Metalofármacos no convencionales de Pt(II), Ru(II) e Ir(III): síntesis, actividad antitumoral y estudios de mecanismo de acción

Abstract

La finalidad de este proyecto ha sido el diseño de nuevos metalofármacos antitumorales no convencionales de Pt(II), Ru(II) e Ir(III) con un mecanismo de acción dual y/o alternativo como opción para el tratamiento de tumores resistentes al fármaco de referencia cisplatino. La metodología de trabajo se basa en cuatro etapas claramente diferenciadas. En primer lugar, se lleva a cabo el diseño y la síntesis de los compuestos, los cuales son caracterizados por espectrometría de masas, análisis elemental, espectroscopia de RMN y rayos X. En un segundo paso, se estudia su estabilidad por RMN o RP-HPLC en DMSO, condiciones pseudofisiológicas y/o medio de cultivo. A continuación se evalúa la actividad antitumoral en distintas líneas tumorales humanas, habitualmente de carcinoma de ovario humano sensible (A2780) y resistente a cisplatino (A2780cisR). Por último, se verifica si el mecanismo de acción encaja con aquello para lo cual fue diseñado el fármaco. El Capítulo 2 abarca la optimización de fármacos organometálicos monofuncionales de Pt(II) basados en arilmetanaminas. En primer lugar, y mediante un estudio de la relación estructura-actividad de compuestos con fórmula general [Pt(dmba-R)LCl] (dmba = N,N-dimetilbencilamina; R = MeO, Me, H, Br, F, CF3 y NO2 en las posiciones R5 o R4 del anillo de fenilo del ligando C^N quelato; L = DMSO y P(C6H4CF3-p)3), se identificó a los compuestos [Pt(dmba-R)(DMSO)Cl] como los primeros complejos de Pt(II) con una actividad dual citotóxica y antiangiogénica. A continuación, se ajustó la lipofilia de estos compuestos con el fin de potenciar las posibles interacciones metalofármaco-proteína que pudieran estar implicadas en el mecanismo de inhibición de angiogénesis. Para ello, se modificó la aromaticidad del ligando C^N quelato (C^N = N,N-dimetil-1-(2-aril)metanamina-2C2,N; aril = fenil, bifenil, p-terfenil, naftil, antracenil, pirenil). Este estudio demuestra que la hidrofobicidad y acumulación celular de los compuestos está relacionada con la citotoxicidad; y que los derivados más activos, bifenilo y naftilo, actúan como agentes de disrupción vascular in vivo. Por otro lado, se modificó el modo de acción de los precursores monofuncionales por introducción de ligandos diimina quelato (N^N = bpy, phen, dpq, dppz, dppn) sobre el fragmento {Pt(dmba)}. Así, se obtuvo una serie de complejos intercaladores, activos frente a cinco líneas tumorales distintas y capaces de suprimir el crecimiento tumoral en esferoides 3D con valores comparables del índice MCR al del cisplatino. Además, la estructura cristalina de [Pt(dmba)(dppn)]NO3 revela que la presencia del ligando C^N quelato le confiere quiralidad λ/δ al centro de Pt(II), proporcionándole una interesante selectividad por ADN de secuencias ricas en AT. Por último, se estudió la conjugación del complejo [Pt(dmba)(DMSO)Cl] a distintas biomoléculas (péptido c(RGDfK) o esteroides) con el fin de conseguir un reparto y acumulación específica del fármaco antitumoral. Mientras la funcionalización con el péptido en la posición 4 del ligando C^N da lugar a un compuesto inactivo, la funcionalización con esteroides (etisterona o levonorgestrel) en el ligando auxiliar 7-azaindol en complejos de tipo [Pt(dmba)Cl(L)] da lugar a bioconjugados más activos que cisplatino en la línea de mama hormonalmente dependiente T47D. En el Capítulo 3 se han estudiado estrategias innovadoras basadas en complejos polipiridilo de Ru(II). Por un lado, se pone de manifiesto la importancia de la geometría en la actividad biológica de complejos de Ru(II). A diferencia de los requisitos geométricos encontrados para los fármacos de Pt(II), los complejos más activos de Ru(II) son aquellos que presentan una geometría trans. Esto parece estar relacionado con la desactivación del isómero cis por reacción con el medio o biomoléculas no esenciales. Por otro lado, se diseñaron pro-fármacos del tipo [Ru(bpy)2L2]2+, donde L es un inhibidor del citocromo P450. Los pro-fármacos, inactivos en la oscuridad, actúan como un “cocktail de fármacos” tras ser fotoactivados con luz azul. Mientras que L se libera y actúa de una forma espacio-temporal controlada como un inhibidor del citocromo P450, el centro metálico coordinativamente insaturado es capaz de dañar el ADN. En el Capítulo 4 se describe un método de conjugación en fase sólida del complejo [Ir(ppz)2(N^N)]+ (Hppz = 1-fenilpirazol; N^N = metil 1-butil-2-piridil-benzimidazol-5-carboxilato) a dos péptidos agonistas de somatostatina, octeotride y su análogo dicarba. La bioconjugación reduce la actividad citotóxica del complejo de Ir(III), lo que se relaciona con el menor grado de acumulación. Aunque ambos conjugados presentan actividades antiproliferativas similares, Ir-OCT es capaz de distinguir entre las líneas celulares HeLa (SSTR2 +) y MDA-MB-231 (SSTR2 −). Estos resultados, junto con la fototoxicidad (IC50 disminuye a la mitad tras irradiación con luz visible) y la entrada mediada por receptor podría utilizarse en el diseño de nuevos agentes teranósticos selectivos.

ABSTRACT The aim of this project has been the design of non-conventional metallodrugs of Pt(II), Ru(II) and Ir(III) with a dual or alternative mechanism of action as an option for the treatment of tumors resistant to the drug of reference, cisplatin. The work methodology is divided in four different steps. First of all, the design and synthesis of the compounds, which are characterized by mass spectrometry, elemental analysis, NMR spectroscopy and X-ray, takes place. Secondly, their stability in DMSO, pseudo-physiological condition and/or culture medium is studied by NMR or RP-HPLC. Next, their antitumor activity is evaluated in different human cancer cell lines; sensitive (A2780) and cisplatin resistant (A2780cisR) ovarian carcinoma cells are commonly employed. Finally, their mechanisms of action are verified to work with what the drug was designed for. Chapter 2 includes the optimization of monofunctional organometallics Pt(II) drugs based on arylmethanamines. First of all, and through a structure-activity relationship study of [Pt(C^N)LCl] (C^N = C,N-dimethylbenzylamine substituted in the R5 or R4 position of the phenyl ring with R = MeO, Me, H, Br, F, CF3, NO2; L  DMSO and P(C6H4CF3-p)3), the compounds of the type [Pt(dmba-R)(DMSO)Cl] were identified as the first Pt(II) complexes with a dual cytotoxic and anti-angiogenic activity. Following, the lipophilicity of these complexes was adjusted with the aim to potentiate the possible metallodrug-protein interaction implicated in their angiogenesis inhibition mechanism. To do so, the aromaticity of the C^N backbone (C^N = N,N-dimethyl-1-(2-aryl)methanamine-2C2,N; aryl = phenyl, biphenyl, p-terphenyl, naphthyl, anthracenyl, pyrenyl) was modified. This study shows a relationship between hydrophobicity and accumulation into cells with the anticancer activity; and that the most active compounds, biphenyl and naphthyl derivatives, act as vascular disrupting agents in vivo. On the other hand, the mechanism of action of the monofunctional precursors was modified by the introduction of diimine chelating ligands (N^N = bpy, phen, dpq, dppz, dppn) in the scaffold {Pt(dmba)}. Thus, a series of intercalator complexes were obtained, that were active towards five different cancer cell lines and able to suppress the tumor growth in 3D tumor spheroids with MCR index comparable to that of cisplatin. Additionally, the crystal structure of [Pt(dmba)(dppz)]NO3 reveals that the presence of the C,N-chelate ligand confers a λ/δ chirality at the Pt(II) center, which provides them an interesting selectivity for AT rich DNA sequences. Finally, the conjugation of the complex [Pt(dmba)(DMSO)Cl] to different biomolecules (c(RGDfK) peptide or esteroids) was studied with the aim to achieve a specific delivery and accumulation of the antitumor drug. While the peptide functionalization into the 4 position of the C^N ligand renders an inactive compound, the steroid conjugation (ethisterone or levonorgestrel) in the 7-azaindole auxiliary ligand in complexes of the type [Pt(dmba)Cl(L)] renders bioconjugates more active than cisplatin in the hormone sensible breast cancer cell line T47D. In Chapter 3, innovative strategies based on Ru(II) polypyridyl complexes have been studied. On one hand, the relevance of the geometry in the biological activity of Ru(II) complexes have been demonstrated. In contrast to the geometry requirements for Pt(II) drugs, the most active Ru(II) complexes are those with a trans geometry. This seems to be related with the deactivation of the cis isomer due to the reaction with media or non-essential biomolecules. On the other hand, pro-drugs of the type [Ru(bpy)2L2]2+, where L is cytochrome P450 inhibitor, were designed. The pro-drugs, inactive in the dark, act as a “drug cocktail” after its photoactivation with blue light. While L is liberated and serves in a controlled spatio-temporal fashion as a cytochrome P450 inhibitor, the insaturated metal center is able to damage DNA. In Chapter 4, a method for the conjugation in solid phase of the complex [Ir(ppz)2(N^N)]+ (N^N = metil 1-butil-2-piridil-benzimidazol-5-carboxilato) to a two somatostatin agonist peptides, octreotide or its dicarba analogue, is described. The bioconjugation reduces the cytotoxic activity of the Ir(III) complex, which is related with a lesser degree of accumulation. Although both conjugates display similar antiproliferative activities, Ir-OCT is able to distinguish between HeLa (SSTR2 +) and MDA-MB-231 (SSTR2 −) cell lines. These results, together with their phototoxicity (IC50 decreases 2 times after visible light irradiation) and receptor-mediated uptake could be used to design new selective theranostic agents.