Edición de genes de tomate que codifican potenciales factores provirales para el virus del mosaico del pepino dulce

Abstract

El virus del mosaico del pepino dulce (PepMV; especie Pepino mosaic virus, género Potexvirus; familia Alphaflexiviridae) es un virus de ARN de cadena sencilla y polaridad positiva que causa una de las principales enfermedades que afectan a los cultivos de tomate de todo el mundo, provocando importantes pérdidas económicas. En la actualidad, no se dispone de variedades de tomate comerciales resistentes a PepMV y las fuentes de resistencia descritas son poco apropiadas para su uso en programas de mejora. Así, la identificación de dianas genéticas para conseguir resistencia a este virus tiene un gran interés aplicado. Por otra parte, el sistema experimental PepMV/tomate está adquiriendo una importancia creciente, por lo que profundizar en el conocimiento de los aspectos moleculares de la interacción PepMV/tomate tiene, en sí mismo, un importante interés de tipo fundamental. En el primer capítulo de esta tesis, se describe la identificación de 21 proteínas de tomate que interaccionan con alguna de las proteínas de PepMV mediante un escrutinio en levadura, utilizando una genoteca de ADNc normalizado de plantas de tomate sanas e infectadas. El silenciamiento génico inducido por virus (virus induced gene silencing, VIGS) de los genes que codificaban estas proteínas no resultó en signos fenotípicos diferentes al de las plantas de genotipo silvestre (wild type, WT) en la mayoría de los casos. Las plantas silenciadas en los genes que codifican las proteínas RdRp-IP5, TGB1-IP12 y TGB2-IP18 mostraron una disminución de la acumulación de PepMV además de conservar un fenotipo similar al de las plantas WT. TGB2-IP12 estaba anotada funcionalmente como una serina/treonina quinasa, pero las otras dos proteínas no estaban anotadas. El análisis bioinformático de RdRp-IP5 sugiere que pertenece a la superfamilia de proteínas NTF2 con un posible papel en la respuesta a estreses bióticos, mientras que para TGB2-IP18 no encontró una posible función, aunque tiene un gen ortólogo en Arabidopsis thaliana anotado como parte del complejo citocromo b6f. La localización subcelular de estas proteínas fusionadas a proteínas fluorescentes mediante microscopía de barrido láser confocal en células sanas e infectadas de Nicotiana benthamiana resultó en la colocalización de RdRp-IP5 y TGB1-IP12 en estructuras similares a los complejos de replicación viral (viral replication complexes, VRCs) descritos previamente. Sin embargo, la proteína TGB2-IP18, mantuvo su localización en los cloroplastos de las células infectadas. Por último, se generaron mutantes de tomate knockout homocigóticos para los genes que codifican RdRp-IP5 y TGB1-IP12 respectivamente, y un mutante heterocigótico con un solo alelo editado para el gen que codifica TGB2-IP18 utilizando el sistema CRISPR/Cas9. En las plantas mutantes rdrp-ip5 y tgb2-ip18 no se alteró la acumulación de PepMV. Sin embargo, las plantas mutantes tgb1-ip12 infectadas mostraron un aumento de la acumulación del virus, lo que sugiriere que TGB1-IP12 pueda tener un papel durante la infección de PepMV en tomate. En el trabajo que se describe en el segundo capítulo, se obtuvieron 7 mutantes de tomate cv. Micro-Tom para los genes que codifican las proteínas interactoras de la TGB2 (TGB2-IP14-21) para analizar si alguna de estas proteínas tiene un papel durante la infección por PepMV. En los mutantes tgb2-ip19 y tgb2-ip21 infectados aumentó la acumulación del virus significativamente. TGB2-IP19 es una metiltransferasa tipo 11 dependiente de S-adenosilmetionina, mientras que TGB2-IP21 está anotada como proteína de función desconocida. El estudio in silico llevado a cabo sugiere la localización de TGB2-IP19 en el núcleo y el citoplasma y una posible implicación en la respuesta a estreses bióticos, mientras que para TGB2-IP21 se predijo una localización anclada a las membranas del retículo endoplásmico (RE) o mitocondriales y que puede que esté relacionada con algún proceso implicado en la respuesta a estrés biótico, aunque no se pudo predecir una función. En el trabajo descrito en el tercer capítulo, se expresó la TGB2 de PepMV fusionada a proteínas fluorescentes en N. benthamiana. Un análisis mediante microscopía de barrido láser confocal mostró una señal fluorescente que colocalizaba con un marcador específico de RE. La expresión de TGB2 fusionada a mRFP en plantas de N. benthamiana infectadas con PepGFPm2 resultó en la relocalización de la señal fluorescente de TGB2 al interior de los VRCs. Además, la coexpresión de TGB2 con su interactor TGB2-IP19 mostró una colocalización de la señal fluorescente en el núcleo y el citoplasma en plantas no infectadas, y una relocalización de la señal fluorescente de ambas proteínas a los VRCs en plantas infectadas con PepGFPm2

Pepino mosaic virus (PepMV; species Pepino mosaic virus, genus Potexvirus; family Alphaflexiviridae) is a positive-sense single-stranded RNA virus that causes major diseases affecting tomato crops worldwide, resulting in significant economic losses. Currently, no resistant tomato varieties are commercially available and the described sources of resistance are not suitable for their use in breeding programs. Thus, the identification of new genetic targets to obtain resistance to PepMV is very interesting from an applied point of view. On the other hand, the experimental system PepMV/tomato is acquiring an increasing importance, so deepening the knowledge of the molecular aspects of this interaction has on itself a great importance from the fundamental point of view. In the first chapter of this thesis, I describe the identification of 21 tomato proteins that interacted with PepMV proteins in a yeast-two hybrid screening using a normalized cDNA library from healthy and infected tomato plants as bait. In most cases, the virus-induced silencing of the genes encoding these proteins did not result in any different phenotype compared with the wild type (WT) plants. Interestingly, the plants silenced for the genes encoding the RdRp-IP5, TGB1-IP12 and TGB2-IP18 proteins showed a decrease in PepMV accumulation in addition to preserving a phenotype similar to the WT plants. TGB2-IP12 was functionally annotated as a serine/threonine kinase, but the other two proteins were not annotated in public databases. The bioinformatic analysis of RdRp-IP5 suggested that it belongs to the NTF2 protein superfamily, with a possible role in the response to biotic stresses. For TGB2-IP18, I could not find a clear indication of a function, although it has an orthologous gene in Arabidopsis thaliana annotated as part of the cytochrome b6f complex. I also studied the subcellular localization of these two proteins fused to fluorescent proteins by confocal laser scanning microscopy in healthy and infected Nicotiana benthamiana plants. I found colocalization of RdRp-IP5 and TGB1-IP12 in structures similar to the viral replication complexes (VRCs) described previously. However, the TGB2-IP18 protein kept the same chloroplastic localization in healthy or in infected cells. Finally, I generated knockout homozygous mutants of the genes encoding RdRp-IP5 and TGB1-IP12 respectively, and a heterozygous mutant with a single edited allele of the gene encoding TGB2-IP18 using the CRISPR/Cas9 system. PepMV accumulation was not altered in rdrp-ip5 and tgb2-ip18 infected mutants. However, the tgb1-ip12 infected mutant showed an increased accumulation of the virus, suggesting that TGB1-IP12 may have a role during PepMV infection in tomato. In the work described in the second chapter, I generated seven mutants of tomato cv. Micro-Tom on genes encoding TGB2 interacting proteins (TGB2-IP14-21) by the CRISPR/Cas9 technology. To test the role of these proteins during viral infection I challenged these mutants with PepMV; tgb2-ip19 and tgb2-ip21 infected mutants showed significantly higher viral title compared with WT plants. TGB2-IP19 was annotated as an S-adenosylmethionine-dependent methyltransferase type 11, while TGB2-IP21 was annotated as a protein of unknown function. An in silico study suggested nuclear and cytoplasmic localization of TGB2-IP19 and its possible implication in the response to biotic stresses. The predicted localization of the TGB2-IP21 protein was anchored to the membranes of the endoplasmic reticulum (ER) or mitochondria and it was possibly involved in processes related to the response to biotic stress, although a specific function could not be predicted. In the work described in the third chapter, I expressed TGB2 of PepMV fused to fluorescent proteins by agroinfiltration in N. benthamiana plants. The confocal laser scanning microscopy analysis of TGB2 showed a fluorescent signal that colocalized with an ER-specific marker protein. The expression of TGB2 in plants infected with PepMV resulted in the relocation of the fluorescent signal of TGB2 into the VRCs. The co-expression of TGB2 with its interactor TGB2-IP19 showed a colocalization of both fluorescent signals at nuclei and cytoplasm in uninfected plants, and a relocation of the fluorescent signal of both proteins to the VRCs in infected plants.