Plantas Aromáticas como Aditivos de la Dieta de Peces de Acuicultura : Efectos sobre el Sistema Inmunitario, el Estrés y el Metabolismo

Abstract

La acuicultura es el sector de producción animal para alimentación de más rápido crecimiento en todo el mundo, que ha aumentado durante las últimas décadas y se espera que continúe haciéndolo, contribuyendo en el año 2030 a la producción de casi dos tercios del pescado para la alimentación en todo el mundo. Sin embargo, esta gran actividad que tiene lugar en las piscifactorías también conlleva algunos problemas, entre los que se encuentran una gran cantidad de peces por jaula, el empeoramiento de la calidad del agua, el continuo manejo de los peces y la aparición de heridas, lo que implica la aparición de estrés y efectos negativos sobre el sistema inmunitario, provocando inmunosupresión y la aparición de infecciones que pueden provocar la muerte de los peces y, por lo tanto, causar grandes pérdidas económicas. Por ello, los peces son vacunados y los antibióticos han sido usados hasta hace unos años con el objetivo de mejorar su sistema inmunológico para tratar o prevenir enfermedades o infecciones y disminuyendo su mortalidad, aunque ambos tratamientos pueden tener efectos negativos en los animales, los seres humanos y el medio ambiente. En este sentido, la fitoterapia, que es el uso de plantas medicinales para la prevención o el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades e infecciones, o para mantener una buena salud, se ha convertido en una alternativa muy buena e interesante al uso de antibióticos debido a la gran cantidad de compuestos biológicos (fitoquímicos) que contienen estas plantas, que pueden reemplazarlos como agentes inmunoprofilácticos para estimular el sistema inmunitario y además, no tienen un efecto negativo en los animales, los seres humanos o el medio ambiente. El objetivo de esta Tesis Doctoral es determinar si algunas plantas medicinales o compuestos presentes en ellas son buenos candidatos para la aplicación directa en la acuicultura de peces, y en particular de dorada. Para lograr nuestro objetivo dividimos esta Tesis Doctoral en 3 partes o capítulos. En la primera parte (Capítulo 1) estudiamos el efecto in vitro de diferentes concentraciones (0.001 - 1 mg/mL) de extractos acuosos y etanólicos de cuatro plantas diferentes (orégano, semillas de palmera datilera, verdolaga y moringa) en varios tipos de células de peces y contra bacterias, así como su actividad antioxidante. Se evaluó la toxicidad y la capacidad inmunoestimulante de los extractos de plantas en leucocitos de riñón cefálico y una línea celular de fibroblastos (SAF-1), ambas de dorada, mostrando que concentraciones adecuadas demostraron capacidad inmunoestimulante y promovieron la división celular. Posteriormente, demostramos que los extractos de plantas pueden inhibir el crecimiento de células tumorales, como lo indica el efecto citotóxico contra una línea celular de hepato-carcinoma de pescado (PLHC-1), así como su fuerte actividad antibacteriana contra tres bacterias patógenas de peces (Vibrio harveyi, V. anguillarum y Photobacterium damselae subsp. piscicida). Finalmente, también se estudió la actividad antioxidante de los extractos de plantas, que fue muy alta en algunas de las muestras estudiadas. En la segunda parte (Capítulo 2) estudiamos el efecto in vivo de algunas plantas (orégano, semillas de palmera datilera y cáscara de limón) incluidas como aditivos en la dieta de dorada. Primero evaluamos el efecto sobre el crecimiento, y ninguna de las dietas suplementadas con plantas logró promover la mejora del crecimiento de la dorada, e incluso una de ellas lo disminuyó. Después evaluamos el efecto de la adición de plantas a la dieta sobre el sistema inmunitario innato y adaptativo de la dorada, incluyendo parámetros humorales (inmunoglobulina M [IgM] y actividades hemolítica natural del complemento, lisozima, bactericida, proteasa, antiproteasa y peroxidasa en suero y moco de la piel) y celulares (actividad fagocítica, explosión respiratoria y peroxidasa de leucocitos de riñón cefálico). A su vez, también se estudió el efecto de las plantas sobre la actividad de enzimas antioxidantes del hígado (glutatión reductasa, superóxido dismutasa y catalasa) y la actividad antioxidante total presente en el suero y el moco de la piel. Finalmente, también se estudió la expresión de numerosos genes relacionados con la inmunidad en riñón cefálico y genes antioxidantes en hígado. En general, se obtuvieron resultados positivos tanto en la respuesta inmune humoral y celular como en la expresión génica, así como una tendencia a mejorar el estado antioxidante de los peces. Finalmente, también se consideró el efecto de la piel de limón sobre el metabolismo de los peces y se observó que su adición tenía algún efecto negativo o perjudicial en el metabolismo. En la tercera parte (Capítulo 3) estudiamos los efectos in vitro e in vivo de compuestos idénticos a los naturales (NICs) ("fitoquímicos artificiales"). En primer lugar, los fitoquímicos mostraron in vitro una actividad antibacteriana muy fuerte contra V. harveyi y V. anguillarum, pero no mostraron efectos adversos sobre la viabilidad y la respuesta inmune de los leucocitos de riñón cefálico de dorada. En segundo lugar, probamos los efectos de la adición de diversas concentraciones de una mezcla de NICs a la dieta de dorada sobre el crecimiento y el estado inmunitario y oxidativo de los peces después de desafiarlos con una infección bacteriana o no, mejorando la mezcla de NICs el crecimiento y los parámetros inmunitarios de la dorada.

Aquaculture is the fastest growing animal food production sector worldwide, which has increased during the last decades and is expected to continue doing it contributing in the year 2030 almost two thirds of fish for food worldwide. However, this great activity that takes place in the fish farms also entails some problems among which are a large number of fish per cage, the worsening of the quality of the water, the handling of fish and the appearance of wounds, which implies the appearance of stress and negative effect on the immune system, provoking immunosuppression and the appearance of infections that can lead to the death of fish and therefore cause large economic losses. That is why fish are vaccinated and antibiotics have been used until a few years ago with the aim of improving the fish immune system to treat or prevent diseases or infections and their mortality, although both treatments may have negative effects in animals, humans and environment. In this sense, phytotherapy, that is the use of medicinal plants for the prevention or treatment of a wide variety of diseases and infections, or to maintain good health, has become a very good and interesting alternative to the use of antibiotics due to biological compounds they contain (phytochemicals), which can replace them as immuno-prophylactic agents to stimulate the immune system and also do not present negative impact on animals, humans or the environment. The aim of this Doctoral Thesis is to determine if some medicinal plants, or compounds present in them are possible for direct application in fish aquaculture, and in particular of gilthead seabream. To get our objective we divided this Doctoral Thesis in 3 parts or chapters. First part (Chapter 1): we studied the in vitro effect of different concentrations (0.001 – 1 mg/mL) of aqueous and ethanolic extracts from four different plants (oregano, date palm, purslane and moringa) on several fish cell types and against bacteria as well as their antioxidant activity. Toxicity and immunostimulatory capacity of plant extracts on gilthead seabream head-kidney (HK) leucocyte and a fibroblast cell line (SAF-1) was evaluated obtaining that adequate concentrations showed immunostimulatory capacity and promoted cell division. Afterwards, we demonstrate that plant extracts are able to inhibit the growth of tumor cells, as indicated by the toxicity against a fish hepato-carcinoma cell line (PLHC-1), as well as their strong antibacterial activity against three pathogenic fish bacteria (Vibrio harveyi, V. anguillarum and Photobacterium damselae subsp. piscicida). Finally, antioxidant activity of plant extracts was also studied and was very high in some of the studied samples. Second part (Chapter 2): we studied the dietary in vivo effect of some plants (oregano, date palm seeds and lemon peel) as feed additives on gilthead seabream. All the plant-supplemented diets failed to promote the seabream growth performance, and even one of them decreased it. After that, we evaluated the effect of the addition of plants on the innate and adaptive immune system of gilthead seabream, including humoral (immunoglobulin M [IgM] level, natural haemolytiyc complement, lysozyme, bactericidal, protease, antiprotease and peroxidase activities in serum and skin mucus) and cellular (HK leucocyte phagocytic, respiratory burst and peroxidase activities) parameters. In turn, the effect of plants was also studied on the activity of liver antioxidant enzymes (glutathione reductase, superoxide dismutase and catalase) and the total antioxidant activity present in serum and skin mucus. Finally, the expression of numerous HK immune-related genes and liver antioxidant genes was also studied. Positive results were obtained at both humoral and cellular immune responses and gene expression, as well as a tendency to improve the oxidative status of the fish.Finally, the effect of lemon peel on fish metabolism was also considered and it was observed that its addition had any negative or harmful effect in fish metabolism. Third part (Chapter 3): we studied the in vitro and in vivo effects of compounds identical to natural (NICs) ones (“artificial phytochemicals”). First, phytochemicals showed, in vitro, a very strong antibacterial activity against V. harveyi and V. anguillarum but no adverse effects on gilthead seabream HK leucocyte viability or immune responses. Secondly, we tested the dietary effects of various concentrations of a mixture of NICs on gilthead seabream growth performance and immune and oxidative status after challenging with a bacterial infection or not. The mixture of NICs improved the fish growth and the immune parameters of gilthead seabream.