El receptor de melanocortinas 1 (MC1R) como regulador de respuestas de defensa frente al estrés oxidativo, daño inducido por la radiación ultravioleta

Abstract

El gen receptor de melanocortinas 1 (MC1R) se expresa en los melanocitos y codifica para un receptor acoplado a proteínas G (GPCR) activado por MSH. Es un gen de susceptibilidad a melanoma que regula la cantidad y el tipo de pigmento melánico formado por los melanocitos epidérmicos. En respuesta a la radiación ultravioleta (RUV), el principal factor etiológico del melanoma, el MC1R silvestre protege contra la melanomagenesis mediante una combinación de mecanismos dependientes e independientes de la pigmentación. El componente dependiente de la pigmentación de la acción protectora del MC1R viene determinado por un cambio de la feomelanogénesis basal a la eumelanogénesis. La eumelanina es un pigmento fotoprotector debido a su capacidad de absorber RUV y de eliminar radicales libres. Por el contrario, la feomelanina es fotosensibilizante al promover la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y reducir el pool de antioxidantes intracelular. En cuanto a las acciones no pigmentarias, el MC1R silvestre activa enzimas antioxidantes y vías de reparación de ADN. Estos procesos parecen depender de la vía del AMPc y son desencadenados por activación del MC1R silvestre para mantener la estabilidad genómica. Por tanto, la eficiente respuesta de los melanocitos a la RUV depende de la actividad del MC1R. Sin embargo, el papel de las variantes de splicing intergénico y las variantes RHC (red hair color) de tipo “R” asociadas a cáncer de piel, cuyas propiedades funcionales en la regulación de esta respuesta están poco definidas, requiere mayor investigación. El gen que codifica para el MC1R humano presenta un sitio de poly(A) ineficiente dando lugar a proceso de splicing intergénico con su gen vecino aguas abajo Tubulin-β-III (TUBB3). Se han descrito dos MC1R-TUBB3 quimeras denominadas Iso1 e Iso2 que contienen la secuencia completa del MC1R fusionada con las extensiones en C-terminal derivadas de TUBB3, con marco de lectura correcto para Iso1 y alterado para Iso2. La exposición a la RUV promueve un cambio en la expresión de isoformas del MC1R canónico (MC1R-001) hacia las quimeras MC1R-TUBB3, lo que podría dar lugar a nuevos fenotipos necesarios para el bronceado. Para analizar su función, expresamos las isoformas intergénicas marcadas con el epítopo Flag en células heterólogas HEK293T y células de melanoma humano para su caracterización funcional. Iso1 se expresó con el tamaño esperado mientras que Iso2 dio lugar a un doblete de peso molecular significativamente menor al previsto, y presentó baja estabilidad intracelular. Iso1 e Iso2 unieron agonista marcado radiactivamente con la misma afinidad que el MC1R-001, pero su expresión en la membrana plasmática fue reducida. La disminución en la expresión en superficie celular resultó de un tráfico anterógrado aberrante más que de altas tasas de endocitosis. El acoplamiento funcional de ambas isoformas a la vía de señalización por AMPc fue menor que para el MC1R-001, pero la activación de las ERK tras unión a MSH no se vió alterada, lo que sugiere una señalización desequilibrada de las variantes de splicing. En este sentido, estas isoformas presentan un comportamiento similar con muchos alelos de variantes naturales de MC1R asociadas con un fenotipo RHC y con un riesgo incrementado de cáncer de piel. La heterodimerización de las isoformas de splicing con MC1R-001 diferencialmente marcadas y analizadas por co-immunoprecipitación fue eficiente y causó una disminución de los sitios de unión en superficie celular. Por tanto, la inducción de las quimeras MC1R-TUBB3 por la RUV podría contribuir a afinar la respuesta de bronceado al modular la disponibilidad de MC1R y sus parámetros funcionales. Las variantes RHC para MC1R promueven la producción de feomelaninas fotosensibilizantes en oposición a las eumelaninas fotoprotectoras. El MC1R silvestre activa mecanismos de reparación de ADN y defensas antioxidantes de manera dependiente de AMPc. Ya que las variantes de MC1R asociadas a melanoma presentan acoplamiento reducido a la vía de señalización por AMPc se ha postulado que estas acciones no pigmentarias serían defectuosas en células de melanoma humano y melanocitos epidérmicos portadores de variantes de MC1R, en consonancia con una mayor carga mutacional en melanomas con MC1R variante. Comparamos la inducción de enzimas antioxidantes y las respuestas de daño al ADN en células melanocíticas de genotipo definido para MC1R. Además, analizamos la maquinaria enzimática y las vías de señalización responsables de estas acciones protectoras aguas abajo del MC1R. El incremento de expresión de los genes catalasa y superóxido dismutasa tras activación del MC1R fue dependiente de AMPc y requirió MC1R silvestre. Por el contario, el pretratamiento de células melanocíticas con un agonista de MC1R antes de un tratamiento oxidativo con Luperox disminuyó i) acumulación de 8-oxo-7,8-dihydroguanina (8-oxodG), un producto mayoritario del daño oxidativo en ADN, ii) fosforilación de la histona H2AX, un marcador de rotura de doble hebra de ADN y iii) acumulación de rotura de cadena de ADN estimada por ensayos cometa. La reparación de las lesiones oxidativas dependió de la inducción de dos enzimas clave de la vía de reparación por escisión de bases (BER), OGG y APE-1/Ref1, aguas abajo de MC1R. Estas respuestas fueron comparables en células portadoras de MC1R silvestre o células con variantes MC1R sin señalización detectable por la vía del AMPc. En células melanocíticas con genotipo variante para MC1R, las respuestas protectoras de ADN fueron mediadas por AKT vía estimulación de NOX. Por el contrario, en células con MC1R silvestre, el incremento de AMPc aguas abajo de MC1R abolió la activación de AKT, posiblemente por el bloqueo de la producción de ROS intracelular mediada por NOX y fue responsable de inducir las enzimas BER y la reparación de ADN. Por tanto, la activación de MC1R podría promover reparación de lesiones oxidativas en ADN por un mecanismo dependiente de AMPc aguas abajo del receptor silvestre o vía AKT en células con genotipo variante para MC1R. Además, en células con MC1R silvestre, el AMPc induciría eficientemente las enzimas antioxidantes, principalmente catalasa, y las enzimas BER OGG y APE-1/Ref1 mientras que variantes de MC1R aumentarían eficazmente la expresión de las dos enzimas clave de BER pero no parecen tener efecto en los niveles o actividad de catalasa.

The melanocortin 1 receptor (MC1R) gene expressed in melanocytes encodes a G protein-coupled receptor (GPCR) activated by MSH. It is a well-established melanoma susceptibility gene that regulates the amount and type of melanin pigments formed within epidermal melanocytes. In response to ultraviolet radiation (UVR), the main external etiologic factor for melanoma, WT MC1R protects against melanomagenesis by a combination of pigmentation-dependent and independent mechanisms. The pigmentation-dependent component of MC1R protective action is accounted for by a switch from basal pheomelanogenesis to eumelanogenesis. Eumelanin is a photoprotective pigment owing to its absorption properties in the UVR spectrum and its free radical scavenging properties. Conversely, pheomelanin is a photosensitizer promoting reactive oxygen species (ROS) production upon exposure to UVR, and can reduce the intracellular antioxidant pool even in the absence of UVR. Concerning non-pigmentary actions, WT MC1R signaling activates antioxidant enzymes and DNA repair pathways. These processes have been thought to rely on the cAMP-pathway and are triggered by WT MC1R to maintain genomic stability. Accordingly, it is widely accepted that the efficient UVR response of melanocytes is strongly dependent on MC1R activity. Therefore, the role of intergenic splice isoforms and of skin cancer-associated (R-type) variants of poorly defined functional properties in the regulation of this response required further investigation. Human MC1R has an inefficient poly(A) site allowing intergenic splicing with its downstream neighbour TUBB3. Intergenic splicing produces 2 MC1R isoforms, Iso1 and Iso2, bearing the complete seven transmembrane helices from MC1R fused to TUBB3-derived C-terminal extensions, in-frame for Iso1 and out-of-frame for Iso2. Exposure to UVR might promote an isoform switch from canonical MC1R (MC1R-001) to the MC1R-TUBB3 chimeras, which might lead to novel phenotypes required for tanning. We expressed the Flag epitope-tagged intergenic isoforms in heterologous HEK293T cells and HMCs, for functional characterization. Iso1 was expressed with the expected size. Iso2 yielded a doublet of Mr significantly lower than predicted, and impaired intracellular stability. Iso1 and Iso2 bound radiolabeled agonist with the same affinity as MC1R-001, but their plasma membrane expression was strongly reduced. Decreased surface expression mostly resulted from aberrant forward trafficking, rather than high rates of endocytosis. Functional coupling of both isoforms to cAMP was lower than WT, but ERK activation upon binding of MSH was not impaired, suggesting imbalanced signaling from the splice variants. Heterodimerization of differentially labelled MC1R-001 with the splicing isoforms analyzed by co-immunoprecipitation was efficient and caused decreased surface expression of binding sites. Thus, UVR-induced MC1R isoforms might contribute to fine-tune the tanning response by modulating MC1R-001 availability and functional parameters. Accordingly, these isoforms show a similar behavior to many natural MC1R variant alleles associated with the RHC phenotype and with increased skin cancer risk. However, the possible role of R variants in protecting against UVR-induced DNA damage by pigment-independent mechanisms remained to be determined. MC1R variants associated with increased melanoma risk promote production of photosensitizing pheomelanins as opposed to photoprotective eumelanins. WT MC1R activates DNA repair and antioxidant defenses in a cAMP-dependent fashion. Since melanoma-associated MC1R variants are hypomorphic in cAMP signaling, these non-pigmentary actions are thought to be defective in MC1R-variant human melanoma cells and epidermal melanocytes, consistent with a higher mutation load in MC1R-variant melanomas. We compared induction of antioxidant enzymes and DNA damage responses in melanocytic cells of defined MC1R genotype. We also analyzed the enzymatic machinery and signaling pathway(s) responsible for these protective responses downstream of MC1R. Increased expression of CAT and superoxide dismutase (SOD1) genes following MC1R activation was cAMP-dependent and required a WT MC1R genotype. Conversely, pretreatment of melanocytic cells with an MC1R agonist before an oxidative challenge with Luperox decreased i) accumulation of 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxodG), a major product of oxidative DNA damage, ii) phosphorylation of histone H2AX, a marker of DNA double strand breaks and iii) accumulation of DNA breaks as estimated with comet assays. The repair of oxidative lesions was accounted for by induction of two key BER enzymes OGG and APE-1/Ref1 downstream of MC1R. These responses were comparable in cells WT for MC1R or harboring hypomorphic MC1R variants without detectable cAMP signaling. In MC1R-variant melanocytic cells, the DNA-protective responses were mediated by AKT via NOX stimulation. Conversely, in MC1R-WT melanocytic cells, high cAMP production downstream of MC1R blocked AKT activation, likely by blocking NOX-dependent increases in intracellular ROS, and was responsible for inducing BER enzymes and DNA repair. Accordingly, MC1R activation could promote repair of oxidative DNA damage by a cAMP-dependent pathway downstream of WT receptor, or via AKT in cells of variant MC1R genotype. Moreover, in MC1R-WT cells cAMP would efficiently induce antioxidant enzymes, mainly catalase, and the BER enzymes OGG and APE-1/Ref1 whereas variant MC1R would augment efficiently the expression of the two key BER enzymes but should have no effect on catalase levels or activity.