Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10201/71428

Title: Metabolismo de los compuestos cianogénicos y desarrollo de marcadores moleculares para el amargor en el almendro [Prunus dulcis (Miller) D. A. Webb]
Other Titles: Metabolism of cyanogenic compounds and development of molecular markers for bitterness in almond [Prunus dulcis (Miller) D. A. Webb]
Issue Date: 31-May-2019
Date of creation: 7-Jul-2016
Publisher: Universidad de Murcia
Related subjects: CDU::6 - Ciencias aplicadas::63 - Agricultura. Silvicultura. Zootecnia. Caza. Pesca::634 - Horticultura. Viticultura
Keywords: Almendro
Abstract: El almendro (Prunus dulcis Miller) es una especie del género Prunus originario de Asia Central. Es uno de los frutales de hueso más importantes tanto en producción como en superficie cultivada, siendo Estados Unidos el principal productor mundial con diferencia. España ocupa el tercer puesto mundial, siendo Murcia una de las regiones más importantes. Aunque la mayoría de las variedades cultivadas actualmente son dulces, los almendros silvestres de los que procede la especie cultivada eran amargos. Los glucósidos cianogénicos son los responsables del amargor de la almendra. Estos metabolitos secundarios son compuestos de defensa de muchas plantas entre las que se encuentran las rosáceas. En el almendro podemos encontrar dos glucósidos cianogénicos: la prunasina y la amigdalina. El amargor es un carácter monogénico, cuyo gen responsable (Sk, sweet kernel) se encuentra ubicado en el grupo de ligamiento 5 del genoma del almendro, aunque su localización precisa y función aún no ha sido determinada. La mayoría de variedades comerciales de almendro son heterocigóticas para el sabor amargo, por lo que cuando en los programas de mejora se cruzan, el 25% de los descendientes dará frutos amargos. Actualmente, el mejorador debe de esperar 3 ó 4 años a que los árboles entren en producción para determinar el sabor de sus almendras. Por ello sería de gran interés disponer de marcadores moleculares para este carácter, que permitieran la SAM (Selección Asistida por Marcadores), durante el primer año de vida de las plantas mediante una sencilla PCR, ahorrando tiempo y dinero y mejorando la eficiencia de los programas de mejora. Los objetivos de la presente tesis son el estudio de la evolución de los glucósidos cianogénicos durante el desarrollo de la flor, la saturación con marcadores moleculares la región del grupo de ligamiento 5 donde se encuentra el locus Sk y el análisis del trascriptoma de almendros dulces y amargos mediante el estudio de la expresión diferencial de genes candidatos y por último la caracterización de enzimas de la ruta del amargor y determinar las diferencias entre cultivares dulces y amargos. El primer capítulo analiza la relación entre la época de floración y la presencia de compuestos cianogénicos en la flor. Para ello hemos estudiado la evolución de los glucósidos cianogénicos en flores desde el letargo invernal de las yemas hasta la apertura de la flor, en variedades dulces y amargas de distinta época de floración, mediante extracciones de metanol y el posterior análisis por LC-MS (Liquid chromatography–mass spectrometry). La prunasina y la amigdalina fueron detectadas por primera vez en las yemas florales de las cinco variedades de almendro estudiadas. Estos glucósidos cianogénicos también fueron detectados en distintas partes de la flor: sépalos, pétalos, pistilos y polen, siendo el polen el tejido con mayor concentración de prunasina. Por primera vez fueron observados en las flores algunos compuestos (amidas, anitrilos, ácidos, pentosas) derivados de la prunasina. Todos parecen estar implicados en una ruta alternativa sin liberación de cianuro (el cual dañaría a la planta) y con la producción final de nitrógeno, reutilizable por la propia planta. El objetivo del segundo capítulo es desarrollar un marcador molecular ligado al sabor amargo de la semilla saturando el Sk locus, para realizar una selección asistida por marcadores que pueda ser utilizada en los programas de mejora. Para ello se desarrollaron tres estrategias relacionadas: 1) saturación del Sk locus con nuevos marcadores tipo SSRs y CAPs basados en SNPs. 2) Resecuenciación de dos genotipos de almendro, uno dulce Lauranne y otro amargo S3067. 3) Experimento RNA-seq del tegumento de los dos genotipos anteriormente mencionados en dos puntos diferentes del desarrollo del fruto. Para ello, marcadores CAPs y SSRs fueron utilizados para genotipar la descendencia R1000 x Desmayo. Estos marcadores cubrieron una región de cerca de 800 kb. Gracias a la colinearidad entre el melocotón y el almendro, se detectaron el GL5 del melocotón once genes candidatos en una región de 95.76 kb. Por lo tanto y como principal conclusión de la saturación del GL5, hemos conseguido saturar la zona del Sk locus desde los 3,6 Mb hasta los 61 kb. Entonces queríamos saber si estos genes candidatos también estaban presentes en almendro. Para ello la segunda y tercera estrategia consistió en la evaluación de un genoma dulce y otro amargo y los transcriptomas del tegumento de ambos. En primer lugar se llevó a cabo una resecuenciación del genoma integrando los datos de los marcadores con el nuevo transcriptoma. Tomamos el genotipo amargo como el de referencia. Para profundizar en estos genes abordamos el estudio transcriptómico mediante la técnica del RNA-seq, que reveló la existencia de dos grupos de genes candidatos para el Sk locus. El primero estaba compuesto por tres miembros de la familia MYC de factores de transcripción. El segundo estuvo conformado por enzimas que podrían tener una función en el metabolismo de la amigdalina: una hidrolasa, un citocromo P450 y una glioxal oxidasa. Se detectaron diferencias de expresión de estos genes entre dulces y amargos y además de nuevos SNPs dentro de estos genes candidatos, estos resultados están siendo analizados. El tercer capítulo está dedicado al estudio de las enzimas implicadas en la ruta del amargor para determinar su implicación en el sabor dulce o amargo del almendro. Por todo ello, se estudiaron dos trascriptomas del tegumento en un genotipo dulce y otro amargo, ya que en este tejido maternal fue detectada una acumulación de prunasina en el genotipo amargo pero no en los dulces (Sánchez-Pérez et al., 2008). Los resultados mostraron la expresión diferencial de diferentes genes candidatos para CYP79, CYP71, algunas glucosiltransferasas y una prunasina hidrolasa. Respecto a la ruta de degradación nos centramos en las prunasinas hidrolasas, obteniendo las secuencias de putativas prunasinas hidrolasas de dos cultivares dulces y uno amargo en tres tejidos diferentes (tegumento, nucela y cotiledón) mediante clonación en Escherichia coli. Se observaron diferencias de un solo nucleótido (SNPs) entre algunas secuencias, pero no relacionadas con el sabor dulce o amargo. Estos genes se expresaron en Agrobacterium tumefaciens y, aunque se observó actividad prunasina hidrolasa y β-glucosidasa, tampoco se observaron diferencias entre dulces y amargos. Como principal conclusión cabe destacar que por primera vez se han caracterizado prunasinas hidrolasas en almendros dulces y amargos, pero no se han encontrado diferencias entre los mismos. Por otro lado, respecto a las enzimas anabólicas relacionadas con el amargor del almendro, cuatro putativas glucosiltransferasas fueron caracterizadas en el cotiledón de cultivares amargos, pero sólo uno de ellos fue capaz de producir prunasina y el otro sólo amigdalina, los otros dos produjeron prunasina y amigdalina. Como conclusión principal, por primera vez, se han caracterizado varios clones de la enzima anabólica glucosiltransferasa 2, que transforma la prunasina en amigdalina.
The almond (Prunus dulcis Miller) is a species of the Prunus genus originally from Central Asia. It is one of the most important stone fruits both in production and cultivated surface, being USA the main world producer by far. Spain occupies the third world place, being Murcia one of the most important regions. Although the most of the cultivated varieties nowadays are sweet, the wild almonds of which the cultivated species is originated were bitter. The cyanogenic glucosides are the responsible for the bitterness of the almond. These secondary metabolites are defense compounds of plants among which are Rosaceae. In the almond we can find two cyanogenic glucosides: prunasin and amygdalin. The bitterness is a monogenic trait, whose responsible gene (Sk, sweet kernel) is located in the linkage group five of the almond genome, although its accurate location and function have not been determined yet. The most of the commercial varieties are heterozygous for the bitter taste, therefore when in the breeding program they are crossed, 25% of the seedlings will be bitter. Nowadays, the breeder has to wait 3 o 4 years to the tree enter in production to determine the seed taste. For this it would be very interesting to have molecular markers for this trait, which allowed the MAS (Marker Assistant Selection) during the first year of the plants trough a simple PCR, saving time and money and improving the efficiency of the breeding programs. The objectives of the present thesis are the study of the evolution of the cyanogenic glucosides during the flower development, the fine mapping with molecular markers of the linkage five region where the Sk locus is found and the analysis of the transcriptome of sweet and bitter almonds through the study of the differential expression of candidate genes and finally the characterization of enzymes in the bitterness pathway and determine the differences between sweet and bitter cultivars. The first Chapter analyzes the relation between the flowering time and the presence of the cyanogenic compounds in the flower. For this we have studied the evolution of the cyanogenic glucosides in flowers from the dormancy breaking of the buds to the flowering time, en sweet and bitter varieties of different flowering times, through methanol extractions and analysis by LC-MS (Liquid chromatography–mass spectrometry). The prunasin and the amygdalin were detected for first time in the flower buds of the five varieties of the almond studied. These cyanogenic glucosides also were detected in different parts of the flower: sepals, petals, pistils and pollen, being pollen the tissue with the highest concentration of prunasin. For first time some compounds were observed in flowers (amides, anitriles, acids and pentoses) derivates of the prunasin. All seem to be involve in an alternative route without cyanide release (which can damage the plant) and with the final production of nitrogen, reused by the own plant. The objective of the second Chapter is to develop a molecular marker bound to the bitter taste of the kernel fine mapping the Sk locus, to perform a marker assistant selection that can be used in the breeding programs. For this three related strategies were developed: 1) Fine mapping of the Sk locus with new markers SSRs and CAPs based on SNPs. 2) Resequencing of two almond genotypes, one sweet Lauranne and another S3067. 3) RNA-seq experiment of the tegument of these two genotypes in two different times of the kernel development. For that, CAPs and SSRs markers were used for genotyping the offspring R1000 x Desmayo. These markers covered a region around 800 kb. Thanks to the collinearity between the peach and the almond, eleven candidate genes were detected in the linkage group five of the peach in a region of 95.76 kb. Therefore and as a main conclusion of the linkage five fine mapping, we have achieved to saturate the Sk locus form 3.6 Mb to 61 kb. Then we wanted to know if these candidate genes were also present in the almond.For that, the second and third strategy consisted in the evaluation of a sweet and a bitter genome and the transcriptome of the tegument of both. In first place a resequencing of the genome was carried out integrating the data of the markers with the new transcriptome. We take the bitter genotype as a reference. In order to deep in these genes we approach the transcriptomic study trough the RNA-seq technique, which revealed the existence of two groups of candidate genes for the Sk locus. The first was composed by three members of the MYC family of transcription factors. The second was composed by enzymes that could have a function in the amygdalin metabolism: one hydrolase, one cytochrome P450 and one glyoxal oxidase. Differences in the expression of these genes were detected between sweet and bitter and moreover new SNPs were found inside these candidate genes, these results are being analyzed. The third chapter is dedicated to the study of the enzymes involved in the bitterness pathway to determine their implication in the sweet or bitter taste of the almond. For all of this, two transcriptomes of the tegument were studied in a sweet and a bitter genotype, since in this maternal tissue was detected an accumulation of prunasin in the bitter genotype but not in the sweet one (Sánchez-Pérez et al., 2008). The results showed the differential expression of different candidate genes for CYP79, CYP71, some glucosyltransferases and one prunasin hydrolase. Respect to the degradation route we focused in the prunasin hydrolases, obtaining the sequences of putative prunasin hydrolases of two sweet cultivars and one bitter in the three different tissues (tegument, nucellus and cotyledon) by clonation in Escherichia coli. Differences were observed of only one nucleotide (SNPs) between some sequences, but not related with the sweet or bitter taste. These genes were expressed in Agrobacterium tumefaciens and, although prunasin hydrolase and β-glucosidase activity was observed, no differences between sweet and bitter were observed. As the main conclusion, for first time prunasin hydrolases were characterized in sweet and bitter almonds, but differences were not found between them.On other hand, respect to the anabolic enzymes related with the almond bitterness, four putative glucosyltransferases were characterized in the cotyledon of the bitter cultivars, but only of them was able to produce prunasin and the other amygdalin, the other two produced prunasina and amygdalin. As a main conclusion, for first time several clones of the anabolic enzyme glcosyltransferase 2 were detected.
Primary author: Cueto Chocano, Jorge Luis del
Director: Sánchez Pérez, Raquel
Dicenta López-Higuera, Federico
Faculty / Departments / Services: Facultad de Biología
Published in: Proyecto de investigación:
URI: http://hdl.handle.net/10201/71428
Document type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Number of pages / Extensions: 198
Rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International
Appears in Collections:Ciencias

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Jorge Luis del Cueto Chocano Tesis Doctoral.pdf9,15 MBAdobe PDFView/Open


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons