Diseño de un protocolo para el aislamiento de células cebadas del exudado peritoneal de Sparus aurata para la identificación de receptores de estrógenos

Abstract

RESUMEN. La contaminación de las aguas por disruptores endocrinos, y en concreto de estrógenos sintéticos, crece diariamente pudiendo cambios en el sistema inmunitario en los animales que en ellas habitan al presentar en las células que lo componen receptores de estrógenos. La inflamación es la primera respuesta de los animales frente a una infección o daño en el tejido. La histamina tiene un papel muy importante en la regulación de la inflamación en vertebrados capaces de almacenarla en células especializadas inmunitarias llamadas células cebadas. Sparus aurata presenta histamina en las células cebadas de tejidos mucosos. El exudado peritoneal de S. aurata está enriquecido en células cebadas. Hemos identificado que el exudado peritoneal de dorada está compuesto por linfocitos, granulocitos acidófilos, macrófagos y células cebadas. Hemos diseñado un protocolo de separación de las células cebadas de exudado peritoneal de S. aurata consiguiendo purezas superiores al 95% cuando se mide por citometría. Estos datos fueron confirmados mediante microscopía electrónica. Este protocolo de separación servirá como un paso hacia adelante para realizar estudios in vivo e in vitro orientándonos en la evolución de los mecanismos inflamatorio de vertebrados. También hemos demostrado por citometría de flujo y western-blot utilizando los anticuerpos adecuados que las células cebadas de esta especie presentan el receptor de estrógenos acoplado a la proteína G (GPER). Además, con la idea de poder estudiar en investigaciones futuras el efecto que altas concentraciones de estrógenos causan en el sistema inmune de S. aurata intentamos estudiar la capacidad de liberación de histamina en células cebadas tras su estimulación con diferentes PAMPs (patrones moleculares asociados a patógenos) lipopolisacáridos (LPS), Poly I:C (análogo sintético de la doble cadena de ARN (dsRNA)) y AND genómico de Vibrio angillarum (VaDNA), aunque ninguno era capaz de inducir la liberación de histamina en estas células.

ABSTRACT The water pollution by endocrine disruptors, specifically synthetic estrogen, grow daily causing changes in the immune system in the animals that inhabit in there due to the presence of estrogen receptor in the cells that compose the immune system. Inflammation is the first response of animals against infection or tissue damage. Histamine has a role in the regulation of inflammation in vertebrates capable of storing specialized immune cells called mast cells. Sparus aurata presents histamine from mast cells mucosal tissues. The peritoneal exudate of S. aurata is enriched in mast cells. We have identified that the peritoneal exudate is composed of lymphocytes, acidophilic granulocytes, macrophages and mast cells. We have designed a protocol separation of the mast cells contained in the peritoneal exudate of S. aurata getting purities greater than 95% when measured by flow cytometry. These data were confirmed by electron microscopy. This separation protocol will serve as a step forward to study in vivo and in vitro addressing in the evolution of vertebrates inflammatory mechanisms. We have also shown by flow cytometry and western blot using suitable antibodies that the mast cells of this species present G protein-coupled estrogen receptor (GPER). Moreover, with the idea in future research to study the effect that high concentrations of estrogen cause in the immune system of S. aurata we tried to study the ability of histamine release from mast cells after stimulation with different PAMPs (pathogen associated molecular patterns) lipopolysaccharide (LPS), Poly I: C (synthetic analog of double-stranded RNA (dsRNA)) and Vibrio angillarum genomic DNA (VaDNA), but none were able to induce histamine release from these cells.