Avances en la leishmaniosis canina con énfasis en el uso de muestras de saliva

Abstract

Esta tesis como compendio de publicaciones fue concebida para profundizar en el estudio del desarrollo de ensayos que permitieran el uso de muestras de saliva para diagnosticar leishmaniosis en perros. Los objetivos fueron: (1) desarrollar y validar un ensayo ultrasensible para la cuantificación de anticuerpos anti-Leishmania que permitiera su medición en suero y saliva de perro; (2) evaluar la utilidad del nuevo ensayo con muestras de suero y saliva para monitorizar el tratamiento frente a leishmaniosis canina (LCan); (3) evaluar la relación entre los niveles de anticuerpos anti-Leishmania en suero de perro medidos con el nuevo ensayo y por un ELISA comercial y la concentración de proteínas de fase aguda; (4) evaluar, mediante el nuevo ensayo, la cinética de los niveles de IgG2 e IgA anti-Leishmania en suero y saliva de perros infectados experimentalmente con L. infantum durante un año de seguimiento; (5) estudiar el posible ritmo circadiano en los niveles de IgG2 e IgA anti-Leishmania en suero y saliva de perros infectados experimentalmente; (6) y desarrollar y validar una PCR a tiempo real para la cuantificación de ADN de Leishmania spp. en saliva canina. La precisión, la exactitud y la sensibilidad analítica de cada ensayo fueron evaluadas mediante los coeficientes de variación intra- e inter-ensayo, la linealidad bajo dilución, el porcentaje de recuperación y el estudio de correlación, y los límites de detección y cuantificación. Para ello, se recogieron muestras de suero y saliva de perros seronegativos y seropositivos a Leishmania spp. Para evaluar la utilidad de los TR-IFMAs en suero en la monitorización del tratamiento se obtuvieron muestras de suero de 16 perros seropositivos a Leishmania spp. en el momento del diagnóstico y tras 30 y 180 días de tratamiento. Del mismo modo, para evaluar la utilidad de los TR-IFMAs en la monitorización del tratamiento con muestras de saliva, se recogieron muestras de suero y saliva de 20 perros con signos clínicos compatibles con LCan en el momento del diagnóstico y después de 30 días de tratamiento. También se usaron 205 muestras de suero para evaluar la correlación entre TR-IFMA y un ELISA comercial y la concentración de proteínas de fase aguda en el momento del diagnóstico de LCan y durante la monitorización del tratamiento. Para estudiar la cinética de los niveles de anticuerpos anti-Leishmania se tomaron mensualmente durante 1 año muestras de suero y saliva de 11 perros infectados experimentalmente con Leishmania infantum y se analizaron por TR-IFMA. Para evaluar el posible ritmo circadiano en los niveles de anticuerpos anti-Leishmania, muestras de suero y saliva de 6 perros infectados experimentalmente que presentaban signos clínicos compatibles con LCan se recogieron a intervalos de 4 horas durante un periodo de 16 horas en dos días consecutivos. Finalmente, para el desarrollo y validación de una PCR a tiempo real para la detección de ADN de Leishmania spp. en saliva de perro se recogieron salivas de 16 perros infectados experimentalmente pre-infección y 16 semanas post-infección. Las conclusiones de esta tesis doctoral son: 1. Los ensayos inmunofluorométricos desarrollados en esta tesis doctoral permiten la cuantificación de anticuerpos IgG2 e IgA anti-Leishmania en suero y saliva de perro, siendo los niveles más elevados en perros seropositivos. Se observó solapamiento en los niveles de IgA anti-Leishmania entre seropositivos y seronegativos. 2. Los ensayos desarrollados detectan disminuciones en los niveles de IgG2 e IgA anti-Leishmania en suero y saliva de perros después del tratamiento, asociado con mejoría clínica. 3. El ensayo desarrollado para detectar IgG2 anti-Leishmania mostró mayor correlación con los resultados de CRP y ferritina en perros tratados que el ELISA. 4. Los niveles de IgG2 e IgA anti-Leishmania en suero y saliva de perros aumentan por encima del punto de corte del ensayo TR-IFMA tras la infección experimental. Además, el TR-IFMA desarrollado para la detección de IgG2 anti-Leishmania ofrece mejor valor diagnóstico que el desarrollado para IgA anti-Leishmania. 5. No se ha observado ritmo circadiano en los niveles de IgG2 e IgA anti-Leishmania tanto en suero como en saliva de perros con LCan en un periodo de 16 horas en dos días consecutivos. Además, se han observado mayores variaciones en los niveles de estos anticuerpos en saliva que en suero. 6. La PCR a tiempo real desarrollada permite la cuantificación de ADN del cinetoplasto de Leishmania spp. en saliva de perros infectados experimentalmente con L. infantum. No obstante, hay que tener en cuenta que la sensibilidad del ensayo en saliva es menor que en médula ósea.

This PhD thesis as a compendium of publications was conceived to go in-depth on the study of the development of assays that could allow the use of saliva samples to diagnose leishmaniosis in dogs. The objectives were: (1) to develop and validate an ultrasensitive assay for anti-Leishmania antibodies quantification that could allow their measurement in serum and saliva of dogs; (2) to evaluate the usefulness of the assay for anti-Leishmania antibodies measurement in both serum and saliva samples as a tool for monitoring the treatment of canine leishmaniosis (CanL); (3) to assess the possible relationship between serum anti-Leishmania antibody levels measured by the new assay and by a commercially-available ELISA kit and the concentration of acute phase proteins; (4) to evaluate and compare the kinetics of anti-Leishmania IgG2 and IgA by the new assay in serum and saliva from experimentally infected dogs with L. infantum during one-year follow-up; (5) to assess the possible circadian rhythm of anti-Leishmania IgG2 and IgA levels in serum and saliva from experimentally infected dogs; and (6) to develop and validate a qPCR for quantification of Leishmania spp. DNA in canine saliva. Precision, accuracy and analytical sensitivity were evaluated by the coefficients of variation intra- and inter-assay, linearity under dilution, percentage of recovery and correlation study, and limits of detection and limits of quantification to validate the new assays. For that, serum and saliva samples from Leishmania-seronegative and Leishmania-seropositive dogs were collected. To evaluate the usefulness of the TR-IFMAs for treatment monitoring, serum samples were obtained from 16 Leishmania-seropositive dogs at the time of diagnosis and after 30 and 180 days of treatment. As well as, to evaluate the utility of the TR-IFMAs for treatment monitoring using saliva samples, serum and saliva samples were collected from 20 dogs with clinical signs compatible with CanL at the time of diagnosis and after 30 days of treatment. Also, 205 serum samples were evaluated to study the correlation between the TR-IFMA, a commercial ELISA and the concentration of acute phase proteins in dogs at the time of diagnosis and during treatment monitoring. To study the kinetics of anti-Leishmania antibody levels, 11 dogs were infected with Leishmania infantum. After, serum and saliva samples were monthly collected during 1-year and analyzed by TR-IFMAs. To assess the possible circadian rhythm in the levels of anti-Leishmania antibodies serum and saliva of 6 dogs experimentally infected presenting clinical signs of CanL were collected during a 16-h period at 4-h intervals on two consecutive days. Finally, to develop and validate a qPCR for the detection of Leishmania spp. DNA in saliva of dogs, saliva samples from 16 dogs experimentally infected were collected pre-infection and at 16-weeks post-infection. The conclusions of this PhD thesis are: 1. The immunofluorometric assays developed in this PhD thesis allow the quantification of anti-Leishmania IgG2 and IgA in canine serum and saliva samples in a reliable way. An overlap between seropositive and seronegative dogs was observed for IgA. 2. The assays developed detect decreases in anti-Leishmania IgG2 and IgA levels in serum and saliva from dogs with clinical leishmaniosis after treatment, which is associated with clinical improvement. 3. The assay developed for anti-Leishmania IgG2 is more correlated with CRP and ferritin concentrations than the ELISA results in treated dogs. 4. Levels of anti-Leishmania IgG2 and IgA in canine serum and saliva increase after experimental infection, surpassing the cut-off approximately one month earlier in serum than in saliva. Anti-Leishmania IgG2 shows better diagnostic value than IgA. 5. No circadian rhythm is observed for anti-Leishmania IgG2 and IgA levels in both serum and saliva samples of dogs with CanL during a 16 h-period. Additionally, higher intra-individual variations in the specific antibody levels are observed in saliva than in serum. 6. The qPCR assay developed allows the quantification of Leishmania kDNA in saliva samples of experimentally infected dogs with L. infantum. However, the sensitivity of this assay in the saliva is lower than in bone marrow.