Detección y caracterización de virus epidemiológicamente relevantes en cultivos de tomate y cucurbitáceas

Abstract

El tomate y las cucurbitáceas se encuentran entre las hortalizas cultivadas más importantes y España es uno de sus principales productores mundiales. Las virosis suponen una seria amenaza pare estos cultivos y pueden llegar a producir importantes pérdidas económicas a nivel mundial. Dada la dificultad para controlar las enfermedades virales, es esencial disponer de técnicas de detección adecuadas que permitan, no sólo monitorizar el desarrollo de una enfermedad, sino implementar adecuadamente medidas preventivas y de contención. El empleo de variedades resistentes y la utilización de material vegetal libre de virus se encuentran entre las principales medidas de protección contra las virosis. En este contexto se ha desarrollado el trabajo de esta tesis, que está estructurada en dos capítulos. En el primer capítulo se describe un estudio epidemiológico en torno a brotes epidémicos agresivos atribuibles a la enfermedad del rizado amarillo del tomate (Tomato yellow leaf curl disease, TYLCD) en plantas de tomate portadoras de los genes de resistencia a TYLCV, realizado durante los años 2015 y 2016 en Murcia y durante el año 2017 en Almería. Utilizando técnicas de secuenciación masiva (2015) y clonaje y secuenciación de tipo Sanger (2016 y 2017), se determinaron un total de 28 secuencias de TYLCV completas. Los análisis filogenéticos realizados mostraron que todas las secuencias obtenidas pertenecían a aislados de TYLCV de la cepa Israel (TYLCV-IL, familia Geminiviridae, género Tobamovirus). Un primer análisis realizado con las secuencias de 2015 y 2016 mostró la existencia de dos grupos de aislados, uno emparentado con aislados de la cepa Israel antiguos en la zona, y otro grupo, de reciente introducción, emparentado con aislados recombinantes marroquíes, denominados TYLCV-IS76. Un clon infectivo generado a partir de una de las secuencias de este segundo grupo fue utilizado en un ensayo de eficacia biológica frente a un clon de TYLCV-IS76, en el que se observó que en infección mixta predominó IS76, mientras que en infección simple el aislado murciano aventajó al recombinante. En el análisis de las secuencias de 2017, se identificó por primera vez la presencia de aislados del tipo TYLCV-IS76, siendo la única evidencia de aislados recombinantes de este tipo identificados fuera de Marruecos. En el segundo capítulo de esta tesis se describe la puesta a punto de la técnica de RT-qPCR combinada con sondas TaqMan para la detección de 3 virus de cucurbitáceas transmitidos por semilla, el virus del mosaico jaspeado verde del pepino (cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV; familia Virgaviridae, género Tobamovirus), el virus del mosaico de la calabaza (squash mosaic virus, SqMV; familia Secoviridae, género Comovirus) y el virus de las manchas necróticas del melón (melon necrotic spot virus; familia Tombusviridae, género Gammacarmovirus), y su comparación con la técnica de ELISA, que es la principal técnica utilizada en los análisis de certificación. Con esta técnica se pudo detectar a los tres virus con una gran sensibilidad y especificidad, abriendo la posibilidad a la realización de análisis múltiples. La comparación con la técnica ELISA, realizada únicamente con semillas infectadas con SqMV y CGMMV, mostró una sensibilidad superior, a nivel de lote de semilla y a nivel de límite de detección, demostrándose su idoneidad para la utilización en análisis de semilla. En conjunto, los resultados de esta tesis han permitido, por un lado, proporcionar información sobre la situación actual de las epidemias de TYLCV en España, y, por otro lado, diseñar un método rápido y sensible para la detección de 3 virus transmitidos por semilla en cucurbitáceas, abriendo la posibilidad de su implementación en futuros programas de certificación.

Tomatoes and cucurbits are among the most important cultivated vegetables and Spain is one of its main world producers. Virosis pose a serious threat to these crops and can lead to significant economic losses worldwide. Given the difficulty in controlling viral diseases, it is essential to have adequate detection techniques that allow, not only to monitor the development of the disease, but also to adequately implement preventive and containment measures. The use of resistant varieties and the use of plant material free of viruses are among the main measures of protection against viruses. In this context the work of this thesis has been developed, which is structured in two chapters. The first chapter describes an epidemiological study about aggressive outbreaks attributable to tomato yellow leaf curl disease (TYLCD) in tomato plants carrying TYLCV resistance genes. This study was carried out during the years 2015 and 2016 in Murcia and during the year 2017 in Almería. Using Hight throughput sequencing (HTS) techniques (2015) and cloning and Sanger sequencing (2016 and 2017), a total of 28 TYLCV complete sequences were determined. The phylogenetic analyses carried out showed that all sequences belonged to TYLCV isolates of the Israel strain (TYLCV-IL, family: Geminiviridae, genus: Begomovirus). A first analysis made with the sequences of 2015 and 2016 showed the existence of two groups of isolates, one related to ancient isolates preexisting in the area, and another group, recently introduced, related to recombinant Moroccan isolates called TYLCV-IS76. An infectious clone generated from one of the sequences of this second group was used in an efficacy trial versus a TYLCV-IS76 clone, in which was observed that while IS76 predominated in mixed infection, in simple infection the Murcian isolate surpassed the recombinant. In the analysis of the sequences obtained in 2017, the presence of isolates of the TYLCV-IS76 type was identified for the first time, being the only evidence of this type of recombinant isolates outside Morocco. The second chapter of this thesis describes the development of the RT-qPCR technique combined with TaqMan probes for the detection of 3 cucurbit seed-borne viruses, cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) which belongs to Virgaviridae family, genus Tobamovirus, squash mosaic virus (SqMV), a member of the Secoviridae family, genus Comovirus, and melon necrotic spot virus (MNSV) which belongs to Tombusviridae family, genus Gammacarmovirus, and its comparison with the ELISA technique, which is the main technique used in certification analysis. With Taqman technique, the three viruses could be detected with great sensitivity and specificity, opening the possibility for multiplex analyses. The comparison with the ELISA technique, performed only with CGMMV and SqMV infected seeds, showed a higher sensitivity, both at the seed lot and at the detection limit levels, demonstrating its use suitability for seed analysis. Overall, the results of this thesis therein have allowed, on the one hand, to provide information on the current situation of TYLCV epidemics in Spain, and on the other hand, to design a rapid and sensitive method for the detection of 3 seed-borne viruses in cucurbits, opening the possibility of their implementation in future certification programs.