Por favor, use este identificador para citar o enlazar este ítem: http://hdl.handle.net/10201/85108

Título: Análisis estructural y funcional de la proteína de la cápsida del virus del mosaico del pepino dulce
Fecha de publicación: 7-ene-2020
Fecha de defensa / creación: 28-nov-2019
Editorial: Universidad de Murcia
Materias relacionadas: CDU::5 - Ciencias puras y naturales::57 - Biología::577 - Bioquímica. Biología molecular. Biofísica
Palabras clave: Plantas
Resumen: En este trabajo se ha estudiado la proteína de la cápsida (CP) del virus del mosaico del pepino dulce (PepMV) bajo un punto de vista estructural y funcional. PepMV es un virus filamentoso flexuoso que pertenece al género Potexvirus y a la familia Alphaflexiviridae. Es el causante de una enfermedad que afecta a cultivos de tomate por todo el mundo y provoca importantes pérdidas económicas. Además del interés agronómico, PepMV ha despertado interés biotecnológico y existe un importante arsenal de clones basados en PepMV con diferentes usos potenciales y que facilitan el estudio de la biología del virus. En el capítulo 1 se presenta y discute la estructura de la partícula de PepMV resuelta por criomicroscopía electreónica (crioEM) con una resolución de 3.9 Å. La arquitectura de PepMV es una hélice levógira formada por CPs que protegen el RNA viral. El mapa tridimensional (3D) casi a nivel atómico ha permitido el modelado de la CP, del RNA viral y de su interacción. La CP de PepMV se puede dividir en tres regiones: un brazo N terminal flexible, una región central rica en hélices alfa, y una extensión C terminal. Se ha identificado un bolsillo de interacción con el RNA en la región central de la CP, y se ha determinado que en el contacto lateral entre CPs participa el brazo N terminal que se aloja en un surco hidrofóbico de la región central de la CP vecina. Estudios funcionales in vivo de varias CPs mutadas en aminoácidos del bolsillo de interacción con el RNA y en el brazo N terminal confirmaron la implicación de varios residuos en la unión al RNA y en la oligomerización de la CP durante el movimiento célula a célula y el ensamblaje del virión. Por otro lado, en este capítulo también se ha puesto el foco en la identificación de un origen de encapsidación (OAS) de PepMV. Se han purificado partículas similares a virus (virus-like particles, VLPs) a partir de hojas de N. benthamiana que expresaban la CP y un RNA heterólogo que contenía el OAS de PepMV. El OAS se ha mapeado en una región corta del extremo 5’ del RNA genómico de PepMV y su estructura secundaria se ha determinado a partir de RNAs in vitro y ex virio mediante SHAPE. En la segunda parte de este trabajo se han identificado dos proteínas de tomate que interaccionan con la CP de PepMV mediante un escrutinio por doble híbrido en levadura (yeast-two hybrid, Y2H) de una genoteca de cDNA normalizada. Por motivos de confidencialidad, en este resumen llamaremos a estas proteínas IP24 e IP10. Las dos interacciones fueron confirmadas por coinmunoprecipitación (CoIP) y la interacción CPIP24 fue también confirmada por Y2H dirigido. Además, IP0 fue también identificada en el escrutinio por Y2H como interactor de la proteína 1 del bloque de tres genes (TGB1) de PepMV. La interacción TGB1-IP10 fue confirmada tanto por CoIP como por Y2H dirigido. Para analizar si IP24 o IP10 tienen un papel en la biología de PepMV, se generaron plantas Mmicro-Tom editadas en los genes que codifican IP24 e IP0 mediante la tecnología CRISPR/Cas9. Las plantas mutantes defectivas en el gen que codifica IP24 mostraron una pérdida de susceptibilidad a PepMV, lo que indica que IP24 es un factor proviral. Por otro lado, no se observaron diferencias de acumulación de PepMV entre las plantas defectivas en el gen que codifica IP10 y las plantas de genotipo salvaje. Sin embargo, plantas editadas en el gen que codifica un parálogo de IP10 (IP11), para el que hay evidencias de que interaccione con TGB1, mostraron pérdida de susceptibilidad a PepMV. A continuación, se localizaron subcelularmente las proteínas de interés mediante microscopía láser confocal de células vivas para tratar de inferir sus funciones en el ciclo infectivo de PepMV. IP24 colocalizó con la CP en los complejos de replicación de virus (VRCs) lo que sugiere su posible implicación en la replicación viral. IP10 también fue reclutada a los VRCs, pero no así IP11. Por otro lado, IP10 e IP11 colocalizaron con la TGB1 en el interior del canal de los plasmodesmos (PDs), lo que sugiere que ambas proteínas participen en el movimiento célula a célula del virus. This work focuses on the coat protein (CP) of pepino mosaic virus (PepMV), which has been analysed from structural and functional points of view. PepMV is a flexuous filamentous plant virus belonging to the genus Potexvirus within the family Alphaflexiviridae. PepMV has significant agronomic importance because it induces a disease affecting tomato crops causing important economic losses worldwide. PepMV has also raised recent biotechnological interest, and a PepMV-based clone tool-box is available for different potential uses facilitating the study of the PepMV biology. The cryoEM structure of PepMV virions at 3.9 Å of resolution is shown and discussed in the first chapter of this work. The PepMV particle is built by thousands of CPs arranged in a left-handed helix fashion protecting the viral RNA. The near-atomic three-dimensional (3D) map allowed accurate modelling of the CP, the viral RNA, and their interaction. The CP has 3 regions: an N-terminal flexible arm, a core, and a Cterminal extension. An RNA binding pocket was identified in the core region of the CP, and the side-by-side contacts between assembled CPs were mediated by the N-terminal arm that interacts with an hydrophobic groove in the core of the neighbouring CP. In vivo functional studies of several CP mutants affecting the RNA binding pocket and the N-terminal arm confirmed the role of several residues in RNA binding and polymerization during cell-to-cell movement and assembly. Further Thesis work in this part focussed on the identification of an origin of assembly (OAS) of PepMV virions. Virus-like particles (VLPs) were purified from plants expressing the PepMV CP and an heterologous RNA containing a putative PepMV OAS. A short region functioning as OAS was identified in the first 87 nucleotides of the viral RNA. The secondary structure of the OAS from in vitro and ex virio RNAs was resolved by SHAPE analysis. In the second part of this work, two tomato proteins interacting with the PepMV CP were identified using a yeast-two hybrid (Y2H) screening of a tomato cDNA normalized library. For confidentiality reasons, in this abstract, these proteins will be called IP24 and IP10. The two interactions were confirmed by coimmunoprecipitation (CoIP) and the CP-IP24 interaction was also confirmed by directed Y2H. Furthermore, IP10 was also identified as an interacting protein of the PepMV triple gene block 1 protein (TGB1) in the Y2H screening. The TGB1-IP10 interaction was confirmed by both CoIP and directed Y2H assays. To analyse if IP24 or IP10 have a role in the PepMV biology, knocked-out Micro-Tom plants were generated using the CRISPR/Cas9 technology. The IP24 knocked-out plants showed loss of susceptibility to PepMV indicating that IP24 is a proviral factor. On the other hand, no difference on the PepMV accumulation was observed between IP10 knocked-out and wildtype plants. However, plants edited in the gene encoding an IP10 paralog (IP11), that is a possible TGB1- interacting protein, showed loss of susceptibility to PepMV. Then, live-cell imaging under the confocal laser scanning microscope was performed to infer possible functions of IP24, IP10 and IP11 during PepMV infection. IP24 colocalized with the CP in the virus replication complexes (VRCs) suggesting a function during virus replication. IP10 was also recruited to VRCs, but not IP11. Both IP10 and IP11 colocalized with TGB1 within the plasmodesmata (PD) channel suggesting that both proteins are implicated in viral cell-to-cell movement.
Autor/es principal/es: Méndez López, Francisco Eduardo
Director/es: Aranda Regules, Miguel Ángel
Facultad/Departamentos/Servicios: Escuela Internacional de Doctorado
Publicado en: Proyecto de investigación:
URI: http://hdl.handle.net/10201/85108
Tipo de documento: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Número páginas / Extensión: 140
Derechos: info:eu-repo/semantics/openAccess
Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International
Aparece en las colecciones:Ciencias

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