Role of prostaglandins in the immune system of gilthead seabream (sparus aurata L.)

Abstract

El sistema inmunitario de los peces teleósteos ha sido ampliamente estudiado durante décadas, sin embargo, aún hay mucho por investigar, especialmente aquello que concierne al papel de las prostanglandinas (PGs) y sus rutas de señalización. La dorada (Sparus aurata L.), es un pez teleósteo extensamente usado como modelo animal de investigación de la respuesta inmune de peces. Sin embargo, existen pocos estudios referentes al papel de las PGs en los fagocitos de dorada. Así, el objetivo de la presente tesis es dilucidar el papel de las PGs durante la respuesta inmunitaria de doradas. En el primer capítulo, anotamos y caracterizamos molecularmente dos genes (PGDS1 y PGDS2). Dichos genes muestran una elevada similitud con la enzima Prostaglandina D sintetasa (PGDS) tipo lipocalina de mamíferos, implicada en la síntesis de PGD2. Se analizaron los niveles de mRNA de ambos genes en diferentes tejidos de dorada retadas o no con el patógeno Vibrio anguillarum así como en muestras de GAs estimulados. Los resultados mostraron que ambos genes se expresaban en todos los tejidos analizados y que sus niveles se modulaban en los distintos tejidos tras el reto. Además, la estimulación de los GAs resultó en un incremento de los niveles de pgds1 con una cinética similar a la producción de PGD2 por dichas células. Finalmente, se determinó el efecto de la PGD2, en determinadas funciones de los GAs. Los resultados mostraron que la PGD2, reducía tanto la producción de ROS como los niveles de transcripción de citoquinas por los GAs. Estos resultados nos sugieren que la PGD2, probablemente sintetizada por la enzima PGDS1, podría desempeñar un papel clave en la resolución de la inflamación en GAs de dorada. En el segundo capítulo estudiamos el papel de la PGE2 en la respuesta inmunitaria de dorada in vivo e in vitro. El análisis de los niveles de mRNA de los genes implicados en el metabolismo de la PGE2 en distintos tejidos y en células fagocíticas, así como su modulación tras el reto con V.anguillarum o estimulación con VaDNA, respectivamente. Los resultados mostraron mayores niveles de pges (implicado en la síntesis de PGE2) en los órganos inmunitarios tras el reto, así como en fagocitos estimulados. Mientras que los niveles de hpgd (implicado en su degradación), fueron menores en los tejidos inmunitarios de doradas sometidas al reto. Además, la PGE2 ejerció una inhibición de la producción de ROS y de citoquinas en GAs estimulados con VaDNA. Sin embargo, macrófagos estimulados y tratados con PGE2 mostraron incrementados los niveles de mRNA de IL10, MRC1 y ARG2, marcadores asociados al fenotipo M2. Además, la PGE2 señaliza a través de la ruta cAMP/PKA/CREB en macrófagos de dorada. Estos resultados nos indican que la PGE2, podría desarrollar un papel importante en la regulación de la inflamación en dorada. Finalmente, en el tercer capítulo, determinamos los efectos de la 15dPGJ2 y su ruta de señalización en GAs de dorada. Para ello, los GAs fueron estimulados con VaDNA y tratados con la 15dPGJ2 y con distintos análogos de la misma, así como con agonistas y antagonistas de PPARγ. Los resultados mostraron que la 15dPGJ2 inhibía la producción de ROS y los niveles de transcripción de citoquinas en GAs estimulados. Así mismo, los análogos de 15dPGJ2 y agonistas de PPARγ reproducían el efecto de la 15dPGJ2 en cuanto a la producción de ROS. Además, dicho efecto era revertido por los antagonistas de PPARγ. Estos resultados muestran que la 15dPGJ2 posee un papel anti-inflamatorio en la resolución de la inflamación de GAs de dorada y que podría señalizar a través de PPARγ, así como por unión covalente a proteínas.

The immune system of teleost fish has been widely studied for decades but, much is still unknown, especially concerning the role of prostaglandins (PGs) and their signaling pathways. The gilthead seabream (Sparus aurata L.), is a marine teleost fish widely used as a research animal model for better understanding the fish immune response. Despite this, few studies have been focused on the role of PGs in gilthead seabream phagocytes. Within this framework, the aim of this thesis is to advance our knowledge of the role of PGs in the immune response of the gilthead seabream. In the first chapter, we study the molecular characterization of two genes (pgds1 and pgds2) which deduced amino acid sequences show high degree of similarity to mammalian Lipocalin-PGDS involved in PGD2 synthesis. Tissues samples of seabream juveniles challenged or not with the pathogen Vibrio anguillarum or AGs stimulated with PAMPS were analyzed by RT-qPCR. The results showed that both genes were expressed in all tissues and their expression were modulated upon bacterial challenge in almost all tissues examined. However, pgds1, but not pgds2, was detected in AGs which expression was upregulated by stimulation with PAMPs with the same kinetics than PGD2 by this cell type, as was determined by enzyme immunoassay. Finally, to determine the effects of PGD2 in the main functions of AGs, control or stimulated AGs were cultured with PGD2. The results showed that treatment of AGs with PGD2 results in decreased ROS production and cytokine expression. These results provide us evidences that PGD2, probably synthesized by PGDS1, could play a key role in the resolution of inflammation by AGs in gilthead seabream. In the second chapter, we analyzed by RT-qPCR the expression profile of genes involved on PGE2 metabolism in tissue samples of seabream juveniles challenged or not with Vibrio anguillarum and phagocytes activated with genomic DNA from V. anguillarum (VaDNA) were analyzed by RT-qPCR. The results showed that pges (involved in PGE2 synthesis) was expressed in all tissues examined as well as in phagocytes and its expression was up-regulated in all immune organs upon bacterial challenge and in phagocytes stimulated with VaDNA. In contrast, the mRNA levels of hpgd (involved in PGE2 catabolism) were lower in all tissues tested from challenged fishes. In addition, the effect of PGE2 in the main functions of AGs was analyzed. Treatment of stimulated AGs with PGE2 resulted in decreased ROS production and cytokine expression. In contrast, treatment of stimulated macrophage with PGE2 resulted in increased mRNA levels of il10, mrc1 and arg2 and decreased il6 ones, resulting in a M2 phenotype. Furthermore, PGE2 signaled through the cAMP/PKA/CREB pathway in seabream macrophages. These results points to PGE2, could play a key role in the regulation of inflammation in gilthead seabream. Finally, in the third chapter, we determine the effects of 15deoxy-Δ12,14-PGJ2 (15dPGJ2) and its signaling pathway in seabream AGs. 15dPGJ2 is a cyclopentenone PG derivated from PGD2 that can signal through PPARγ, DP2 receptor or can act by covalent binding to proteins. For this purpose, seabream AGs were stimulated with VaDNA and treated with 15dPGJ2, with 15dPGJ2 analogs, and with PPARγ agonists and antagonist. The results showed that 15dPGJ2 decreased ROS production and cytokine expression in stimulated AGs. Similarly, PG analogs and PPARγ agonist were able to mimic the effects of 15dPGJ2 in ROS production by stimulated AGs. Besides, those effects were reversed by PPARγ antagonists. These results show that, 15dPGJ2 could have an anti-inflammatory role in the resolution of the inflammation in gilthead seabream which signal both, through protein covalent binding and PPARγ activation.