screened for misregulated DNA repair genes by enhanced RNA-sequencing on bone marrow from a discovery cohort of 27 CMML patients and 9 controls. We validated differentially expressed candidates in CMML CD34+bone marrow selected cells and in an independent cohort of 74 CMML patients, mutationally contextualized by targeted sequencing. Second, we performed a customized RNA-seq experiment targeting 210 CTAs at diagnosis and after one cycle of azacitidine in 19 cases, validated at the protein level the behaviour of our main candidates, and compared the results with global RNA-seq results from 11 patients.

Resultados: First, we found BAP1 and PARP1 down-regulation to be specific to CMML compared with other related disorders. Chromatin-regulator mutated cases showed decreased BAP1 dosage. We validated a significant over-expression of the double strand break-fidelity genes CDKN1A and ERCC1, independent of promoter methylation and associated with chemorefractoriness. In addition, patients bearing mutations in the splicing component SRSF2 displayed numerous aberrant splicing events in DNA repair genes, with a quantitative predominance in the single strand break pathway.

Second, we performed a RNA-seq study targeting 210 CTAs pre and post (+28) first cycle of azacitidine in 19 patients with MDS (n=13) and CMML (n=6). We found that 137 out of 210 CTAs showed a significant expression (CPM>1) at diagnosis. Some of the CTAs not expressed at baseline showed a re-expression after azacitidine; highlighting ADAM29 as a potential candidate based on the highest level of expression after a cycle of hypomethylating agent. In addition, TFDP3 y DDX53, both X-linked CTAs, emerged as main candidates as therapeutic targets, as they fulfilled two criteria: i) significant icrease I expression after 1 cycle of azacitidine in those patients who achieved complete remission after 4-6 cycles, and ii) a parallel dynamic was validated at the protein level. As we had the results from the global transcritptome pre and post azacitines in 11 of these targeted sequenced patients, we compared both datasets. We could identify 203 of CTA genes common in both designs. Of those, 181, at baseline and/or after treatment, were found to be significantly expressed in the targeted approach and only 53, at baseline and/or after treatment, in the global transcriptome experiment.

Conclusion: Our results highlight potential targets in these group of diseases, selected with clinical and biological rationale, which currently has few therapeutic options.