Caracterización de la producción de compuestos bioactivos y análisis de proteínas en cultivos celulares de brócoli

Abstract

El consumo de brócoli se ha visto incrementado en todo el mundo debido a su alto valor nutritivo. Además, el brócoli contiene una compleja mezcla de compuestos bioactivos con actividad antioxidante, entre los que destacan los glucosinolatos y sus derivados, así como los compuestos fenólicos. Debido a los beneficios para la salud que presentan estos metabolitos secundarios, el objetivo principal de este trabajo de investigación fue la utilización de suspensiones celulares de brócoli para incrementar la producción de estos compuestos de interés. En primer lugar, se realizó una revisión sobre la biosíntesis, la regulación y las funciones biológicas de los glucosinolatos en las plantas. Además, se profundizó en las diferentes estrategias biotecnológicas para su obtención, principalmente las basadas en las técnicas de cultivo de plantas in vitro. Posteriormente, se utilizó la elicitación como estrategia para incrementar la producción de glucosinolatos en suspensiones celulares de brócoli y se analizaron los niveles de expresión de los genes que codifican enzimas implicadas en la ruta de biosíntesis de los glucosinolatos en estas suspensiones celulares de brócoli bajo condiciones de elicitación. También se realizaron experimentos de elicitación modificando diferentes condiciones de cultivo, con el fin de determinar cuáles fueron las condiciones óptimas para incrementar la producción de glucosinolatos en las suspensiones celulares de brócoli. Otro de los objetivos propuestos en este trabajo de investigación fue analizar el efecto de los elicitores sobre el metabolismo antioxidante de las células de brócoli. Para ello, se realizaron medidas de la actividad de enzimas implicadas en el metabolismo antioxidante, así como el contenido en glutatión y los niveles de peroxidación de lípidos en las suspensiones celulares de brócoli sometidas a elicitación. Finalmente, se estudió el patrón de bandas de proteínas expresadas diferencialmente bajo condiciones de elicitación en células de brócoli mediante SDS-PAGE, con el fin de identificar proteínas relacionadas con la defensa vegetal. La principal conclusión obtenida de este trabajo de investigación fue que la elicitación de suspensiones celulares de brócoli con coronatina incrementó en gran medida la producción de glucosinolatos, constituyendo esta estrategia un sistema biotecnológico de producción de estos compuestos alternativo a la extracción tradicional de compuestos bioactivos a partir de materia prima vegetal. Además, la cantidad de sacarosa, junto con la composición nutricional del medio de cultivo, la densidad celular utilizada y la adición de triptófano como precursor de la ruta de biosíntesis, fueron factores clave que limitaron la producción de glucosinolatos en las suspensiones celulares de brócoli. Entre los efectos desencadenados por la coronatina sobre las suspensiones celulares de brócoli destacó el incremento en los niveles de expresión de genes implicados en la ruta de biosíntesis y la regulación de los glucosinolatos. En relación a los compuestos fenólicos, tanto la coronatina como el jasmonato de metilo fueron efectivos, ya que incrementaron la producción de estos compuestos bioactivos en las suspensiones celulares de brócoli. El incremento en la producción de compuestos bioactivos conseguido por el tratamiento con elicitores se correlacionó con alteraciones en las actividades enzimáticas implicadas en el metabolismo antioxidante y en el estado redox del glutatión. Estos resultados, combinados con el incremento observado en la peroxidación de lípidos, sugirieron que la elicitación con coronatina y jasmonato de metilo condujo al establecimiento de un estrés oxidativo moderado en las suspensiones celulares de brócoli. Además, el estrés oxidativo indujo la síntesis de una serie de polipéptidos relacionados con la defensa vegetal en las suspensiones celulares de brócoli.

The consumption of broccoli has been increased worldwide due to its high nutritive value. Moreover, broccoli contains a complex mixture of bioactive compounds showing antioxidant activity, as glucosinolates and phenolic compounds. Due to the health benefits of these secondary metabolites, the main objective of this work was the use of broccoli suspension-cultured cells to increase their production. Firstly, the biosynthesis, regulation and functions of glucosinolates in plants have been studied. In addition, different biotechnological strategies based on plant in vitro cultures used to obtain these compounds have been detailed. On the other hand, elicitation has been used to increase the production of glucosinolates in broccoli suspension-cultured cells and the expression levels of glucosinolate biosynthesis related genes in these broccoli suspension-cultured cells under elicitation conditions have been analysed. Other elicitation experiments have been carried out by modification of different culture conditions, in order to increase the glucosinolate production in broccoli suspension-cultured cells. Another objective proposed in this work was to analyse the effect of elicitors on broccoli cells. In this sense, different activity measurements of enzymes involved in antioxidant metabolism, as well as the glutathione content and lipid peroxidation levels have been carried out in elicited broccoli suspension-cultured cells. Finally, the protein pattern expressed under elicitation conditions in broccoli cells was studied by SDS-PAGE in order to identify defense-related proteins. The main conclusion obtained from this work was that elicitation of broccoli suspension-cultured cells with coronatine led to a high increase in glucosinolate production, resulting in a biotechnological production system of these compounds alternative to the whole plant extraction. Moreover, the amount of sucrose, together with the nutritional medium composition, the cell density used and the addition of tryptophan as biosynthetic pathway precursor, were factors that limited the production of glucosinolates in broccoli suspension-cultured cells. Coronatine increased the expression levels of genes involved in the biosynthetic pathway and regulation of glucosinolates. Regarding phenolic compounds, coronatine and methyl jasmonate were able to increase the production of these bioactive compounds in broccoli suspension-cultured cells. The increased bioactive compound production was correlated with alterations in the activity of enzymes involved in the antioxidative metabolism and the glutathione redox state. These results, combined with an increase in lipid peroxidation, suggested that elicitation with coronatine and methyl jasmonate led to the establishment of a mild oxidative stress in broccoli suspension-cultured cells. In addition, the oxidative stress induced the synthesis of a number of defense-related polypeptides in broccoli suspension-cultured cells.