Impact of embryo transfer and In vitro production of embryos on phenotypical and molecular traits ofoffspring in the porcine species (Sus scrofa)

Abstract

Las técnicas de reproducción asistida (TRA) son una ciencia en crecimiento a nivel mundial. Muchas de estas técnicas se han desarrollado y aplicado, tanto en humanos como animales, para resolver problemas de infertilidad o para aumentar el rendimiento productivo de animales. El uso de TRA en animales tiene un doble objetivo: por un lado, todas las TRA han sido y son desarrolladas primero en animales sirviendo de modelo para la especie humana; y, por otro lado, debido al crecimiento demográfico de la población, su uso ha sido incrementado a fin de abastecer una mayor demanda de la producción de carne y leche. A nivel científico, el uso de modelos animales está ampliamente establecido para el estudio de enfermedades, entre otras aplicaciones. En este sentido, el cerdo presenta especial interés en todos los campos biomédicos dadas sus similitudes genéticas, fisiológicas y anatómicas con la especie humana. El uso de TRA en ganadería ha adquirido más relevancia en cuanto al desarrollo de nuevos procedimientos para lograr un mayor rendimiento productivo al menor coste. Sin embargo, estos objetivos no siempre son alcanzados o puede dar lugar a consecuencias no deseadas. Por ejemplo, la inseminación artificial (IA) está ampliamente establecida en granjas porcinas al proporcionar altos rendimientos productivos, aunque aumenta la endogamia dentro de una misma población. La transferencia embrionaria (TE), por otro lado, ha presentado algunas limitaciones en la especie porcina debido a la necesidad de llevar realizar un procedimiento quirúrgico o al gran número de embriones necesarios en cada transferencia. Sin embargo, aunque el desarrollo de la TE no quirúrgica ha proporcionado grandes ventajas por ser un procedimiento más seguro o por minimizar el riesgo de transmisión de enfermedades, y suponer un menor coste, su uso es aún muy limitado en la industria porcina. Las consecuencias a corto y largo plazo derivadas del uso de TRA en humanos y animales aún están poco establecidas. Se sabe que tanto gametos como embriones tempranos se encuentran en una etapa crítica de reprogramación epigenética, siendo muy sensibles a las condiciones ambientales. Por ello, la realización de más estudios sería necesario para conocer las consecuencias a corto, medio y largo plazo. El objetivo de esta tesis fue estudiar, utilizando el cerdo como modelo, el impacto de algunas TRA sobre varios rasgos fenotípicos y moleculares de la descendencia hasta los 6 meses de edad. En el Experimento 1, se recogieron embriones de cerdas donantes y se transfirieron no quirúrgicamente a receptoras. Las hembras procedentes de embriones producidos in vivo mostraron mayor peso al nacimiento que aquellas procedentes de IA; sin embargo, esas diferencias desaparecieron el día 15. La TE no indujo diferencias en los parámetros hematológicos y bioquímicos de la descendencia de relevancia clínica conocida. En los Experimentos 2 y 3, la producción in vitro (PIV) de embriones se realizó utilizando o no fluidos reproductivos (FR) como aditivos en los medios de cultivo, los embriones se transfirieron quirúrgicamente a cerdas receptoras y se estudió el crecimiento y desarrollo de los lechones hasta los 6 meses de edad. El uso de FR como aditivos no afectó las tasas de gestación y parto. La TE de embriones producidos in vitro no afectó el peso de la placenta, pero sí al tamaño y la eficiencia ésta. El peso al nacimiento, la longitud craneocaudal y la distancia anogenital de lechones procedentes de embriones producidos in vitro con FR como aditivos fueron más similares a los obtenidos por IA. Se observó un mayor peso al nacimiento y un crecimiento más rápido hasta el 6º mes de vida en lechones procedentes de embriones producidos in vitro. Esta tendencia se vio disminuida por la adición de FR a los medios de cultivo. Los lechones procedentes de embriones producidos in vitro, con la adición de FR mostraron un fenotipo más similar en cuanto a parámetros hematológicos con los nacidos por IA respecto a aquellos procedentes de embriones producidos in vitro sin FR. La tolerancia a la glucosa en lechones en crecimiento mostró una tendencia similar en los tres grupos. En resumen, la investigación desarrollada en esta tesis demostró que tanto el crecimiento como el perfil hematológico y bioquímico de los lechones no se ven afectados por la TE durante los primeros 15 días de edad. Por otro lado, aunque el rendimiento reproductivo no se ve afectado por la fuente de proteínas de los medios de cultivo, hay una influencia en la eficiencia placentaria y algunos de sus rasgos moleculares. Además, existe un efecto derivado de la producción in vitro de embriones en el crecimiento y algunos parámetros hematológicos, que se mitiga mediante la adición de FR a los medios de cultivo.

Assisted reproductive technologies (ART) are a growing science globally. From humans to animals, either to solve infertility issues or to increase animal productivity, many techniques have been developed and applied. The use of ART in animals has a dual goal: on the one hand, all the ART were and are developed first in animals, serving as model to humans; and, on the other hand, the increase in the use of ART in livestock is also related to human population growth and the necessity of higher meat or milk production. Indeed, animal models are widely used in science to study a wide variety of diseases in humans or to investigate the function of specific genes, among other applications. In this sense, the pig has been of special interest to all biomedical fields, due to its anatomical similarities with humans, such as those related to its organ size, or to its circulatory and digestive systems The use of ART in agriculture has become more relevant in terms of developing new procedures to achieve specific objectives at a lower cost, although these are not always reached or may generate undesired consequences. For example, artificial insemination (AI) is widely established on pig farms providing high productive yields, but it increases inbreeding within the same population. Embryo transfer (ET), on the other side, has presented limitations in the porcine species due to the surgical requirement or the high number of embryos needed to be transferred. The development of non-surgical ET, although it has brought great advantages, is still of very limited use in the pig industry. The short and long term consequences of the use of ART in humans and animals are still poorly established. It is known that gametes and early embryos are in a critical stage of epigenetic reprogramming and are highly sensitive to the environmental conditions. Thus, more studies on the short, medium and long term consequences of each technique should be performed. The aim of this thesis was to study, using the pig model, the impact of some ART (namely ET, IVP and culture medum composition) on various phenotypic and molecular traits of the offspring until the age of 6 months. In experiment 1, embryos were collected from donor sows and nonsurgically transferred to recipients. Female piglets derived from in vivo-derived embryos showed greater weights at birth than female piglets derived from AI; however, those differences disappeared by day 15 of age. The ET procedure did not induce differences in haematological and biochemical parameters of the derived offspring of known clinical relevance. In Experiments 2 and 3, in vitro production (IVP) of embryos was performed by using or not reproductive fluids (RF) as additives to the culture media, embryos were surgically transferred to recipient sows and the piglets born were studied for their growth and development until the 6 months of age. The use of RF as additives in the culture media did not affect pregnancy and farrowing rates and the transfer of in vitro-derived embryos did not impact placental weight but affected placental size and placental efficiency. The birthweight, crown-rump length and anogenital distance of animals born derived from embryos produced in vitro with the use of RF as additives were more similar to those obtained through AI than when these fluids were not added. There was a tendency to have a larger size at birth and faster growth until month 6 of age in piglets derived from embryos produced in vitro, although this trend was diminished by the addition of RF to the culture media. Piglets derived from embryos produced in vitro, with addition of RF showed a more similar phenotype for hematological parameters to those born by AI compared to piglets from embryos produced in vitro without RF. Glucose tolerance in growing piglets displayed a similar tendency in all three groups. In summary, the research developed in this thesis showed that the growth as well as the hematological and biochemical profile of piglets is not affected by ET during the first 15 days of age. On the other hand, although reproductive yield is not affected by the protein source of the culture media, there is an influence on placental efficiency and some molecular traits in this transitory organ. Furthermore, there is an effect derived from the in vitro production of embryos on growth and some hematological parameters, which is mitigated by the addition of RF to the culture media.