Collection, Biobanking and Characterization of Human Tubal and Uterine Fluids for Their Future Use in Assisted Reproductive Technologies

Abstract

La literatura actual, revisada en el capítulo I, proporciona evidencias crecientes sobre los beneficios potenciales de los fluidos reproductivos femeninos como suplementos para los medios de cultivo de embriones en la especie humana. A partir de esas evidencias, planteamos la hipótesis de que es posible recoger, caracterizar y validar el uso de estos fluidos en la especie humana y almacenarlos en un biobanco que cumpla todas las condiciones sanitarias y los requisitos legales para su uso futuro en investigación biomédica o en ensayos clínicos. Para evaluar la viabilidad de esta hipótesis, se definieron cuatro objetivos principales en esta tesis descritos en el capítulo II. El primero fue el desarrollo de un procedimiento para la recolección de fluido oviductal (FO) y FU humano en pacientes y donantes (Capítulo III). Después de probar varios métodos para la recolección de fluidos uterinos y oviductales humanos, se encontró que el FO humano (FOH) podría recolectarse ex vivo mediante el método descrito previamente por Carrasco et al., 2008 en modelos animales. Sin embargo, no se encontró ningún método o dispositivo en el mercado que permitiera la recolección de FU humano (FUH) in vivo. Por esta razón, se desarrolló un dispositivo novedoso para la recolección de fluidos humanos que ha sido objeto de una solicitud de patente en el presente. El establecimiento de un acuerdo de cooperación con la red de Biobancos en Murcia ha permitido crear la primera colección de biobancos de fluidos reproductivos humanos (Capítulo IV). En este capítulo, se describen el flujo de trabajo y los métodos de manipulación, registro, trazabilidad, transporte y almacenamiento de los fluidos, así como los números y tipos de muestras disponibles en Biobanc-Mur para uso futuro. En el Capítulo V, se seleccionaron un conjunto de parámetros físico-químicos, actualmente utilizados para las certificaciones incluidas en los controles de calidad (CC) requeridos para la venta de medios de cultivo humanos, y se optimizaron los métodos para evaluarlos. En el capítulo VI, se realizó un análisis proteómico de alta resolución de los fluidos del tracto reproductivo femenino durante la fase secretora del ciclo menstrual, lo que constituye una contribución novedosa al conocimiento del proteoma oviductal y uterino. El conjunto de muestras evaluado, de solo 3 individuos, fue muy valioso en comparación con otros estudios porque fue posible analizar los fluidos reproductivos y el plasma de las mismas mujeres, evitando el sesgo debido a la variabilidad individual. Los estudios anteriores se han centrado en FUH, pero nuestro estudio demuestra que FOH también es un líquido rico en proteínas esenciales que podrían ser un objetivo para mejorar las tasas de fecundación y el desarrollo temprano del embrión si se utilizan en los medios de cultivo. Se necesitan más estudios con diseños similares y con procedimientos operativos estándar establecidos para corroborar nuestros resultados / hipótesis y encontrar marcadores consistentes en las secreciones del tracto reproductor femenino. Por otro lado, establecer correlaciones entre la demografía y el estilo de vida de los donantes con sus resultados de FIV es de gran utilidad para los usuarios. Una mejor comprensión de la dinámica folicular y la respuesta ovárica a la estimulación con gonadotropina de los donantes podría optimizar el reclutamiento del donante y los tratamientos de FIV en el futuro. Por lo tanto, en el capítulo VII, se estudiaron las características demográficas y de estilo de vida en relación con la respuesta ovárica a la hiperestimulación entre las donantes de ovocitos y se encontraron evidencias de que algunos factores clave y potencialmente modificables pueden afectar los rendimientos de ovocitos en mujeres jóvenes sanas. Específicamente, encontramos que las mujeres con un índice de masa corporal (IMC) en el extremo superior del IMC normal, así como las mujeres con un IMC en el rango de sobrepeso, tenían un mayor rendimiento de ovocitos MII. Además, las mujeres que tomaron siestas que duraron más de 30 minutos tuvieron un mayor rendimiento de ovocitos, mientras que las mujeres que hicieron ejercicio durante al menos 5 horas cada semana tuvieron un rendimiento de ovocitos más bajo que las mujeres que no tomaron siestas y las mujeres que no hicieron ejercicio, respectivamente. En resumen, se lograron varios hitos importantes dentro de esta tesis: i) el desarrollo de un dispositivo para recolectar el fluido uterino humano in vivo; ii) La creación del primer biobanco de fluidos reproductivos humanos. La conciencia de la población sobre este biobanco y su impacto en las parejas infértiles puede contribuir para obtener más donaciones de donantes sanos; iii) el establecimiento de los rangos de seguridad para los parámetros utilizados para certificar la calidad de los fluidos reproductivos humanos almacenados en el biobanco; y iv) el análisis epidemiológico y proteómico de los fluidos reproductivos humanos, cuyas conclusiones resultantes permitirán mejorar el conocimiento sobre los componentes de los fluidos reproductivos y elaborar un método para utilizarlos como suplementos para los medios de cultivo de embriones. En conjunto, la estrategia desarrollada en esta tesis podría contribuir a prevenir alteraciones epigenéticas y mejorar la salud de la descendencia derivada de las TRA mediante sistemas de cultivo más naturales durante el desarrollo de embriones preimplantacionales in vitro.

The current literature, reviewed in the chapter I, provide increasing evidence about the potential benefits of female reproductive fluids as supplements for embryo culture media in human species. From those evidences, we hypothesize that it is possible to collect, characterize and validate the use of these fluids in the human species, and to store them in a biobank fulfilling all the sanitary conditions and legal requirements for their future use in biomedical research or in clinical trials. In order to assess the viability of this hypothesis, four main objectives were defined in this thesis described in the chapter II. The first one was the development of a procedure for the collection of human oviductal (HOF) and UF in patients and donors (Chapter III). After testing several methods for the collection of human uterine and oviductal fluids, it was found that human OF (HUF) could be collected ex vivo by the method previously described by Carrasco et al 2008 in animal models. However, it was not found any method or device in the market allowing the collection of human UF (HUF) in vivo. For this reason, a novel device for human fluids collection was developed, which has been submitted for patenting at the present. The establishment of a cooperation agreement with the Biobank network in Murcia has allowed to create the first biobank collection of human reproductive fluids, (Chapter IV). In this chapter, the workflow and the methods for manipulation, registration, traceability, transportation and storage of the fluids is described as well as the numbers and types of samples available at Biobanc-Mur for future use. In Chapter V, a set of physico-chemical parameters, currently used for the certifications included in the quality controls (QC) required for the selling of human culture media, were selected, and the methods to assess them were optimized. In chapter VI, a high-throughput proteomic analysis of female reproductive tract fluids during the secretory phase of the menstrual cycle was performed, which constitutes a novel contribution to the knowledge of the oviductal and uterine proteome. The evaluated set of samples, of only 3 individuals, was highly valuable compared to other studies because it was possible to test the reproductive fluids and plasma of the same women, avoiding bias due to individual variability. Previous studies have focused on HUF, but our study demonstrates that HOF is also a rich fluid with essential proteins that could be a target to improve fertilization rates and early embryo development, if used in the culture media. More studies with similar designs and with established standard operating procedures are needed to corroborate our results/hypothesis and find consistent markers in secretions of female reproductive tract. On the other hand, establishing correlations between demographic and lifestyle of donors with their IVF outcomes has great utility for providers. A better understanding of follicular dynamics and ovarian response to gonadotropin stimulation of the donors could optimize the donor’s recruitment and IVF treatments going forward. Hence, in chapter VII, demographic and lifestyle characteristics in relation to ovarian response to hyperstimulation among oocyte donors were studied We evaluated a variety of demographic and lifestyle factors in relation to peak E2, total oocyte yield and MII oocyte yield among oocyte donors in Spain, and found evidence that some key and potentially modifiable factors may impact oocyte yields among otherwise young healthy women. Specifically, we found that women with a BMI on the high end of normal BMI, as well as women with a BMI in the overweight range, had a higher yield of MII oocytes. In addition, women who took naps lasting more than 30 minutes had a higher oocyte yield, whereas women who exercised for at least 5 hours every week had a lower oocyte yield than women who did not take naps and women who did not exercise, respectively. In summary, several important milestones were achieved within this thesis: i) the development of a device to collect human uterine fluid in vivo; ii) the creation of the first biobank of human reproductive fluids. The awareness of the population for this biobank and its impact on infertile couples may contribute for more donations from healthy donors; iii) the establishment of the safety ranges for the parameters used to certificate the quality of the human reproductive fluids stored in the biobank; and iv) the epidemiologic and proteomics analysis of human reproductive fluids, which resulting conclusions will allow to improve the knowledge about the reproductive fluids constituents, and to elaborate a method to use them as supplements for the embryo culture media. As a whole, the strategy developed in this thesis could contribute to prevent epigenetic alterations and to improve the health of ART-derived offspring by means of more natural culture systems during the in vitro preimplantational embryo development.