UPLC-QTOF-MS-Untargeted metabolomics to expalain enzymatic browning of fresh-cut lettuce

Abstract

Metabolómica no dirigida por UPLC-QTOF-MS para explicar el pardeamiento enzimático en lechuga fresca cortada La lechuga es el vegetal más popular cultivado a escala comercial. Un conocimiento detallado de su fisiología, tecnología y bioquímica es clave para una correcta producción, procesamiento y distribución comercial para garantizar un producto de alta calidad. Las nuevas tendencias de consumo y una mayor preocupación por una dieta saludable han llevado a un aumento en la demanda mundial de lechugas frescas en sus ensaladas listas para comer, lo que hace que la lechuga sea la principal materia prima para la industria de procesamiento de frescos. Uno de los principales problemas a los que se enfrenta la industria al comercializar lechugas frescas es el pardeamiento enzimático, que es el principal responsable de la pérdida de calidad después del corte y conduce al rechazo del producto por parte del consumidor. El objetivo principal de esta Tesis fue la identificación de los metabolitos que podrían explicar el pardeamiento enzimático y la selección de aquellos que podrían actuar como biomarcadores para la selección de cultivares de lechuga con menos susceptibilidad al pardeamiento. Para este propósito, se llevó a cabo un análisis de metabolómica no dirigido mediante UPLC-ESI-QTOF-MS. Para alcanzar este objetivo, fue esencial el desarrollo de una metodología sólida para el análisis de metabolómica no dirigida, objetivo incluido en el Capítulo IV. El análisis de metabolómica no dirigida fue capaz de explorar el metaboloma completo de los cultivares de lechuga con diferentes susceptibilidades al pardeamiento y detectar diferencias en los perfiles metabólicos asociados con el pardeamiento antes y después de su desarrollo. El desarrollo de esta metodología incluyó la construcción de una base de datos específica de metabolitos de lechuga, que permitió la identificación de metabolitos específicos durante los diferentes estudios realizados en esta tesis. Los primeros análisis permitieron correlacionar el pardeamiento enzimático y el perfil metabólico que incluía aminoácidos, compuestos fenólicos, lactonas sesquiterpénicas y derivados de ácidos grasos. La identificación preliminar de estos metabolitos pertenecientes a diferentes grupos metabólicos sugirió que era necesario un estudio del papel de los diferentes metabolitos en el desarrollo del pardeamiento. La identificación de metabolitos asociados con el desarrollo de pardeamiento, incluidos compuestos fenólicos, lisofosfolípidos y derivados oxidados de ácidos grasos (oxilipinas), que también son intermedios en la biosíntesis del ácido jasmómico, permitió la interpretación de la ruta biosintética siguiendo una secuencia lógica de eventos metabólicos que empezaban con la herida que daña las membranas celulares durante el proceso de corte, la generación y propagación de las señales y la inducción de la biosíntesis de compuestos fenólicos que son sustratos de las enzimas que conducen al pardeamiento. Los resultados del estudio cinético en respuesta a la herida inducida por el corte y los cambios durante el almacenamiento en los diferentes metabolitos identificados como señales, así como los metabolitos intermedios y finales se incluyen en el Capítulo V. Los resultados mostraron que se observó una mayor susceptibilidad al pardeamiento. directamente asociado con una mayor velocidad en la respuesta de la herida y en la biosíntesis de metabolitos de la vía del ácido jasmónico, que incluyen los compuestos fenólicos que son sustratos de la enzima polifenol oxidasa. Estos resultados sugirieron el estudio del impacto de la genética en los cambios en los metabolitos asociados con el pardeamiento a través del estudio de diferentes cultivares. En el Capítulo VI se estudiaron treinta cultivares de lechuga romana con diferente susceptibilidad al pardeamiento recolectadas en tres fechas consecutivas. Los resultados mostraron que hubo una gran variabilidad en la susceptibilidad al pardeamiento del mismo cultivar cuando se cosechó en diferentes fechas y, por lo tanto, el impacto potencial de los factores ambientales y de desarrollo que afectan la susceptibilidad al pardeamiento. El estudio permitió la selección de algunos metabolitos que podrían actuar como biomarcadores del pardeamiento enzimático. Los resultados incluidos en el Capítulo VI sugirieron que la proporción entre los metabolitos fenólicos que son sustratos de pardeamiento enzimático (sustratos de PPO) y aquellos que no son sustratos (inhibidores de la PPO, o precursores de la formación de lignina), podría utilizarse para predecir el nivel de desarrollo del pardeamiento de un cultivar dado. En este sentido, se estableció que la proporción basal de aciod cafeoilquinico / ferulato de metilo (ácido clorogénico / FAME), identificadas tentativamente, se correlacionó con un mayor desarrollo de pardeamiento después del corte y tras almacenamiento. Esta ratio predijo el nivel de susceptibilidad al pardeamiento en más del 70% de los cultivares de estudiados y provocó la necesidad de su validación como biomarcador. Los resultados obtenidos en el estudio de diferentes cultivares y diferentes fechas de cosecha, incluidas en el Capítulo VI, también sugirio que la etapa de desarrollo de la lechuga también podría desempeñar un papel relevante en el pardeamiento, ya que una etapa más inmadura podría llevar a un desarrollo de pardeamiento más bajo. Estos resultados sugirieron que los niveles basales de los metabolitos fenólicos que son sustratos de pardeamiento podrían estar afectados por la etapa de desarrollo de la planta y esto podría afectar el mecanismo de la respuesta de la herida y, finalmente, el desarrollo del pardeamiento. Por lo tanto, en el Capítulo VII, se evaluaron específicamente los cambios metabólicos asociados con la susceptibilidad al pardeamiento de lechuga en dos etapas diferentes de desarrollo que diferían en solo dos semanas entre la cosecha. Los metabolitos asociados con la susceptibilidad al pardeamiento de la lechuga se identificaron y validaron en el Capítulo VII mediante un enfoque metabolómico dirigido para la identificación de los biomarcadores. El análisis dirigido permitió la identificación de sinapaldehído (m/z 207.0663), que fue identificado tentativamente como ferulato de metilo en el Capítulo VI, y su 4--D-glucósido y 4--D-(6'-malónico) Conjugados glucósidos. Además, los derivados de ácido cafeoilquinico se identificaron como isómeros de ácido clorogénico (ácidos 5-trans-caffeoilquinico, y 5-cis-caffeoil-quinico). Los resultados mostraron que la etapa de desarrollo de la lechuga afectó directamente el proceso de pardeamiento y los metabolitos relacionados, siendo la susceptibilidad al pardeamiento más pequeña en las muestras recolectadas anteriormente y aumentando cuando las muestras se recolectaron con una etapa de desarrollo más avanzada. Los resultados incluidos en el Capítulo VII confirmaron estos biomarcadores y la validación del ratio de isómeros de ácido clorogénico / sinapladehído y sus conjugados en veinticuatro cultivares de lechuga romana recién cortada para predecir la susceptibilidad al pardeamiento.

UPLC-QTOF-MS-Untargeted metabolomics to explain enzymatic browning of fresh-cut lettuce. Lettuce is the most popular vegetable grown on a commercial scale. A detailed knowledge of its physiology, technology and biochemistry is key for a correct production, processing and commercial distribution to guarantee a high quality product. The new trends of consumption and a higher concern about a healthy diet have led to an increase in the world demand for fresh-cut lettuce as ready to eat mix salads, what makes lettuce the main raw material for the fresh-cut processing industry. One of the main problems that the industry faces at when commercializing fresh-cut lettuce is the enzymatic browning, which is the main responsible for the quality loss after cutting that often leads to consumer rejection of the product. The main objective of this Thesis was the identification of the metabolites that could explain the enzymatic browning and the selection of those that could act as biomarkers for the selection of lettuce cultivars for the industrial processing with less susceptibility to develop browning. For this purpose, an untargeted metabolomics approach with an UPLC-ESI-QTOF-MS was carried out. To reach this objective, an essential requirement was the development of a robust methodology for the untargeted metabolomics analysis, which was the objective included in Chapter IV. The untargeted metabolomics analysis was able to explore the whole metabolome of lettuce cultivars with different browning susceptibilities and to detect differences in the metabolic profiles associated with browning before and after its development. The setup of this methodology included building a specific database of lettuce metabolites, which allowed the identification of specific metabolites of this plant species during the different studies carried out in this Thesis. The first analyses allowed the correlation between enzymatic browning and the metabolic profile which included amino acids, phenolic compounds, sesquiterpene lactones, and fatty acid derivatives. The preliminary identification of these metabolites belonging to different metabolic groups suggested that a study of the role of the different metabolites in browning development was needed. The identification of metabolites associated with browning development including phenolic compounds, lysophospholipids, and oxidixed derivatives of fatty acids (oxylipins), that also are intermediates in the jasmomic acid biosynthesis, allowed the interpretation of the biosynthetic pathway following a logical sequence of metabolic events that were initiated with the wound damage damaging the cell membranes during the cutting process, the generation and propagation of the wound signals, and the induction of the biosynthesis of phenolic compounds that are substrates of the enzymes leading to browning. The results of the kinetic study in response to the cut-induced wounding and the changes during storage on the different metabolites identified as signals, as well as the intermediate and final metabolites are included in Chapter V. The results showed that a higher browning susceptibility was directly associated with a higher speed in the wound response, in the biosynthesis of metabolites of the jasmonic acid pathway, which include the phenolic compounds that are substrates of the enzyme polyphenol oxidase. These results suggested the need of understanding the impact of genetics on the changes in the metabolites associated with browning through de study of different cultivars. In Chapter VI thirty Romaine lettuce cultivars with different browning susceptibility harvested at three consecutive dates were studied. The results showed that there was a large variability in the browning susceptibility of the same cultivar when harvested at different dates, and therefore, the potential impact of environmental and development factors affecting the browning susceptibility. The study allowed the selection of some metabolites that could act as biomarkers of enzymatic browning. The results included in Chapter VI suggested that the ratio between phenolic metabolites that are substrates of enzymatic browning (PPO substrates) and those that are not substrates (PPO inhibitors, or precursors of lignin formation), could be used to predict the level of browning development of a given cultivar. In this sense, it was established that the basal ratio of caffeoyl quinic/ferulate methyl ester (chlorogenic acid/FAME), both tentatively identified, correlated with a higher browning development after cutting and five days of storage. This ratio predicted the browning susceptibility level in more than 70% of the lettuce cultivars studied and prompted the need for its validation as a biomarker. The results obtained on the browning susceptibility of different cultivars at different harvests dates included in Chapter VI also suggested that the lettuce development stage could also play a relevant role in browning as a more immature stage could led to a lower browning development. These results suggested that the basal levels of the phenolic metabolites that are substrates of the browning enzymes could be influenced by the plant development stage and this could affect the mechanism of the wound-response and finally the browning development. Therefore, in Chapter VII, the metabolic changes associated with lettuce browning susceptibility at two different development stages which differed in only two weeks between harvest were specifically evaluated. The metabolites associated with lettuce browning susceptibility were identified and validated in the Chapter VII by a targeted metabolomics approach for the whole characterization as biomarkers. The targeted analysis allowed the identification of sinapaldehyde (m/z 207.0663), that was tentatively identified as ferulic acid methyl ester in Chapter VI, and its 4--D-glucoside and 4--D-(6’-malonyl) glucoside conjugates. In addition, the caffeoyl quinic derivatives were identified as chlorogenic acid isomers (5-trans-caffeoyl quinic, and 5-cis-caffeoyl-quinic acids). The results showed that the lettuce development stage affected directly the browning process and the related metabolites, being the browning susceptibility smaller in the samples harvested earlier, and increasing when the samples were harvested with a more advanced development stage. Results included in Chapter VII confirmed these biomarkers and the validation of the ratio chlorogenic acid isomers/sinapladehyde and conjugates in twenty-four cultivars of fresh-cut Romaine lettuce to predict browning susceptibility.