Modelo de interacción célula NK-célula tumoral en la leucemia aguda en la infancia

Abstract

Introducción: La leucemia aguda es el cáncer más frecuente en la infancia, representa el 27,1 % de todas las neoplasias que se diagnostican en niños de cero a catorce, entre ellas la leucemia linfoblástica aguda (LLA) comprende el 80 % de todas las leucemias, mientras que la leucemia mieloblástica aguda (LMA) representa el 16,5 %. La mejora de los tratamientos ha permitido el aumento de la tasa de supervivencia a cinco años de estos pacientes, situándolas en el 84 % en la LLA y en el 61 % en la LMA. Pero un 20 % de los pacientes con LLA y hasta un 50% de los pacientes con LMA recae y en estos casos la tasa de curación disminuye drásticamente, por lo que para estos pacientes son necesarias nuevas estrategias y aproximaciones terapéuticas que permitan conocer y seleccionar a aquellos con mayor riesgo de recaída. En este sentido cabe destacar que las células Natural Killer (NK) tiene una potente actividad antitumoral innata, tanto las células NK autólogas (del propio paciente) como las alogénicas en el contexto del trasplante de progenitores hematopoyéticos (TPH), debido a que determinadas combinaciones genéticas entre donante y receptor regulan la función de las células NK favoreciendo la lucha del injerto frente a la leucemia. A esto se une que las células NK son las más resistentes a la quimioterapia citotóxica, por lo que parece apropiado profundizar en el estudio de estas células y su interacción con las células leucémicas, para un mejor conocimiento de los mecanismos que regulan la función de la respuesta antitumoral que podría contribuir al desarrollo de nuevas terapias antitumorales personalizadas sin efectos secundarios indeseables. Objetivos: El objetivo principal de esta tesis es analizar el papel de la interacción entre la célula NK y la célula tumoral en pacientes pediátricos diagnosticados de leucemia aguda. Para ello se propone: 1) analizar el perfil genético los receptores KIR de células NK y la de sus ligandos HLA en pacientes y controles sanos para determinar su relación con la patología leucémica; 2) analizar el fenotipo de las células malignas en los diferentes tipos de leucemias agudas y su expresión de ligandos para receptores activadores (CD112, CD155, MICA/B y ULBP-1) e inhibidores (HLA-I y HLA-C) de las células NK, tratando de establecer su relación con la susceptibilidad y evolución de los pacientes; y 3) estudiar en pacientes y controles sanos la expresión de receptores inhibidores (KIR2DL1, KIR2DS1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1 y NKG2A) y activadores (CD16 y DNAM-1) en células NK de sangre periférica (SP), para investigar su papel en la susceptibilidad y la evolución de los pacientes.

Metodología: La metodología utilizada en esta tesis ha sido, la tipificación de los genes KIR y HLA en muestras de ADN con sistema Luminex mediante PCR-SSO. Para analizar el inmunofenotipo y la expresión de ligandos en muestras de MO se ha utilizado un citómetro BD FACSCanto-II (de 3 láseres y 8 detectores) y para analizar la expresión de receptores de células NK en muestras de SP se ha utilizado un citómetro BD LSR-II (de 3 láseres y 13 detectores). Todas las variables analizadas se incluyeron en una base de datos Excel 2003 anonimizando la identidad de los pacientes y para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS v20.0. Conclusiones: 1. En nuestra serie de pacientes no se evidencia asociación entre los diferentes genotipos KIR y HLA o sus potenciales interacciones y el riesgo de padecer leucemia aguda en la infancia. 2. En pacientes pediátricos con LLA-B, la interacción KIR2DL2/C1 se asocia a SG y SLE más cortas. Esta asociación es independiente de la presencia de alteraciones citogenéticas de mal pronóstico, pero está relacionada con la presencia de un mayor número de interacciones iKIR/ligando, por lo que podría ser la suma de interacciones inhibidoras la que impacte negativamente en la supervivencia. 3. Las LLA-B y -T de nuestra serie presentan un patrón de expresión de ligandos de receptores de células NK opuesto. Las LLA-B conservan la expresión de ligandos inhibidores (HLA-I y HLA-C) y aumentan la de ligandos activadores (CD112 y ULBP-1), mientras que las LLA-T sin excepción, muestran pérdidas muy significativas de la expresión de ligandos inhibidores, sin incremento de la expresión de ligandos activadores. Esta diferencia, de ser confirmada, sugiere que los mecanismos que regulan la inmunovigilancia frente a ambos tipos de leucemias son diferentes, y podría ser de utilidad para potenciar la respuesta antitumoral en la selección de donantes de progenitores hematopoyéticos. 4. En la LLA-T infantil la pérdida de expresión de HLA-C en la población patológica se asocia a supervivencias prolongadas, lo que sugiere que el reconocimiento de pérdida de lo propio por parte de las células NK podría contribuir a la inmunovigilancia en este tipo de leucemia. 5. La expresión basal elevada de HLA-C en los linfocitos sanos residuales de los pacientes con LLA-B infantil se asocia aparentemente a supervivencias más reducidas, lo que podría indicar un estado de menor respuesta de las células citotóxicas de estos pacientes, posiblemente inducido por un exceso de señales inhibidoras. Estos resultados deberían ser demostrados en ensayos in vitro. 6. Las interacciones educadoras iKIR/ligando favorecen ratios elevados de expresión CD226/iKIR en las células NK de pacientes pediátricos y controles sanos. Sin embargo, la interacción educadora NKG2A/HLA-E, induce ratios reducidos de CD226/NKG2A en las células NK de los niños con leucemia aguda, pero no en los controles sanos de nuestro estudio. Esta disminución podría ser un mecanismo supresor de células NK desarrollado específicamente en la leucemia aguda infantil, importante al tratarse de la subpoblación de células NK mayoritaria en niños.

Introduction: Acute leukaemia is the most frequent cancer in childhood, representing 27.1 % of all neoplasm diagnosed in children from zero to fourteen years, among them the most frequent is acute lymphoblastic leukaemia (ALL) with 80 % of all leukaemias, while acute myeloblastic leukaemia (AML) represents 16.5 %. The improvement of treatments has allowed the increases of five-year survival rate of these patients, placing them at 84 % in ALL and 61 % in AML. But 20 % of patients with ALL and up to 50 % of patients with AML relapse and in these cases the cure rate decreases, so new strategies and therapeutic approaches that allow us to know and select are necessary for these patients with the highest risk of relapse. In this regard, it should be noted that the Natural Killer cell (NK) lymphocyte population has a potent innate antitumor activity, both autologous and allogeneic cells in the context of haematopoietic stem cells transplantation (HSCT), due to certain genetic combinations between donor and recipient regulates the function of NK cells activating the graft versus leukemia effect. To this is added that NK cells are the most resistant to elimination induced by cytotoxic chemotherapy, so it seems appropriate to deepen the study of these cells and their interaction with leukemic cells, for a better understanding of the mechanisms that regulate the role of the antitumor response that could contribute to the development of new individualized therapies that modulate immune tolerance against the tumour without the deleterious consequence. Aims: The main objective of this thesis is to analyze the role of the interaction between the NK cell and the tumor cell in paediatric patients diagnosed with acute leukemia. For this, the genetic profile of the NK cell receptors (KIR receptors), and that of their HLA ligands have been studied in healthy patients and controls to determine their relationship with leukemic pathology. The phenotype of the malignant cells in the different types of acute leukemias and their expression of ligands for activating receptors (CD112, CD155, MICA / B and ULBP 1) and inhibitors (HLA I and HLA C) of NK cells, have been analyzed. to try to establish its relationship with the susceptibility and evolution of patients. And the expression of inhibitory receptors (KIR2DL1, KIR2DS1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1 and NKG2A) and activators (CD16 and DNAM 1) in peripheral blood NK cells (SP) has been studied in patients and in healthy controls, to investigate their role in the susceptibility and evolution of patients. Methodology: The methodology used in this thesis has been the typing of the KIR and HLA genes in DNA samples with Luminex system using PCR-SSO. To analyse the immunophenotype and the expression of ligands in MO samples, a BD FACSCanto II cytometer (3 lasers and 8 detectors) has been used, and to analyse the expression of NK cell receptors in SP samples a BD LSR cytometer has been used II (of 3 lasers and 12 detectors). All the variables analysed were included in an Excel 2003 database anonymizing the patients' identity and for the statistical analysis the IBM SPSS Statistics v20.0 program was used. Conclusions: 1. In our series of patients there is no evidence of an association between the different KIR and HLA genotypes or their potential interactions and the risk of childhood acute leukaemia. 2. In paediatric patients with B ALL, the KIR2DL2 / C1 interaction is associated with shorter overall survival and event-free survival. This association is independent of the presence of cytogenetic alterations of poor prognosis, but it is related to the presence of a greater number of iKIR/ligand interactions, so it could be the sum of inhibitory interactions that negatively outcome. 3. B ALL and T ALL of our series have an opposite pattern of ligand expression from NK cell receptors. B ALL retain the expression of inhibitory ligands (HLA-I and HLA-C) and increase that of activating ligands (CD112 and ULBP 1), while T ALL without exception, show very significant losses of inhibitor ligand expression, without increasing of the expression of activating ligands. This difference, if confirmed, suggests that the mechanisms that regulate immunosurveillance against both types of leukaemia are different, and could be useful for enhancing the antitumor response in donor selection for hematopoietic stem cell transplantation. 4. In childhood T ALL, the loss of HLA-C expression in the pathological population is associated with prolonged survival, suggesting that the recognition of missing-self by NK cells could contribute to immunosurveillance in this type of leukaemia. 5. The elevated baseline expression of HLA-C in the residual healthy lymphocytes of patients with childhood B ALL is apparently associated with reduced survival, which could indicate a state of lower response of these patients' cytotoxic cells, possibly induced by an excess inhibitory signals. These results should be demonstrated in in vitro assays. 6. The iKIR/ligand educator interactions favour high rates of CD226/iKIR expression in the NK cells of paediatric patients and healthy controls. However, the NKG2A/HLA-E educational interaction induces reduced rates of CD226/NKG2A in the NK cells of children with acute leukaemia, but not in the healthy controls of our study. This decrease could be an NK cell suppressor mechanism developed specifically in childhood acute leukaemia, important as it is the main subpopulation of NK cells with iKIR in children.