La biosíntesis de trehalosa como potencial diana antifúngica en candida albicans

Abstract

Introducción: En las últimas décadas se ha producido un enorme incremento de las infecciones causadas por hongos, siendo el género Candida el agente etiológico con mayor prevalencia, afectando en mayor medida a la población humana de mayor edad o aquejada por algún tipo de inmunodeficiencia. De hecho, Candida albicans es la cuarta causa de infecciones nosocomiales. La quimioterapia antifúngica necesita el desarrollo de compuestos más potentes, seguros y con menor toxicidad. En este contexto, el disacárido no reductor trehalosa ha sido propuesto como una interesante diana terapéutica para el diseño de nuevos antifúngicos. Objetivos: Con el fin de profundizar en esta hipótesis, hemos examinado en el patógeno oportunista Candida albicans, el nivel de susceptibilidad que presentan los mutantes homocigóticos deficientes en los dos genes que codifican las etapas secuenciales en la biosíntesis de trehalose, denominados respectivamente como trehalosa sintasa (TPS1) y trehalosa fosfatasa (TPS2), frente a los siguientes antifúngicos de uso clínico: Anfotericina B (AmB), Micafungina (MF) y Fluconazol (Flz).

Métodos: En el transcurso del trabajo experimental, se ha llevado a cabo la determinación de varios parámetros fisiológicos y bioquímicos. En concreto, podemos destacar el recuento de células viables y la sensibilidad en placa, la medida de la producción intracelular de ROS, el potencial de membrana mitocondrial, el contenido de trehalosa y la formación de biofilms. Mencionar igualmente, el ensayo de enzimas antioxidantes, junto con la extracción y metilación de extractos lipídicos.

Resultados: Mientras el mutante tps1Δ se comportó como muy sensible frente a la exposición con AmB, mostró un significativo nivel de resistencia a MF. Curiosamente, el fenotipo opuesto se registró en el mutante tps2Δ. A su vez, la MF promovió un cierto incremento en la producción endógena de ROS en la cepa parental SC5314 y en células tps2Δ, mientras la formación de ROS en el mutante tps1Δ fue virtualmente indetectable. En este mismo mutante tps1Δ el tratamiento con Flz mostró una ligera susceptibilidad que no puede considerarse relevante. El nivel endógeno de ROS se correlaciona positivamente con la actividad mitocondrial. La aplicación de Flz no causó variaciones de importancia en la generación de estrés oxidativo en ninguna de las levaduras analizadas.

Tan sólo AmB fue capaz de promover la síntesis intracelular neta de trehalosa en la cepa parental SC5314, mientras el disacárido estaba ausente en células tps1Δ y mostró valores residuales en las tps2Δ, confirmando que otras fosfatasas citosólicas distintas a la enzima tps2p pueden llevar a cabo la defosforilación de trehalosa-6P in C. albicans. Además, la capacidad de ambos mutantes tps1Δ y tps2Δ para formar biofilms experimentó una drástica disminución tras el tratamiento con AmB; si bien experimentó un ligero aumento en células tps1Δ después de añadir MF. Los análisis de los respectivos perfiles lipídicos no fueron concluyentes, sin que ninguna evidencia pueda ser aportada, por el momento, que permita explicar la diferente sensibilidad a los antifúngicos de las cepas de C. albicans bajo estudio.

Conclusión: Nuestros datos aportan consistencia a la idea de utilizar trehalosa como una interesante diana para nuevas terapias antifúngicas.

Abstract

Introduction: The fungal infections have dramatically increased in the last decades, being the genus Candida the most prevalent etiological agent, which mainly affect to the immnunocompromised and aging human population. In fact, Candida albicans being the fourth etiological agent of nosocomial infections. The antifungal chemotherapy needs the development of safer, more potent and less toxic compounds. In this context, the non-reducing disaccharide trehalose has been proposed as a promising target for the design of new antifungals.

Objectives: To further explore this hypothesis, we have examined in the opportunistic pathogen Candida albicans the degree of susceptibility shown by null mutants disrupted in the two genes coding for the sequential steps of trehalose biosynthesis, namely trehalose synthase (TPS1) and trehalose phosphatase (TPS2), to Amphotericin B (AmB), Micafungin (MF) and Fluconazol (Flz).

Methods: We have carried the determination of several physiological and biochemical parameters. We remark the cell viability and sensitivity in plate, the measurement of intracellular ROS, mitochondrial membrane potential and the trehalose content and formation of biofilms. Furthermore, the assays of antioxidant enzymes and the fat extraction and methylation of the lipid extract.

Results: While tps1Δ mutant was highly sensitive to AmB exposure, it displayed a significant level of resistance to MF. Notably, the opposite phenotype was recorded in the tps2Δ mutant. In turn, MF induced a significant level of endogenous ROS production in the parental SC5314 strain and tps2Δ cells, whereas ROS formation in the tps1Δ mutant was virtually undetectable. In turn, the tps1Δ cells after Flz treatment showed a slight susceptibility, which was not relevant.The level of endogenous ROS positively correlated with the mitochondrial activity. The application of Flz did not cause variations in the generation of oxidative stress in the yeasts analyzed.

Only AmB was able to promote the net intracellular synthesis of trehalose in the parental strain SC5314, although it was absent from tps1Δ cells and showed only low levels in tps2Δ, confirming that other phosphatases distinct of tps2p can bring about the dephosphorylation of trehalose-6P in C. albicans. Furthermore, the capacity of both tps1Δ and tps2Δ mutants to form biofilms was drastically reduced after treatment with AmB, although it increased in tps1Δ cells after the addition of MF. The analyses of the lipid profile were not conclusive. No evidence could be found that can explain the different susceptibility to the antifungals of the C. albicans strains used in this study.

Conclusion: Our data lend weight to the idea of using trehalose as a target for antifungal therapy.