Estudio de la degeneración de las células ganglionares de la retina tras axotomía del nervio óptico : ensayo de nuevas terapias celulares y farmacológicas

Abstract

INTRODUCCIÓN: La retina es una extensión del SNC y se tiene fácil acceso lo que la hace un modelo único del Sistema Nervioso en general. Las células ganglionares de la retina (CGR) son las que forman el nervio óptico (NO) y envían la información visual al cerebro. Las neuronas del SNC son incapaces de dividirse, por lo que no existe la posibilidad de que se formen nuevas neuronas y sustituyan a aquellas que están dañadas. La lesión del NO produce la degeneración de gran parte de la población de CGR en dos fases, una rápida en los primeros 14 días y una lenta, y que existe una respuesta en el ojo contralateral. En rata, se ha documentado que el patrón temporal de muerte de las CGR varía en función de la distancia a la que se seccione el NO con respecto al globo ocular. Las células de la microglía juegan un papel esencial en la respuesta inmunitaria innata y neuroinflamación en el SNC. Los factores neurotróficos son factores de crecimiento endógenos necesarios para la supervivencia de las neuronas. Los retinoides representan una familia de compuestos derivados de la vitamina A, que han demostrado desempeñar un papel tanto en la proliferación como en la diferenciación en la neurogénesis adulta. La minociclina es un antibiótico tetraciclínico que alivia la respuesta inflamatoria y proporciona neuroprotección. La terapia con células madre es una herramienta ideal para la reparación del SNC, ya que las células madre son capaces de autorregenerarse y de diferenciarse en otros tipos celulares, así como secretar diversos factores que promuevan la supervivencia de las neuronas.

OBJETIVOS: Los objetivos generales de esta tesis son: i/caracterizar los cultivos organotípicos de retina como modelo de estudio de la población de las CGR; ii/ analizar el comportamiento de la curva de muerte de las CGR tras una lesión en dos distancias diferentes, tanto en el ojo lesionados como contralaterales; iii/ estudiar la supervivencia de las células estromales derivadas del tejido adiposo tras inyección intravítrea, y el papel que tienen en el curso de muerte de las CGR tras axotomía; iv/ estudiar el comportamiento de las células del cuerpo ciliar (CC), sus neuroesferas (NS-CC), las neuroesferas de células de la zona subventricular (NS-ZSV) y las células embrionarias ESR1, tras su inyección en el vítreo en retinas axotomizadas y deplecionadas v/ analizar el papel que tienen las proteínas del inflamasoma NLRP3 en las CGR; vi/ analizar el papel del antagonismo del TNFR1 en la supervivencia de las CGR en retinas axotomizadas; vii/ estudios neuroprotectores preliminares del agonismo de los receptores de ácido retinoico y el estudio a largo plazo de BDNF.

MATERIAL Y MÉTODOS: Para la realización de los experimentos se utilizaron: ratones macho pigmentados (C57BL/6) con un peso que entre 25-35g, ratones machos pigmentados transgénicos con expresión de la proteína verde fluorescente bajo el promotor de la actina, ratones KO de la proteína NLRP3, ratones KO de la proteína ASC y ratones KO de la proteína Caspasa 1/11, con edades comprendidas entre las 8 y 12 semanas de edad. El número de retinas analizadas por grupo/estirpe/intervalo de tiempo varía entre los distintos estudios de 4 a 20. Se realizó un modelo de daño axonal de las CGR: el aplastamiento del NO (ApNO). El ApNO se realizó a 0,5 mm o a 2 mm del globo ocular. Los tiempos de análisis tras la axotomía variaron de 3 días a 4 meses. El suministro de los fármacos o células se hizo mediante inyección intravítrea o intraperitoneal. El análisis anatómico de las retinas se realizó principalmente en retinas completas diseccionadas a plano inmunodetectadas con anticuerpos α-Brn3a o Rbpms (CGR), α-Iba-1 (microglía), α-GFAP (astrocitos), α-NeuN (neuronas) y α-GFP. Algunas retinas se diseccionaron en fresco para analizar el nivel de ARNm mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa o para realizar cultivos organotípicos de retina (COR). El fotografiado de las muestras se llevó a cabo con un microscopio de epifluorescencia y un microscopio confocal. Los fotomontajes de retinas se reconstruyeron a partir de 154 imágenes individuales (11x14) capturadas con el objetivo de 20x. Las CGR-Brn3a+ se cuantificaron y se estudiaron los mapas topográficos mediante rutinas automáticas.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES. Objetivo 1: En los COR existe una pérdida en las primeras 24 horas de aproximadamente un 60% de las CGR, seguida de una fase gradual de pérdida hasta los 21 días de cultivo. Este curso se asemeja al patrón de muerte observado in vivo, pero 2-3 veces más rápido. La retina en los COR sufre una degeneración en todas sus capas conforme más tiempo pase en el cultivo. Objetivo 2: Aunque el curso de pérdida de las CGR en retinas lesionadas no difiere según la distancia a la que se practica el ApNO, en las retinas contralaterales existe una pérdida significativa de un 15% que se produce antes cuando la axotomía se realiza más cerca del ojo contralateral. El tratamiento sistémico con minociclina o meloxicam, rescata las CGR en las retinas contralaterales pero no en las retinas lesionadas. Objetivo 3: Las células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo (Ad-CEM) se observan in vivo en el vítreo mediante la OCT hasta 21 días tras el trasplante intravítreo. Ex vivo, las Ad-CEM se encuentran formando una membrana sobre la retina, tanto en retinas intactas como lesionadas. La inyección intravítrea de Ad-CEM no producía toxicidada a las CGR, al menos hasta 21 días tras el trasplante. Los cursos de muerte de las CGR tras ApNO no diferían entre el grupo control y el grupo tratado. Objetivo 4: Tanto las células del CC, como las NS-CC y NS-ZSV sobreviven en la retina formando una membrana epirretiniana sin producir toxicidad en la población de las CGR y provocando un aumento de la supervivencia tras axotomía del NO, con especial atención a las NS-CC que alcanzan un alto porcentaje de supervivencia. Las células del CC y las NS-CC penetran en la capa de células ganglionares de retinas deplecionadas y consiguen diferenciarse en células Brn3a+ y Neun+, mientras que las NS-ZSV tienen menos capacidad diferenciadora pero consiguen penetrar hasta la capa nuclear interna. Objetivo 5: El déficit de las proteínas que conforman el inflamasoma NLRP3 no provoca ningún cambio en el número total de las CGR cuantificadas comparadas con las retinas silvestres. En las retinas ASC-/- y NLRP3-/- no se observa ninguna diferencia en el curso de muerte de las CGR tras ApNO comparado con las retinas silvestres. El grupo Casp1/11-/- existe una supervivencia de hasta un 50% de las CGR comparado con retinas silvestres a 9 y 21 días tras lesión. Objetivo 6: Tras ApNO, hay un aumento de la expresión génica de TNFR1 y TNFα. El tratamiento, tanto sistémico como directo, con el antagonista del TNFR1 (R7050) aumenta la supervivencia de las CGR tras axotomía. El BDNF y el tratamiento combinatorio (R7050 y BDNF) producen un gran efecto neuroprotector en las CGR tras axotomía, tanto a 5 como a 14 días tras ApNO. Objetivo 7: El tratamiento con agonistas de RARα y de RARβ promueve la supervivencia de las CGR tras ApNO, con inyecciones intravítreas o intraperitoneales diarias. Una inyección intravítrea de BDNF tras ApNO neuroprotege parte de las CGR hasta 45 días post-lesión.

INTRODUCTION: The retina is an extension of the Central Nervous System (CNS) and is easily accessible which makes it a unique model of the general Nervous System. The retinal ganglion cells (RGCs) form the optic nerve (ON) and send visual information to the brain. CNS neurons are unable to divide, so there is no possibility to form new neurons and replacing those that are damaged. The ON lesion causes the degeneration of a large part of the RGC population in two phases, a quick in the first 14 days and a slow one, and that there is a response in the contralateral eye. In rats, it has been documented that the time course of death in RGCs varies depending on the distance at which ON is sectioned from the eyeball. Microglia cells play an essential role in the innate immune response and neuroinflammation in the CNS. Neurotrophic factors are endogenous growth factors necessary for the survival of neurons. Retinoids represent a family of vitamin A-derived compounds, which have been shown to play a role in both proliferation and differentiation in adult neurogenesis. Minocycline is a tetracycline antibiotic that relieves inflammatory response and provides neuroprotection. Stem cell therapy is an ideal tool for CNS repair, as stem cells are capable of self-regenerating and differentiating into other cell types, as well as secreting various factors that promote neuron survival.

OBJECTIVES: The general objectives of this thesis are: i/ to characterize organotypic retinal cultures as a model for the study of the RGC population; ii/ to analyze the behavior of the RGC death curve after injury at two different distances, both in the injured eye and in the contralateral eye; iii/ to study the survival of stromal cells derived from adipose tissue after intravitreal injection, and their role in the course of RGC death after axotomy; iv/ to study the behaviour of ciliary body cells (CB), their neurospheres (NS-CB), the neurospheres of subventricular zone cells (NS-SVZ) and ESR1 embryonic cells, after injection into the vitreous in axotomized and depleted retinas v/ to analyse the role of NLRP3 inflammatory proteins in RGCs; vi/ to analyze the role of TNFR1 antagonism in the survival of RGCs in axotomized retinas; vii/ preliminary neuroprotective studies of retinoic acid receptor agonism and the long-term study of BDNF.

MATERIALS AND METHODS: For the accomplishment of the experiments were used: male pigmented mice (C57BL/6) with a weight between 25-35g, male pigmented transgenic mice with expression of the green fluorescent protein under the promoter of the actin, KO mice of the NLRP3 protein, KO mice of the ASC protein and KO mice of the Caspase 1/11 protein, with ages between 8 and 12 weeks of age. The number of retinas analyzed by group/stretch/time interval varies between the different studies from 4 to 20. A model of axonal damage of the RGCs was performed: by ON crush (ONC). ONC was performed 0.5 mm or 2 mm from the eyeball. Analysis times after axotomy ranged from 3 days to 4 months. The drugs or cells were administered by intravitreal or intraperitoneal injection. The anatomical analysis of the retinas was carried out mainly on complete retinas dissected at the immunodetected plane with antibodies α-Brn3a or Rbpms (RGCs), α-Iba-1 (microglia), α-GFAP (astrocytes), α-NeuN (neurons) and α-GFP. Some retinas were dissected fresh to analyze the mRNA level by quantitative polymerase chain reaction or to perform organotypic retinal cultures (ORC). The samples were photographed with an epifluorescence microscope and a confocal microscope. The retinal photomontages were reconstructed from 154 single images (11x14) captured with the 20x lens. Brn3a+-RGCs were quantified and topographic maps were studied using automatic routines. RESULTS AND CONCLUSIONS. Objective 1: In the ORCs there is a loss in the first 24 hours of approximately 60% of the RGCs, followed by a gradual phase of loss up to 21 days of cultivation. This course resembles the pattern of death observed in vivo, but 2-3 times faster. The retina in ORCs suffers a degeneration in all its layers as more time passes in the culture. Objective 2: Although the course of RGC loss in injured retinas does not differ according to the distance at which ONC is performed, in contralateral retinas there is a significant loss of 15% that occurs earlier when axotomy is performed closer to the contralateral eye. Systemic treatment with minocycline or meloxicam rescues RGCs in contralateral retinas but not in injured retinas. Objective 3: Mesenchymal stromal cells derived from adipose tissue (Ad-MEC) are observed in vivo in the vitreous by OCT up to 21 days after intravitreal transplantation. Ex vivo, Ad-MEC are found forming a membrane over the retina, both in intact and injured retinas. Intravitreal injection of Ad-MEC did not produce toxicity to the RGCs, at least until 21 days after transplantation. RGC death course after ONC did not differ between the control group and the treated group. Objective 4: Both CB, NS-CB and NS-SVZ cells survive in the retina forming an epirretinal membrane without producing toxicity in the RGC population and causing an increase in survival after ON axotomy, with special attention to NS-CB which achieve a high percentage of survival. CB and NS-CB cells penetrate the ganglionic layer of depleted retinal cells and are able to differentiate into Brn3a+ and Neun+ cells, while NS-SVZ have less differentiating capacity but are able to penetrate up to the internal nuclear layer. Objective 5: The deficit of the NLRP3 inflammatory proteins does not cause any change in the total number of quantified RGCs compared to wild retinas. In the retinas ASC-/- and NLRP3-/- no difference is observed in the course of RGC death after ONC compared to the wild type retinas. The Casp1/11-/- group has a survival of up to 50% of RGCs compared to wild retinas at 9 and 21 days after injury. Objective 6: After ONC, there is an increase in the gene expression of TNFR1 and TNFα. Both systemic and direct treatment with the TNFR1 antagonist (R7050) increases RGC survival after axotomy. BDNF and double treatment (R7050 and BDNF) produce a great neuroprotective effect in RGC after axotomy, both at 5 and 14 days after ONC. Objective 7: Treatment with agonists from RARα and RARβ promotes the survival of RGCs after ONC, with daily intravitreal or intraperitoneal injections. An intravitreal injection of BDNF after ONC neuroprotects part of the RGCs up to 45 days post-injury.